免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的基本原理

免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的基本原理免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的基本原理第1頁(yè)第一節(jié)基于抗原-抗體反應(yīng)檢測(cè)方法第二節(jié)免疫細(xì)胞檢測(cè)第三節(jié)分子生物學(xué)技術(shù)在免疫學(xué)上應(yīng)用本章內(nèi)容免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的基本原理第2頁(yè)第一節(jié)基于抗原-抗體反應(yīng)檢測(cè)方法一、抗原抗體反應(yīng)概念抗原與對(duì)應(yīng)抗體在體內(nèi)、外發(fā)生高度特異性結(jié)合反應(yīng)。在適當(dāng)條件下所進(jìn)行體外反應(yīng)中，抗原與對(duì)應(yīng)抗體特異性結(jié)合可展現(xiàn)某種反應(yīng)現(xiàn)象（如凝集、沉淀）。因?yàn)樵囼?yàn)所用抗體存在于血清中，故又稱血清學(xué)反應(yīng)。免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的基本原理第3頁(yè)二、抗原抗體反應(yīng)特點(diǎn)高度特異性可準(zhǔn)確區(qū)分物質(zhì)間極微細(xì)差異。表示為親和力：一個(gè)抗原表位與對(duì)應(yīng)抗體單一抗原結(jié)合位點(diǎn)間結(jié)合能力。親協(xié)力：指一個(gè)抗體分子與整個(gè)抗原大分子間結(jié)合強(qiáng)度，與抗原表位數(shù)目相關(guān)。免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的基本原理第4頁(yè)2.抗原抗體結(jié)合帶現(xiàn)象與可見(jiàn)性抗原抗體結(jié)合存在帶現(xiàn)象（前帶、等帶、后帶），適宜抗原抗體濃度和百分比（等帶）決定抗原抗體結(jié)合后能否出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)反應(yīng)；免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的基本原理第5頁(yè)3.表面化學(xué)基團(tuán)之間可逆結(jié)合抗原抗體結(jié)合除了空間結(jié)構(gòu)互補(bǔ)外，主要以氫鍵、范德華力和疏水鍵等非共價(jià)結(jié)合。易受溫度、酸堿度和離子強(qiáng)度影響而解離，解離后抗原抗體仍含有原有特征，可借助親和層析法純化抗原或抗體?？乖贵w反應(yīng)2個(gè)階段第1階段是抗原抗體特異性結(jié)合，可在數(shù)秒鐘至幾分鐘內(nèi)完成；第2階段是小抗原抗體復(fù)合物靠正負(fù)電荷吸引形成較大復(fù)合物，所需時(shí)間從數(shù)分鐘至數(shù)日不等。免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的基本原理第6頁(yè)三、抗原抗體反應(yīng)影響原因電解質(zhì)抗原抗體等電點(diǎn)分別為pH3-5和pH5-6，在中性或弱堿性條件下表面帶有較多負(fù)電荷，適當(dāng)濃度電解質(zhì)會(huì)使它們失去一個(gè)別負(fù)電荷而相互結(jié)合；溫度通常為37℃，適當(dāng)提升反應(yīng)溫度可增加抗原與抗體分子碰撞機(jī)會(huì)，但56℃以上可使抗原或抗體變性失活；酸堿度抗原抗體反應(yīng)最適pH值在6-8之間，pH值過(guò)高或過(guò)低均可直接影響抗原抗體理化性質(zhì)。當(dāng)pH值靠近等電點(diǎn)時(shí)，抗原抗體多帶正負(fù)電荷相等，因?yàn)楸旧砦霈F(xiàn)凝集，造成非特異性反應(yīng)。免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的基本原理第7頁(yè)四、抗原抗體反應(yīng)檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用抗原與對(duì)應(yīng)抗體在體內(nèi)、外發(fā)生高度特異性結(jié)合反應(yīng)。在適當(dāng)條件下所進(jìn)行體外反應(yīng)中，抗原與對(duì)應(yīng)抗體特異性結(jié)合可展現(xiàn)某種反應(yīng)現(xiàn)象（如凝集、沉淀）。因?yàn)樵囼?yàn)所用抗體存在于血清中，故又稱血清學(xué)反應(yīng)。免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的基本原理第8頁(yè)抗原抗體反應(yīng)凝集反應(yīng)直接凝集間接凝集沉淀反應(yīng)免疫比濁單向免疫擴(kuò)散雙向免疫擴(kuò)散免疫電泳蛋白芯片技術(shù)免疫標(biāo)記熒光酶同位素化學(xué)發(fā)光膠體金免疫印跡五、抗原-抗體反應(yīng)基礎(chǔ)檢測(cè)方法免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的基本原理第9頁(yè)AbAg高親和力AbAg低親和力特異性結(jié)協(xié)力表示方法親和力和親協(xié)力低親協(xié)力高親協(xié)力Ag-Ab反應(yīng)原理免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的基本原理第10頁(yè)Ab過(guò)剩Ag過(guò)剩百分比適當(dāng)，交聯(lián)成網(wǎng)絡(luò)Ag-Ab反應(yīng)可見(jiàn)性免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的基本原理第11頁(yè)1.凝集反應(yīng)直接凝集反應(yīng)1:2稀釋待測(cè)血清1:41:81:16細(xì)菌、細(xì)胞等顆粒性Ag或表面包被抗原顆粒狀物質(zhì)與對(duì)應(yīng)Ab在電解質(zhì)存在情況下直接反應(yīng)，二者百分比適當(dāng)時(shí)，出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)凝集團(tuán)現(xiàn)象。玻片法試管法常見(jiàn)于菌種判定或ABO血型判定選擇最正確稀釋濃度，常見(jiàn)于檢測(cè)抗體滴度或效價(jià)，見(jiàn)于臨床診療傷寒或副傷寒所用肥達(dá)氏反應(yīng)和診療布氏菌病所用瑞特試驗(yàn)。免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的基本原理第12頁(yè)間接凝集反應(yīng)將可溶性Ag/Ab先吸附在一些顆粒載體上，形成致敏顆粒，然后再與對(duì)應(yīng)Ab/Ag進(jìn)行反應(yīng)產(chǎn)生凝集，叫間接凝集反應(yīng)。如將溶血毒素O吸附于乳膠顆粒上抗“O”試驗(yàn)、人IgG作為Ag吸附于乳膠顆粒上類風(fēng)濕因子檢測(cè)。凝集反應(yīng)常見(jiàn)于溶血性疾病診療：+YYYYYYYYYYYY病人RBC體內(nèi)anti-Rh因?yàn)榭贵w多屬于IgG，分子量較小，抗體與紅細(xì)胞間結(jié)協(xié)力不能克服細(xì)胞間排斥力，不出現(xiàn)凝集+YYYYYYYYYYYYYYY體外加入抗人IgG出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，叫直接庫(kù)姆試驗(yàn)正常人O型血Rh+RBC+YYYY患者血清內(nèi)游離anti-Rh+Y體外加入抗人IgGYYYYYYYYYYYYYY出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，叫間接庫(kù)姆試驗(yàn)免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的基本原理第13頁(yè)2.沉淀反應(yīng)AgAgAgAgAbingel單向免疫擴(kuò)散Ag1AbAg2Ag3Ag4雙向免疫擴(kuò)散免疫比濁過(guò)量AbAbAbAb毒素、組織浸液及血清中蛋白等可溶性抗原與對(duì)應(yīng)抗體反應(yīng)后，出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)沉淀物，稱為沉淀反應(yīng)。沉淀反應(yīng)可在液體中進(jìn)行，也可在半固體瓊脂凝膠中進(jìn)行。判定各種抗原是完全相同、個(gè)別相同或完全不一樣用于確定抗原濃度免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的基本原理第14頁(yè)沉淀反應(yīng)—免疫電泳存在于不一樣區(qū)域抗原與抗體結(jié)合，在百分比適宜處形成沉淀弧。沉淀弧數(shù)量、位置和形狀與標(biāo)準(zhǔn)品相對(duì)比，可分析樣品成份及其性質(zhì)。免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的基本原理第15頁(yè)3.免疫標(biāo)識(shí)技術(shù)免疫酶測(cè)定法免疫熒光技術(shù)放射免疫測(cè)定法免疫膠體金技術(shù)免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的基本原理第16頁(yè)①免疫酶測(cè)定法夾心法ELISA間接ELISABAS—ELISA利用生物素和抗生物素蛋白為橋梁微粒捕捉酶免疫分析技術(shù)將已知特異性抗體致敏免疫微粒與生物素、親和素、酶相結(jié)合，最終酶作用于熒光底物發(fā)光，經(jīng)過(guò)檢測(cè)熒光強(qiáng)度判斷未知抗原含量。a）b）免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的基本原理第17頁(yè)免疫組化技術(shù)定位、定性、定量檢測(cè)免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的基本原理第18頁(yè)②免疫熒光技術(shù)免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的基本原理第19頁(yè)③放射免疫測(cè)定用放射性核素標(biāo)識(shí)抗原或抗體進(jìn)行免疫測(cè)定。將同位素敏感性與抗原抗體結(jié)合特異性結(jié)合起來(lái)，含有重復(fù)性好、準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于激素、藥品等微量物質(zhì)檢測(cè)。常見(jiàn)有131I、125I。④化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)將化學(xué)發(fā)光分析和免疫反應(yīng)相結(jié)合而建立一個(gè)新免疫分析技術(shù)。最常見(jiàn)發(fā)光物質(zhì)是魯米諾。靈敏度高、簡(jiǎn)便、可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化分析。免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的基本原理第20頁(yè)⑤免疫膠體金技術(shù)用膠體金顆粒標(biāo)識(shí)Ab/Ag，以檢測(cè)未知Ag/Ab方法。氯金酸在還原劑作用下，可聚合成特定大小金顆粒，形成帶負(fù)電疏水膠溶液，因靜電作用而呈穩(wěn)定膠體狀態(tài)。該技術(shù)可應(yīng)用于免疫組化(光鏡下檢驗(yàn))和免疫層析快速診療。免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的基本原理第21頁(yè)⑥免疫印跡法-Westernblotting免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的基本原理第22頁(yè)4.蛋白質(zhì)芯片技術(shù)又稱為蛋白質(zhì)微列陣，指固定于支持介質(zhì)上大量蛋白質(zhì)組成微列陣。依據(jù)蛋白質(zhì)分子間特異性結(jié)合原理，可實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確、高通量檢測(cè)。免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的基本原理第23頁(yè)第二節(jié)免疫細(xì)胞檢測(cè)淋巴細(xì)胞及其亞群分離免疫細(xì)胞功效測(cè)定磁珠分離法免疫吸附分離法流式細(xì)胞術(shù)肽—MHC四聚體技術(shù)T細(xì)胞功效測(cè)定B細(xì)胞功效測(cè)定細(xì)胞因子檢測(cè)T細(xì)胞增殖試驗(yàn)遲發(fā)型超敏反應(yīng)檢測(cè)抗體含量測(cè)定溶血空斑試驗(yàn)巨噬細(xì)胞吞噬試驗(yàn)細(xì)胞毒試驗(yàn)吞噬功效測(cè)定51Cr釋放法乳酸脫氫酶釋放法細(xì)胞染色法凋亡細(xì)胞檢測(cè)法硝基藍(lán)四氮唑試驗(yàn)生物活性檢測(cè)法免疫學(xué)檢測(cè)法免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的基本原理第24頁(yè)一、免疫細(xì)胞及其亞類計(jì)數(shù)稀釋血液淋巴細(xì)胞分離液(葡聚糖-泛影葡胺r=1.078)離心單個(gè)核細(xì)胞(PBMC，包含淋巴細(xì)胞、DC和NK)紅細(xì)胞和粒細(xì)胞血漿外周血單個(gè)核細(xì)胞分離免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的基本原理第25頁(yè)外周血單個(gè)核細(xì)胞分離稀釋血液淋巴細(xì)胞分離液(葡聚糖-泛影葡胺r=1.078)離心單個(gè)核細(xì)胞(PBMC，包含淋巴細(xì)胞、DC和NK)紅細(xì)胞和粒細(xì)胞血漿免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的基本原理第26頁(yè)磁珠分離法免疫吸附分離法流式細(xì)胞術(shù)肽—MHC四聚體技術(shù)淋巴細(xì)胞及其亞群分離免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的基本原理第27頁(yè)免疫吸附分離法加入淋巴細(xì)胞懸液anti-CD4anti-CD4anti-CD4棄上清免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的基本原理第28頁(yè)磁珠分離法免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的基本原理第29頁(yè)流式細(xì)胞術(shù)熒光抗體標(biāo)識(shí)混合細(xì)胞噴嘴單細(xì)胞懸液5000-10000個(gè)/秒細(xì)胞分選器熒光檢測(cè)器免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的基本原理第30頁(yè)抗原肽-MHC四聚體分離技術(shù)親和素抗原肽MHCI生物素anti-CD8肽-四聚體肽特異性CD8TCD4T及B非肽特異性CD8T熒光素免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的基本原理第31頁(yè)二、免疫細(xì)胞功效測(cè)定T細(xì)胞功效測(cè)定B細(xì)胞功效測(cè)定細(xì)胞因子檢測(cè)T細(xì)胞增殖試驗(yàn)遲發(fā)型超敏反應(yīng)檢測(cè)抗體含量測(cè)定溶血空斑試驗(yàn)巨噬細(xì)胞吞噬試驗(yàn)細(xì)胞毒試驗(yàn)吞噬功效測(cè)定51Cr釋放法乳酸脫氫酶釋放法細(xì)胞染色法凋亡細(xì)胞檢測(cè)法硝基藍(lán)四氮唑試驗(yàn)生物活性檢測(cè)法免疫學(xué)檢測(cè)法免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的基本原理第32頁(yè)T細(xì)胞功效測(cè)定T細(xì)胞增殖試驗(yàn)遲發(fā)型超敏反應(yīng)檢測(cè)T細(xì)胞受到特異性抗原或有絲分裂原刺激后發(fā)生增殖，可經(jīng)過(guò)以下三種方法檢測(cè)：形態(tài)計(jì)數(shù)法：活化細(xì)胞體積增大、形態(tài)不規(guī)則、胞質(zhì)增多、細(xì)胞核渙散及出現(xiàn)較多核仁；3H-TdR或125I-UdR摻入法：3H-TdR能摻入到合成DNA中，用液體閃爍儀檢測(cè)樣品放射活性，特點(diǎn)是靈敏可靠，但須特殊儀器，易有放射性污染。MTT(四甲基偶氮唑鹽)比色法：外來(lái)抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答后，再用相同抗原作皮試，可造成遲發(fā)型超敏反應(yīng)，T細(xì)胞活化并釋放各種細(xì)胞因子，產(chǎn)生以單個(gè)核細(xì)胞浸潤(rùn)為主炎癥，局部發(fā)生充血滲出，24-48h發(fā)生，72h抵達(dá)高峰。陽(yáng)性反應(yīng)表現(xiàn)為局部紅腫和硬結(jié)，反應(yīng)強(qiáng)烈發(fā)生水腫甚至壞死。細(xì)胞免疫正常者出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，細(xì)胞免疫低下者呈弱陽(yáng)性或陰性反應(yīng)。常見(jiàn)于檢測(cè)一些微生物感染。免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的基本原理第33頁(yè)B細(xì)胞功效測(cè)定抗體含量測(cè)定溶血空斑試驗(yàn)可經(jīng)過(guò)單項(xiàng)瓊脂擴(kuò)散法、ELISA、速率比濁法等測(cè)定標(biāo)本中各類Ig含量。綿羊紅細(xì)胞(SRBC)免疫動(dòng)物4天后取出動(dòng)物脾臟，在脾細(xì)胞懸液中含有抗SRBC漿細(xì)胞脾細(xì)胞與SRBC在適量瓊脂糖液中混勻在抗體形成細(xì)胞周圍出現(xiàn)溶解透明區(qū)，即溶血空斑。1個(gè)空斑區(qū)代表1個(gè)漿細(xì)胞經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)溶血空斑數(shù)目可知抗原特異性B細(xì)胞數(shù)目加入新鮮補(bǔ)體，倒入平皿中培養(yǎng)免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的基本原理第34頁(yè)細(xì)胞毒試驗(yàn)51Cr釋放法乳酸脫氫酶釋放法細(xì)胞染色法靶細(xì)胞被殺傷后，向體系中加入臺(tái)盼蘭，可進(jìn)入膜破損細(xì)胞內(nèi)，將細(xì)胞染成藍(lán)色?；罴?xì)胞拒染而不著色。免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的基本原理第35頁(yè)凋亡細(xì)胞檢測(cè)法瓊脂糖電泳法正常細(xì)胞基因組DNA凋亡細(xì)胞TUNEL法在細(xì)胞中加入末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)和生物素標(biāo)識(shí)核苷酸TdT能在游離DNA3’端缺口連接標(biāo)識(shí)核苷酸加入親和素-酶復(fù)合物，在DNA斷裂處顯色流式細(xì)胞術(shù)AnnexinVPI凋亡早期凋亡晚期壞死期免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的基本原理第36頁(yè)巨噬細(xì)胞吞噬試驗(yàn)吞噬功效測(cè)定硝基藍(lán)四氮唑(NBT)試驗(yàn)NBT在殺菌過(guò)程中產(chǎn)生反應(yīng)性氧中間物，其中超氧陰離子能使被吞噬進(jìn)細(xì)胞內(nèi)NBT還原成不溶性藍(lán)黑色甲臜顆粒，沉積于胞漿中。光鏡下計(jì)數(shù)NBT陽(yáng)性細(xì)胞可反應(yīng)PMN殺傷功效。將待測(cè)mf與雞紅細(xì)胞混合溫育后，雞紅細(xì)胞被mf吞噬，依據(jù)吞噬百分率確定mf吞噬能力。吞噬百分率=吞有紅細(xì)胞mf/mf總數(shù)免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的基本原理第37頁(yè)細(xì)胞因子檢測(cè)生物活性檢測(cè)法免疫學(xué)檢測(cè)法夾心ELISA或ELISPOT熒光素標(biāo)識(shí)抗體染胞內(nèi)細(xì)胞因子，F(xiàn)ACS分析細(xì)胞增殖或增殖抑制法，如細(xì)胞因子依賴性或抑制性細(xì)胞株細(xì)胞病變抑制法，如感干擾素抑制病毒感染性細(xì)胞損傷免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的基本原理第38頁(yè)檢測(cè)B細(xì)胞產(chǎn)生抗體檢測(cè)T細(xì)胞產(chǎn)生CK酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)-ELISpot

免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的基本原理第39頁(yè)對(duì)血細(xì)胞惡性變?nèi)绨籽?、淋巴瘤等診療，長(zhǎng)久以來(lái)多應(yīng)用細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)和免疫細(xì)胞表型分析。因?yàn)檫@些方法在特異性和敏感性上限制，對(duì)于丟失了細(xì)胞表面標(biāo)志，或分化很好難以和正常細(xì)胞區(qū)分。也可能因?yàn)閻盒约?xì)胞數(shù)量少，混在大量正常細(xì)胞中難以查出。第三節(jié)分子生物學(xué)技術(shù)在免疫學(xué)上應(yīng)用免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的基本原理第40頁(yè)一、BCR和TCR基因重排檢測(cè)

利用分子生物學(xué)，取得Ig片段特異基因克隆及TCR各鏈基因克隆，分別應(yīng)用Ig基因和TCR基因重排作為B細(xì)胞和T細(xì)胞特異標(biāo)識(shí)，分別診療B細(xì)胞起