基因診療和基因治療專家講座

基因診療與基因治療

GeneDiagnosisandGeneTherapy高穎生化教研室基因診療和基因治療專家講座第1頁基因診療用分子生物學(xué)技術(shù)對生物體DNA序列及其產(chǎn)物（RNA和蛋白質(zhì)）進(jìn)行定性、定量分析，為疾病診療提供依據(jù)?；蛟\療前提已明確疾病表型與基因型關(guān)系

基因診療和基因治療專家講座第2頁基因診療包含定性和定量分析DNA、RNA或蛋白質(zhì)水平改變，如病毒基因及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在體內(nèi)從無到有、癌基因表示水平從低到高；基因結(jié)構(gòu)改變，如點(diǎn)突變引發(fā)基因失活、染色體轉(zhuǎn)位引發(fā)基因異常激活或滅活?；蛟\療和基因治療專家講座第3頁基因診療特點(diǎn)高特異性高靈敏性早期診療性應(yīng)用廣泛性基因診療和基因治療專家講座第4頁基因診療基本技術(shù)流程樣品抽提DNARNAcDNAPCR擴(kuò)增分子雜交反轉(zhuǎn)錄合成寡核苷酸引物制備和標(biāo)識(shí)探針雜交信號(hào)檢測基因診療和基因治療專家講座第5頁基因診療中慣用分子生物學(xué)技術(shù)核酸分子雜交（Nucleicacidhybridization）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)

單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）

限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）DNA序列測定（DNA

sequencing）生物芯片（biochips）Western免疫印跡（Westernblotting）免疫組織化學(xué)診療基因診療和基因治療專家講座第6頁P(yáng)CR在基因診療中應(yīng)用RT-PCR熒光定量PCR多重-PCRPCR-ASO（等位基因特異性寡核苷酸探針法）PCR-SSCP（單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析）PCR-RFLP（限制性片段長度多態(tài)性分析）基因診療和基因治療專家講座第7頁

多重PCR多重PCR示意圖A：普通PCR；B：多重PCR基因診療和基因治療專家講座第8頁P(yáng)CR-ASO(等位基因特異性寡核苷酸探針法）N：正?；颍籋：雜合子基因；M：突變基因ASO1ASO2NHM基因診療和基因治療專家講座第9頁單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析

（single-strandconformationpolymorphism,SSCP）

DNA突變造成DNA片段中堿基序列不一樣，變性為單鏈后在中性聚丙烯酰胺凝膠中構(gòu)象不一樣（單鏈構(gòu)象多態(tài)性），利用遷移率差異可使各種序列不一樣單鏈分離開來?；蛟\療和基因治療專家講座第10頁P(yáng)CR-SSCP分析原理示意基因診療和基因治療專家講座第11頁

限制性片段長度多態(tài)性分析

（restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP）

因?yàn)镈NA變異產(chǎn)生新酶切位點(diǎn)或原有酶切位點(diǎn)消失，在用限制性核酸內(nèi)切酶消化時(shí)產(chǎn)生不一樣長度或不一樣數(shù)量片段。

可借助核酸分子雜交或PCR進(jìn)行檢測?；蛟\療和基因治療專家講座第12頁ABCDEFG－＋DEFBGCAGAATTCCTTAAGEFBG－＋C+DAEcoRⅠ限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)改變基因診療和基因治療專家講座第13頁左側(cè)：正常；右側(cè)突變序列分析用于基因診療研究基因診療和基因治療專家講座第14頁生物芯片（biochips）基因芯片（genechips）蛋白質(zhì)芯片(proteinchip)

基因診療和基因治療專家講座第15頁基因診療中慣用分子生物學(xué)方法比較

方法

優(yōu)點(diǎn)與問題處理方案核酸分子雜交結(jié)果可靠但操作繁瑣選擇適當(dāng)探針PCR靈敏度、特異性高設(shè)計(jì)適當(dāng)引物SSCP操作簡便、檢出率不高選擇適當(dāng)片段RFLP結(jié)果可靠但限制較多選擇適當(dāng)限制酶DNA測序可自動(dòng)化，但不宜廣泛使用與PCR配合使用生物芯片效率高，成本高，不宜廣泛使用選擇適當(dāng)芯片基因診療和基因治療專家講座第16頁

遺傳病基因診療

GeneDiagnosisofHereditaryDiseases基因診療和基因治療專家講座第17頁（一）鐮狀細(xì)胞貧血病一、血紅蛋白病1.鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因診療-

ASO雜交法

2.HBS限制性內(nèi)切酶譜分析

3.HBSPCR-RFLP分析

基因診療和基因治療專家講座第18頁正常（N）ASO探針：5′-ACTCCTGAGGAGAAGTCTGC-3′

突變（M）ASO探針：5′-ACTCCTGTGGAGGAAGTCTGC-3′1.鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因診療

ASO雜交法基因診療和基因治療專家講座第19頁斑點(diǎn)雜交結(jié)果N：正常；M突變鐮狀紅細(xì)胞貧血患者ASO雜交法檢測N-ASOM-ASO正常突變突變

純合子雜合子純合子基因診療和基因治療專家講座第20頁5′3′正常基因1.15kb(CCTGAGG)×5′3′突變基因1.35kb(CCTGTGG)鐮狀紅細(xì)胞貧病限制性內(nèi)切酶譜分析MstⅡ酶切位點(diǎn)（CCTNAGG）2.HBS限制性內(nèi)切酶譜分析目錄基因診療和基因治療專家講座第21頁0.2kb1.15kb1.35kb正常人突變攜帶者患者鐮狀紅細(xì)胞貧血病限制性內(nèi)切酶譜分析目錄基因診療和基因治療專家講座第22頁3.HBSPCR-RFLP分析

正常人擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)MstⅡ消化可生成54bp和56bp兩個(gè)片段，而鐮狀細(xì)胞貧血癥患者DNA片段不被酶切，仍為110bp，雜合子可見三條帶正常人雜合體患者M(jìn)arker基因診療和基因治療專家講座第23頁

傳染病基因診療

GeneDiagnosisofInfectious

Diseases基因診療和基因治療專家講座第24頁

一、病毒性疾病甲型肝炎病毒（HAV）

HAV系RNA病毒，利用RT-PCR技術(shù)可從糞便中檢測出甲型肝炎病毒基因組RNA。

乙型肝炎病毒（HBV）設(shè)計(jì)保守區(qū)序列引物，擴(kuò)增各型HBVDNA片段；設(shè)計(jì)位于可變區(qū)引物擴(kuò)增某一亞型HBVDNA，方便分型。丙型肝炎病毒（HCV）

HCV為正鏈RNA病毒，先反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再進(jìn)行巢式PCR檢測HCV。

基因診療和基因治療專家講座第25頁二、細(xì)菌引發(fā)疾病結(jié)核分枝桿菌

先設(shè)計(jì)一對特異性引物，用PCR技術(shù)擴(kuò)增出一383bp序列，再用探針雜交，靈敏度可到達(dá)100個(gè)細(xì)菌水平。幽門螺桿菌（HP）主要采取PCR技術(shù)：①檢測HP染色體DNA特異片段；②檢測HP尿素酶A基因；③用PCR-RFLP判別HP菌株?；蛟\療和基因治療專家講座第26頁腫瘤基因診療

GeneDiagnosisofMalignantTumors基因診療和基因治療專家講座第27頁一、原癌基因與抑癌基因檢測二、常見腫瘤基因診療

乳腺癌結(jié)腸癌基因診療和基因治療專家講座第28頁一、原癌基因與抑癌基因檢測1．原癌基因檢測

ras

基因家族由H-ras、K-ras和N-ras組成。最常見突變是第12、13、59或第61位密碼子點(diǎn)突變。胰腺癌、結(jié)腸癌、肺癌以K-ras突變?yōu)橹?，如?2位密碼子突變，由編碼甘氨酸GGT突變?yōu)門GT、GTT或GAT，少數(shù)突變?yōu)镚CT。急性淋巴細(xì)胞白血病，慢性淋巴細(xì)胞白血病等以N-ras突變?yōu)橹鳎幻谀蛳到y(tǒng)腫瘤則以H-ras突變?yōu)橹??；蛟\療和基因治療專家講座第29頁

PCR及PCR-SSCP分析：擴(kuò)增ras基因第12位密碼子點(diǎn)突變部位，再用SSCP技術(shù)進(jìn)行分析，或者直接測序確定患者ras原癌基因點(diǎn)突變。

核苷酸雜交技術(shù)（如ASO）：檢測ras基因第12位密碼子點(diǎn)突變。2.ras原癌基因突變慣用檢測方法基因診療和基因治療專家講座第30頁3．抑癌基因p53檢測

p53基因以密碼子第175位、第248位、第249位、第273位及第282位點(diǎn)突變率最高。在結(jié)直腸癌、乳腺癌、小細(xì)胞肺癌，都可見異常p53基因蛋白。p53基因診療方法有（1）PCR-SSCP分析技術(shù)（2）DNA序列分析（3）PCR-RFLP分析基因診療和基因治療專家講座第31頁基因治療

GeneTherapy基因診療和基因治療專家講座第32頁

基因治療指將目標(biāo)基因經(jīng)過基因轉(zhuǎn)移技術(shù)（病毒載體介導(dǎo)或者非病毒載體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移技術(shù)）導(dǎo)入靶細(xì)胞內(nèi)，目標(biāo)基因表示產(chǎn)物對疾病起治療作用。

基因診療和基因治療專家講座第33頁基因治療分類體細(xì)胞(somaticcell)基因治療生殖細(xì)胞(germline)基因治療只限于某一體細(xì)胞基因改變只限于某個(gè)體當(dāng)代對缺點(diǎn)生殖細(xì)胞進(jìn)行矯正當(dāng)代及子代基因診療和基因治療專家講座第34頁

一、基因治療策略基因診療和基因治療專家講座第35頁

（一）基因置換（genereplacement）

定義：指將特定目標(biāo)基因?qū)胩囟?xì)胞，經(jīng)過定位重組，導(dǎo)入正常基因，以置換基因組內(nèi)原有缺點(diǎn)基因。

目標(biāo)：將缺點(diǎn)基因異常序列進(jìn)行橋正。對缺點(diǎn)基因缺點(diǎn)部位進(jìn)行準(zhǔn)確原位修復(fù)，不包括基因組任何改變。基因診療和基因治療專家講座第36頁轉(zhuǎn)導(dǎo)基因載體與基因組DNA含有相同序列。帶有目標(biāo)基因載體就能找到同源重組位點(diǎn)，進(jìn)行部分基因序列交換。基因同源重組技術(shù)又稱為基因打靶（genetargeting)基因同源重組技術(shù)基因診療和基因治療專家講座第37頁（二）基因添加（geneaugmentation）

定義:

經(jīng)過導(dǎo)入外源基因使靶細(xì)胞表示其本身不表示基因。類型:在有缺點(diǎn)基因細(xì)胞中導(dǎo)入對應(yīng)正常基因，而細(xì)胞內(nèi)缺點(diǎn)基因并未除去，經(jīng)過導(dǎo)入正常基因表示產(chǎn)物，賠償缺點(diǎn)基因功效；向靶細(xì)胞中導(dǎo)入靶細(xì)胞原來不表示基因，利用其表示產(chǎn)物到達(dá)治療疾病目標(biāo)。基因診療和基因治療專家講座第38頁（三）基因干預(yù)（geneinterference）

定義：采取特定方式抑制某個(gè)基因表示，或者經(jīng)過破壞某個(gè)基因結(jié)構(gòu)而使之不能表示，以到達(dá)治療疾病目標(biāo)?；蛟\療和基因治療專家講座第39頁定義：將“自殺”基因?qū)胨拗骷?xì)胞中，這種基因編碼酶能使無毒性藥品前體轉(zhuǎn)化為細(xì)胞毒性代謝物，誘導(dǎo)靶細(xì)胞產(chǎn)生“自殺”效應(yīng)，從而到達(dá)去除腫瘤細(xì)胞目標(biāo)。應(yīng)用：是惡性腫瘤基因治療主要方法之一。（四）自殺基因治療(SuicideGeneTherapy)基因診療和基因治療專家講座第40頁自殺基因作用機(jī)制

基因診療和基因治療專家講座第41頁

（五）基因免疫治療

經(jīng)過將抗癌免疫增強(qiáng)細(xì)胞因子或MHC基因?qū)肽[瘤組織，以增強(qiáng)腫瘤微環(huán)境中抗癌免疫反應(yīng)?；蛟\療和基因治療專家講座第42頁二、基因轉(zhuǎn)移技術(shù)

基因診療和基因治療專家講座第43頁基因治療兩種路徑載體目標(biāo)基因invivoexvivo靶細(xì)胞基因診療和基因治療專家講座第44頁

基因轉(zhuǎn)移(genetransfer)技術(shù)

1.病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移2.非病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移基因診療和基因治療專家講座第45頁反轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu)及生活周期（1）反轉(zhuǎn)錄病毒

基因診療和基因治療專家講座第46頁

反轉(zhuǎn)錄病毒載體特點(diǎn)

1）反轉(zhuǎn)錄病毒包膜上糖蛋白，能夠被許多哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜上特異性受體識(shí)別，從而使反轉(zhuǎn)錄病毒攜帶遺傳物質(zhì)高效地進(jìn)入靶細(xì)胞。

2)前病毒經(jīng)過LTR高效整合至靶細(xì)胞基因組中，有利于外源基因在靶細(xì)胞中永久表示。

3)病毒顆粒以出芽方式分泌至輔助細(xì)胞培養(yǎng)上清液中，易于分離制備。

基因診療和基因治療專家講座第47頁

反轉(zhuǎn)錄病毒載體主要缺點(diǎn)

1）隨機(jī)整合，有插入突變、激活癌基因潛在危險(xiǎn)；

2）反轉(zhuǎn)錄病毒載體容量較小，只能容納7kb以下外源基因。基因診療和基因治療專家講座第48頁

（2）腺病毒(adenovirus)載體

腺病毒是雙鏈DNA病毒。它經(jīng)過受體介導(dǎo)內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，然后腺病毒基因組轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，保持在染色體外，不整合進(jìn)入宿主細(xì)胞基因組中。

基因診療和基因治療專家講座第49頁基因診療和基因治療專家講座第50頁腺病毒優(yōu)點(diǎn)基因?qū)胄矢?，對人類安全；宿主范圍廣；基因轉(zhuǎn)導(dǎo)與細(xì)胞分裂無關(guān)；腺病毒載體容量較大，可插入7.5kb外源基因?；蛟\療和基因治療專家講座第51頁

腺病毒載體缺點(diǎn)宿主免疫反應(yīng)造成腺病毒載體表示短暫。靶向性差。

不能整合到靶細(xì)胞基因組DNA中。分裂增殖快細(xì)胞，導(dǎo)入重組病毒載體，隨分裂而丟失機(jī)會(huì)增多，表示時(shí)間相對較短?；蛟\療和基因治療專家講座第52頁（3）腺病毒相關(guān)病毒載體

單鏈線狀DNA缺點(diǎn)型病毒。其基因組DNA小于5kb，無包膜，外形為裸露20面體顆粒。AAV不能獨(dú)立復(fù)制，只有在輔助病毒（如腺病毒、單純皰疹病毒等）存在時(shí)，才能進(jìn)行復(fù)制和溶細(xì)胞性感染，不然只能建立溶源性潛伏感染。AAVVirusParticles基因診療和基因治療專家講座第53頁腺病毒相關(guān)病毒載體（AAV）特點(diǎn)以潛伏感染為主；病毒基因組與細(xì)胞共存；若細(xì)胞受刺激，表示應(yīng)激基因，使AAV病毒復(fù)制；產(chǎn)生子代病毒并釋放，又感染新細(xì)胞，建立新潛伏狀態(tài)?；蛟\療和基因治療專家講座第54頁

AAV載體缺點(diǎn)

AAV載體容量小，當(dāng)前最多只能容納5kb外源DNA片段；感染效率比反轉(zhuǎn)錄病毒載體低,在40%-80%成人中存在過感染;可能會(huì)引發(fā)免疫排斥?；蛟\療和基因治療專家講座第55頁慣用基因治療載體

整合致病性感染細(xì)胞克隆容量反轉(zhuǎn)錄病毒載體隨機(jī)整合，效率高可能致病分裂細(xì)胞<7kb腺病毒載體不整合，可能丟失不致病分裂細(xì)胞、非分裂細(xì)胞

腺相關(guān)病毒載體定點(diǎn)整合(19號(hào)染色體特定區(qū)域)不致病分裂細(xì)胞、非分裂細(xì)胞<5kb<7.5kb基因診療和基因治療專家講座第56頁

2.非病毒載體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)

（1）脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移技術(shù)

基本原理:利用陽離子脂質(zhì)體單體與DNA混合后，能夠自動(dòng)形成包埋外源DNA脂質(zhì)體，與細(xì)胞一起孵育，即可經(jīng)過細(xì)胞內(nèi)吞作用將外源DNA轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)，并進(jìn)行表示。脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移技術(shù)使用方便、成本低廉?；蛟\療和基因治療專家講座第57頁

脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移示意圖基因診療和基因治療專家講座第58頁

（2）受體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移技術(shù)

多聚陽離子與細(xì)胞配體偶聯(lián)，經(jīng)過電荷相互作用與帶負(fù)電荷DNA結(jié)合，將DNA包圍，配體暴露于表面。

該復(fù)合物可被帶有特異性受體靶細(xì)胞吞飲，從而將外源DNA導(dǎo)入靶細(xì)胞。基因診療和基因治療專家講座第59頁受體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移技術(shù)示意圖基因診療和基因治療專家講座第60頁

（3）基因直接注射技術(shù)

將基因直接注入動(dòng)物體內(nèi)，表示基因產(chǎn)物。

如將促進(jìn)心臟血管生長基因直接注入試驗(yàn)鼠心臟，可使其心臟壁內(nèi)毛細(xì)血管增加30%～40%；將胰島素基因直接注入鼠骨骼肌細(xì)胞，能分泌糖尿病所缺乏胰島素；肌內(nèi)注射凝血因子Ⅸ基因，可產(chǎn)生血友病所需凝血因子Ⅸ?；蛟\療和基因治療專家講座第61頁

基因直接注射法優(yōu)點(diǎn)排除病毒載體可能潛在致癌性或其它副作用；導(dǎo)入基因不需整合即可表示，防止了反轉(zhuǎn)錄病毒載體導(dǎo)入整合后，一旦發(fā)生副作用不易中止或逆轉(zhuǎn)缺點(diǎn)；基因直接注射法可重復(fù)使用，而病毒載體則可能誘導(dǎo)體內(nèi)免疫應(yīng)答，致使重復(fù)治療效果下降。

基因診療和基因治療專家講座第62頁三、基因干預(yù)

（geneinterference）

基因診療和基因治療專家講座第63頁（一）反義RNA（antisenseRNA）

利用反義RNA對體外培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行基因表示調(diào)控，通常采取方法有兩種：

（1）體外合成反義RNA，直接作用于培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞吸收RNA后，發(fā)揮作用。

（2）構(gòu)建一些能轉(zhuǎn)錄反義RNA重組質(zhì)粒，將這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞中，轉(zhuǎn)錄出反義RNA而發(fā)揮作用?；蛟\療和基因治療專家講座第64頁（二）干擾RNA

RNA干擾（RNAinterference，RNAi）是一個(gè)由雙鏈RNA誘發(fā)基因緘默現(xiàn)象。在此過程中，與雙鏈RNA有同源序列mRNA被降解，從而抑制該基因表示?；蛟\療和基因治療專家講座第65頁RNA干擾機(jī)制

RNA干擾過程主要有2個(gè)步驟：

（1）小干擾性RNA（siRNA）（2）siRNA與細(xì)胞內(nèi)一些酶和蛋白質(zhì)形成復(fù)合體，稱為RNA誘導(dǎo)緘默復(fù)合體（RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)。

該復(fù)合體可識(shí)別與siRNA有同源序列mRNA，并在特異位點(diǎn)將該mRNA切斷

長雙鏈RNA被細(xì)胞內(nèi)雙鏈RNA特異性核酸酶Dicer切成21-23個(gè)堿基正確短雙鏈RNA，稱為小干擾性RNA（smallinterferingRNA，siRNA）基因診療和基因治療專家講座第66頁RNA干擾機(jī)制示意圖

基因診療和基因治療專家講座第67頁1.

體外化學(xué)合成;2.用質(zhì)粒載體或病毒載體可在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定地生成。siRNA產(chǎn)生基因診療和基因治療專家講座第68頁四、基因治療應(yīng)用