核酸檢測(cè)在血液篩查中的應(yīng)用專家講座

核酸檢測(cè)在血液篩查中應(yīng)用深圳市血液中心核酸檢測(cè)在血液篩查中的應(yīng)用專家講座第1頁血液篩查是否需要進(jìn)行核酸檢測(cè)核酸檢測(cè)在血液篩查中的應(yīng)用專家講座第2頁無償獻(xiàn)血新動(dòng)態(tài)“定時(shí)無償獻(xiàn)血者是低危獻(xiàn)血者”，不過“以體檢為目標(biāo)定時(shí)無償獻(xiàn)血者是高危獻(xiàn)血者”而且這部分人群獻(xiàn)血隊(duì)伍正在擴(kuò)大。這部分人群窗口期機(jī)率高于其它人群。因?yàn)樵谒麄冎虚g高危傳輸行為經(jīng)常發(fā)生。經(jīng)過治療后HBsAg轉(zhuǎn)陰，ELISA方法檢測(cè)陰性獻(xiàn)血者。核酸檢測(cè)在血液篩查中的應(yīng)用專家講座第3頁NAT與ELISA互補(bǔ)病毒變異免疫靜默期試驗(yàn)操作失誤病毒感染窗口期核酸檢測(cè)在血液篩查中的應(yīng)用專家講座第4頁病毒檢測(cè)窗口期項(xiàng)目ELISA窗口期項(xiàng)目NAT窗口期HBsAg56HBV25抗-HCV72HCV59抗-HIV22HIV11核酸檢測(cè)在血液篩查中的應(yīng)用專家講座第5頁血篩用NAT試劑與臨床用不一樣核酸檢測(cè)在血液篩查中的應(yīng)用專家講座第6頁目標(biāo)和要求不一樣定性與定量臨床使用核酸檢測(cè)主要目標(biāo)是定量監(jiān)測(cè)，進(jìn)行療效分析。血篩用于病原體定性篩查靈敏度和特異性臨床在漏檢與誤差之間更重視誤差血液篩查用核酸目標(biāo)是確保用血安全，更重視漏檢質(zhì)控要求不一樣臨床用與血液篩查用質(zhì)控要求也不一樣。臨床試劑以定量準(zhǔn)確和預(yù)防誤報(bào)為質(zhì)控目標(biāo)血篩用以預(yù)防漏檢為主要目標(biāo)陽性率也不一樣臨床更多陽性；血篩更多是陰性對(duì)自動(dòng)化要求不一樣臨床更多用于病人,單人份檢測(cè),標(biāo)本量少血篩更多用于正常人，所以檢測(cè)量不一樣，對(duì)自動(dòng)化要求也不一樣核酸檢測(cè)在血液篩查中的應(yīng)用專家講座第7頁血篩用NAT平臺(tái)要求靈敏度HBV≤10IU/ml；HCV、HIV≤200IU/ml特異性核酸特異性高，幾乎沒有方法學(xué)假陽性但要預(yù)防污染內(nèi)標(biāo)（內(nèi)對(duì)照）為防止假陰性，要求每管陽性質(zhì)控自動(dòng)化大規(guī)模、高通量核酸檢測(cè)在血液篩查中的應(yīng)用專家講座第8頁關(guān)于靈敏度幾個(gè)問題廠家宣傳靈敏度均指單人份檢測(cè)，而非推薦pooling方案實(shí)測(cè)靈敏度實(shí)際應(yīng)用靈敏度=宣傳靈敏度×pooling數(shù)IU才有可比性：WHO標(biāo)準(zhǔn)品以及國家一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)品均以IU為單位HCV、HIV窗口期濃度高，所以對(duì)靈敏度要求較低。美國FDA要求，HCV、HIV5000IU/ml能在pooling方案中被檢出HBV窗口期標(biāo)本在30-300IU/ml之間，所以對(duì)靈敏度要求高低于靈敏度也有檢出可能，這與取樣幾率相關(guān)核酸檢測(cè)在血液篩查中的應(yīng)用專家講座第9頁血液篩查慣用NAT技術(shù)核酸檢測(cè)在血液篩查中的應(yīng)用專家講座第10頁核酸提取均使用磁珠法磁珠提取原理：將磁珠上標(biāo)識(shí)特異性吸附核酸物質(zhì)特異性吸附核酸，并經(jīng)過磁分離技術(shù)將病毒核酸從裂解液中提取出來步驟：裂解—吸附—洗滌—洗滌—洗滌—洗脫優(yōu)點(diǎn)：磁珠提取特異性高，受標(biāo)本原因影響小，靈敏度高易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化缺點(diǎn)：成本較高、并需要一定儀器(半自動(dòng)、全自動(dòng))。完全手工工作量太大核酸檢測(cè)在血液篩查中的應(yīng)用專家講座第11頁實(shí)時(shí)熒光定量

PCR技術(shù)原理

所謂實(shí)時(shí)熒光定量PCR就是經(jīng)過對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)產(chǎn)物熒光信號(hào)實(shí)時(shí)檢測(cè)從而實(shí)現(xiàn)對(duì)起始模板定量及定性分析。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)中,引入了一個(gè)熒光化學(xué)物質(zhì)，伴隨PCR反應(yīng)進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不停累計(jì)，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等百分比增加。每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)，搜集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào)，這么我們就能夠經(jīng)過熒光強(qiáng)度改變監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量改變，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。

核酸檢測(cè)在血液篩查中的應(yīng)用專家講座第12頁實(shí)時(shí)熒光優(yōu)點(diǎn)特異性好引物、探針雙重確保特異性方法學(xué)假陽性極少擴(kuò)增檢測(cè)同時(shí)進(jìn)行，速度快，且不對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行處理，不易污染熒光檢測(cè)靈敏度高羅氏第二代NAT試劑也是使用實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)核酸檢測(cè)在血液篩查中的應(yīng)用專家講座第13頁內(nèi)標(biāo)設(shè)計(jì)原理內(nèi)標(biāo)為一已知低含量與模板擴(kuò)增效率相同一段DNA片段，將它加入PCR反應(yīng)液中，與模板共同擴(kuò)增，以反應(yīng)每管真實(shí)擴(kuò)增情況，假如內(nèi)標(biāo)和樣品都未擴(kuò)增出結(jié)果，則表示該管擴(kuò)增無效，應(yīng)重新做。樣本內(nèi)標(biāo)核酸檢測(cè)在血液篩查中的應(yīng)用專家講座第14頁內(nèi)標(biāo)作用：防止假陰性內(nèi)標(biāo)種類：同源、異源內(nèi)標(biāo)作用：真實(shí)反應(yīng)擴(kuò)增效率防止假陰性：假陰性是當(dāng)前血液篩查中最重視問題之一，內(nèi)標(biāo)全程進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)控質(zhì)控核酸檢測(cè)在血液篩查中的應(yīng)用專家講座第15頁核酸檢測(cè)中碰到問題

與處理方案核酸檢測(cè)在血液篩查中的應(yīng)用專家講座第16頁人員素質(zhì)和清潔很主要血篩用NAT對(duì)低濃度要求太高，高靈敏度試劑操作對(duì)人員要求高，一樣平臺(tái)不一樣試驗(yàn)員有很大差距。平臺(tái)建立早期會(huì)有較大問題對(duì)人員素質(zhì)要求與自動(dòng)化程度成反比試驗(yàn)室及儀器清潔很主要因?yàn)樯儆懈邼舛葮?biāo)本，所以大面積污染不易發(fā)生。但因?yàn)樵噭╈`敏度高，如不隨時(shí)注意清潔，污染有積累效應(yīng)，會(huì)出現(xiàn)散發(fā)性樣本污染，引發(fā)假陽性核酸檢測(cè)在血液篩查中的應(yīng)用專家講座第17頁采血樣管處理玻璃器皿在使用前應(yīng)高壓處理，因?yàn)椴Ａ髅蟪：胁灰资Щ頡NA酶。最好是熱滅菌，250℃烘烤4小時(shí)以上可使RNA酶永久性失活。異硫氰酸胍鹽(Guanidinethiocyanate,GITC)可使DNA酶和RNA酶馬上失活。核酸檢測(cè)在血液篩查中的應(yīng)用專家講座第18頁標(biāo)本聚集利用STAR工作平臺(tái),編制聚集軟件。合理Pooling方案核酸檢測(cè)在血液篩查中的應(yīng)用專家講座第19頁P(yáng)ooling方案靈敏度原因檢出血液中最低病毒含量與標(biāo)本聚集數(shù)量呈正比成本原因試劑價(jià)格以test為單位，檢測(cè)單位成本與pooling方案相關(guān)檢測(cè)標(biāo)本量及檢測(cè)時(shí)間原因擴(kuò)增檢測(cè)量=提取量×3(HBV、HIV、HCV)與儀器親密相關(guān)核酸檢測(cè)在血液篩查中的應(yīng)用專家講座第20頁影響靈敏度原因Pooling方案內(nèi)標(biāo)濃度標(biāo)本加樣量磁珠量和混勻模板制作過程損失和提取量核酸檢測(cè)在血液篩查中的應(yīng)用專家講座第21頁批質(zhì)控選取及設(shè)定使用低濃度樣本為批陽性質(zhì)控因?yàn)橛袃?nèi)標(biāo)進(jìn)行每管陽性質(zhì)控，所以批陽性質(zhì)控主要目標(biāo)是監(jiān)控試驗(yàn)細(xì)微系統(tǒng)誤差。所以陽性質(zhì)控濃度選擇要低過低質(zhì)控會(huì)影響工作，所以不宜使用最低靈敏度濃度提議靈敏度3-5倍很好多陽性和陰性質(zhì)控不宜固定位置，最好隨機(jī)分布因?yàn)橛袃?nèi)標(biāo)，多陽性質(zhì)控偶有個(gè)別出現(xiàn)問題，試驗(yàn)結(jié)果也有確保核酸檢測(cè)在血液篩查中的應(yīng)用專家講座第22頁內(nèi)標(biāo)與結(jié)果判定內(nèi)對(duì)照（IC）使質(zhì)控成為每管質(zhì)控使用雙免熒光，確保內(nèi)對(duì)照和樣本反應(yīng)條件絕對(duì)一致競(jìng)爭(zhēng)性設(shè)計(jì)，確保受影響原因一致結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：樣本檢測(cè)陽性，無診IC情況均報(bào)陽性樣本檢測(cè)陰性：內(nèi)對(duì)照陽性，能夠報(bào)陰性結(jié)果內(nèi)對(duì)照陰性，需要復(fù)檢經(jīng)過軟件自動(dòng)判斷，但提議要人工復(fù)核核酸檢測(cè)在血液篩查中的應(yīng)用專家講座第23頁核酸試驗(yàn)室管理軟件在試驗(yàn)室管理軟件基礎(chǔ)上增加核酸檢測(cè)管理模塊，實(shí)現(xiàn)計(jì)算機(jī)管理,檢驗(yàn)結(jié)果自動(dòng)控制。核酸檢測(cè)在血液篩查中的應(yīng)用專家講座第24頁NAT與ELISA檢測(cè)配合

1同時(shí)檢測(cè)2先做常規(guī)檢測(cè)，再做核酸檢測(cè)核酸檢測(cè)在血液篩查中的應(yīng)用專家講座第25頁自動(dòng)化要求確保質(zhì)量核酸檢測(cè)對(duì)技術(shù)要求高，尤其是血篩用對(duì)靈敏度要求更高，所以自動(dòng)化確保質(zhì)量連續(xù)性進(jìn)入計(jì)算機(jī)管理系統(tǒng)因?yàn)闃?biāo)本多，還要進(jìn)行pooling。為便于管理，降低人為錯(cuò)誤，最好使用全自開工作站，這么POOLING號(hào)、標(biāo)本號(hào)都統(tǒng)一自動(dòng)統(tǒng)計(jì)，不易搞錯(cuò)提升工作效率降低工作強(qiáng)度,縮短試驗(yàn)時(shí)間核酸檢測(cè)在血液篩查中的應(yīng)用專家講座第26頁自動(dòng)化進(jìn)程手工提取半自動(dòng)提取全自動(dòng)提取工作站式自動(dòng)提取核酸檢測(cè)在血液篩查中的應(yīng)用專家講座第27頁今后面臨問題核酸檢測(cè)在血液篩查中的應(yīng)用專家講座第28頁降低檢測(cè)成本試驗(yàn)室建設(shè)成本人員成本管理成本設(shè)備成本(各廠家設(shè)備是否兼容，兼容性強(qiáng)設(shè)備、試劑銷路好)試劑成本質(zhì)量成本核酸檢測(cè)在血液篩查中的應(yīng)用專家講座第29頁合理地進(jìn)行集中化檢測(cè)提升檢測(cè)質(zhì)量降低檢測(cè)成本集中區(qū)域要考慮標(biāo)本運(yùn)輸時(shí)間。核酸檢測(cè)在血液篩查中的應(yīng)用專家講座第30頁標(biāo)本處理標(biāo)本留樣和處理：也是核酸檢測(cè)質(zhì)量控制體系中主要步驟，不然在檢測(cè)之前病毒核酸已降解，造成假陰性檢測(cè)結(jié)果?！杜R床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)試驗(yàn)室工作規(guī)范》臨床用于RNA(如HCVRNA)擴(kuò)增檢測(cè)血標(biāo)本提議進(jìn)行抗凝處理，并盡快(3小時(shí)以內(nèi))分離血漿，以防止RNA降解。如未作抗凝處理，則抽血后必須在1小時(shí)內(nèi)分離血清?！度珖滩z測(cè)技術(shù)規(guī)范》用于核酸定性檢測(cè)時(shí)，采集抗凝全血應(yīng)在48h內(nèi)分離PBMC和血漿，不然應(yīng)在2448h內(nèi)分離血漿和血細(xì)胞。核酸檢測(cè)在血液篩查中的應(yīng)用專家講座第31頁試劑穩(wěn)定性試劑靈敏度試劑內(nèi)標(biāo)最正確標(biāo)準(zhǔn)試劑