食品微生物鑒定技術(shù)和方法專家講座

微生物純培養(yǎng)取得方法目標要明確：分離菌株用途方法可行：選擇性強最少到達菌落純，最好細胞純第二章食品微生物判定技術(shù)和方法第一節(jié)食品微生物純培養(yǎng)取得和傳統(tǒng)判定方法食品微生物鑒定技術(shù)和方法專家講座第1頁微生物純培養(yǎng)取得方法稀釋涂布法劃線分離法利用平皿生化反應(yīng)分離法：透明圈法、變色圈法、生長圈法、抑菌圈法“病灶”分離法單細胞或單孢子分離法特殊菌類——環(huán)境保護降解菌分離第二章食品微生物判定技術(shù)和方法第一節(jié)食品微生物純培養(yǎng)取得和傳統(tǒng)判定方法食品微生物鑒定技術(shù)和方法專家講座第2頁微生物分離、純化與接種技術(shù)接種和分離工具

1．接種針2.接種環(huán)3.接種鉤4.5.玻璃涂棒6.接種圈7.接種鋤8.小解剖刀

食品微生物鑒定技術(shù)和方法專家講座第3頁微生物分離、純化與接種技術(shù)食品微生物鑒定技術(shù)和方法專家講座第4頁劃線接種，分離純化食品微生物鑒定技術(shù)和方法專家講座第5頁灼燒食品微生物鑒定技術(shù)和方法專家講座第6頁食品微生物鑒定技術(shù)和方法專家講座第7頁微生物純培養(yǎng)取得方法無氮培養(yǎng)基——篩出固氮菌；無有機碳源培養(yǎng)基——篩出硝化細菌；無有機碳源培養(yǎng)基且無氧有光環(huán)境——篩出光合細菌；高濃度NaCl培養(yǎng)基——篩出耐鹽菌株伊紅—美藍培養(yǎng)基——篩出大腸桿菌；青霉素培養(yǎng)基——篩出酵母菌、霉菌；……第二章食品微生物判定技術(shù)和方法第一節(jié)食品微生物純培養(yǎng)取得和傳統(tǒng)判定方法食品微生物鑒定技術(shù)和方法專家講座第8頁微生物純培養(yǎng)取得方法

傳統(tǒng)發(fā)酵食品starter確實定or優(yōu)勢菌株確實定比如：金華火腿主要發(fā)酵菌；

優(yōu)勢細菌：乳酸菌、葡萄球菌優(yōu)勢酵母菌：歐諾比假絲酵母、紅酵母微生物生態(tài)學(xué)方面菌株確定？？非原位檢測判定、原位檢測判定第一節(jié)食品微生物純培養(yǎng)取得和傳統(tǒng)判定方法食品微生物鑒定技術(shù)和方法專家講座第9頁檢測食品中微生物總數(shù)方法4種基本方法：（1）標準平板計數(shù)或好氧平板計數(shù)，適合用于活細胞或菌落形成單位。（2）最大可能值法。作為一個統(tǒng)計學(xué)方法來測定活性細胞。（3）染色還原技術(shù)。預(yù)計擁有還原能力活性細胞數(shù)目。（4）直接顯微鏡計數(shù)法。活性和非活性細胞。食品微生物鑒定技術(shù)和方法專家講座第10頁常規(guī)標準平板計數(shù)（SPC）

將一部分食品樣品混合或者均質(zhì)化，在適當稀釋液中進行梯度稀釋，然后涂布或者傾注到適宜瓊脂培養(yǎng)基上，在適當溫度下培養(yǎng)一段時間后，使用電子計數(shù)器對可見菌落進行計數(shù)。

SPC法是當前測定活細胞數(shù)和食品產(chǎn)品中菌落形成單位數(shù)最廣泛方法。檢測食品中微生物總數(shù)方法食品微生物鑒定技術(shù)和方法專家講座第11頁常規(guī)標準平板計數(shù)（SPC）統(tǒng)計產(chǎn)品中全部活細胞時，要考慮以下原因：1）采取取樣方法2）食品樣品中有機體分類3）食品生物區(qū)系種類4）食品原料種類5）食品產(chǎn)品預(yù)檢歷史統(tǒng)計6）所用培養(yǎng)基營養(yǎng)程度7）所用培養(yǎng)溫度和時間8）pH值、aw和培養(yǎng)基氧化還原電位9）所用稀釋液類型10）食品樣品中有機體相對數(shù)量11）競爭或拮抗有機體存在檢測食品中微生物總數(shù)方法食品微生物鑒定技術(shù)和方法專家講座第12頁顯微鏡菌落計數(shù)法

是經(jīng)過顯微鏡對載玻片瓊脂層上生長微小菌落計數(shù)。首先進行涂布，將0.1ml牛乳瓊脂混合物涂布到4cm2載玻片上，經(jīng)培養(yǎng)，干燥和染色，借助顯微鏡對微小菌落進行計數(shù)。另一個方法是將2ml融化瓊脂與2ml熱牛乳混合，隨即取0.1ml已經(jīng)接種瓊脂涂抹到44cm2載玻片上，最終用硫堇藍染色，用16mm物鏡寬視野顯微鏡觀察載玻片。檢測食品中微生物總數(shù)方法食品微生物鑒定技術(shù)和方法專家講座第13頁最大可能數(shù)法

在這種方法中，食品樣品稀釋液準備類似于SPC法。將三個連續(xù)等分量樣品或稀釋梯度稀釋液轉(zhuǎn)移到9個或15個有適宜培養(yǎng)基試管中，分別稱為3試管或5試管法。最初樣品中微生物數(shù)量經(jīng)過查閱標準MPN表來取得。通常MPN法結(jié)果高于SPC結(jié)果。檢測食品中微生物總數(shù)方法食品微生物鑒定技術(shù)和方法專家講座第14頁MPN法優(yōu)點：（1）這種方法相對比較簡單（2）與SPC法相比，不一樣試驗室得到結(jié)果愈加可靠，相同率較高。（3）特殊微生物群體能夠經(jīng)過適當選擇性培養(yǎng)基進行測定。（4）這是一個測定糞大腸桿菌群含量方法。缺點：準確度低。檢測食品中微生物總數(shù)方法食品微生物鑒定技術(shù)和方法專家講座第15頁染色還原試驗

在估測相關(guān)產(chǎn)品中活菌數(shù)量時，通常使用兩種染色劑：亞甲基藍和刃天青。進行染色還原試驗時，食品上清液加入任何一個染色劑標準溶液，亞甲藍會從藍色還原為白色，而刃天青則從暗藍色還原為粉紅色或白色，染色劑還原時間與樣品中微生物數(shù)量成正比。檢測食品中微生物總數(shù)方法食品微生物鑒定技術(shù)和方法專家講座第16頁染色還原試驗刃天青還原反應(yīng)快速檢測牛肉腐敗，被還原為無色、有味、而且結(jié)果與SPC法顯著相關(guān)。乳品中用來估測鮮牛乳微生物學(xué)質(zhì)量，簡單，快捷，經(jīng)濟，而且只有活細胞才對顯色劑有顯著還原能力。缺點：微生物對染色劑還原程度不一樣，不適合用于含還原酶食品。食品微生物鑒定技術(shù)和方法專家講座第17頁食品表面微生物檢測1.棉拭/棉拭漂洗法是表面微生物檢驗中最古老、應(yīng)用最廣泛方法，它不但應(yīng)用于食品及乳制品，而且還用于醫(yī)院、飯店。方法：將1.5ml液體加到平整表面上，在3cm2區(qū)域內(nèi)擦拭15s，然后用微升移液管取0.1ml和0.5ml液體，將液體在平板計數(shù)瓊脂或選擇性培養(yǎng)基上涂布或倒平板計數(shù)。食品微生物鑒定技術(shù)和方法專家講座第18頁2.接觸平板法

平板直接接觸復(fù)制微生物法（RODAC）使用一個特殊皮氏培養(yǎng)皿，平板中傾倒15.5－16.5ml培養(yǎng)基，形成瓊脂平面；當把平皿倒置時，凝固瓊脂就會與待測表面直接接觸，接觸后蓋上平皿蓋、培養(yǎng)，然后進行菌落計數(shù)。缺點：僅適合用于菌落較分散表面，對于污染較嚴重表面無效。食品表面微生物檢測食品微生物鑒定技術(shù)和方法專家講座第19頁3.瓊脂注射/瓊脂腸法瓊脂注射法：將1個100ml注射器去掉針頭，改造成中空柱體，并在中空部分注入瓊脂，經(jīng)過推進活塞將瓊脂從柱體底部擠壓到待測表面上，將露在外面那層切下，置于皮氏平皿中，經(jīng)過培養(yǎng)后進行菌落計數(shù)。瓊脂腸法：與注射法類似，只不過用是塑料試管而不是改造注射器。廣泛用于肉制品或食品加工設(shè)備表面微生物檢測。缺點同RODAC法，適合菌落分散和表面污染程度較輕樣品。食品表面微生物檢測食品微生物鑒定技術(shù)和方法專家講座第20頁其它檢測方法：1）直接表面檢測法2）粘性薄膜法3）棉拭/瓊脂斜面4）超聲波裝置5）噴霧槍法食品表面微生物檢測食品微生物鑒定技術(shù)和方法專家講座第21頁第二章食品微生物判定技術(shù)和方法第一節(jié)食品微生物純培養(yǎng)取得和傳統(tǒng)判定方法

微生物傳統(tǒng)判定方法細菌：伯杰氏判定細菌學(xué)手冊（第八版1974、第九版1994）、伯杰氏系統(tǒng)細菌學(xué)手冊（第一版）1984~1989，年分五卷出版。放線菌：中國科學(xué)院微生物研究所編著放線菌目分科、分屬檢索表真菌：Smith、Alexopoulos(阿歷克索鮑羅斯）、Ainsworth（安斯沃思）分類系統(tǒng)食品微生物鑒定技術(shù)和方法專家講座第22頁第二章食品微生物判定技術(shù)和方法第一節(jié)食品微生物純培養(yǎng)取得和傳統(tǒng)判定方法伯杰氏手冊沿革：伯杰氏手冊自從1923年出版第1版，直至1974年第8版，均使用《伯杰氏判定細菌學(xué)手冊》(Bergey′sManualofDeterminativeBacteriology)。1984年開始至1989年分四卷出版，并更名為《伯杰氏系統(tǒng)細菌學(xué)手冊》(Bergey'sManualofSystematicBacteriology)(第一版)1994年又將"系統(tǒng)手冊"1-4卷中相關(guān)屬以上分類單元分類判定資料進行少許修改補充后聚集成一冊仍用原來書名出版，故稱之為《伯杰氏判定細菌學(xué)手冊》第九版食品微生物鑒定技術(shù)和方法專家講座第23頁第二章食品微生物判定技術(shù)和方法第一節(jié)食品微生物純培養(yǎng)取得和傳統(tǒng)判定方法第九版《伯杰氏細菌學(xué)手冊》介紹：內(nèi)容分四卷：第1卷：普通醫(yī)學(xué)和工業(yè)方面主要革蘭氏陰性細菌。第2卷：放線菌以外革蘭氏陽性細菌。第3卷：古細菌、藍細菌及其它革蘭氏陰性細菌。第4卷:放線菌。

食品微生物鑒定技術(shù)和方法專家講座第24頁第一節(jié)食品微生物純培養(yǎng)取得和傳統(tǒng)判定方法新分類方法:數(shù)值分類、核酸在細菌分類中應(yīng)用、遺傳學(xué)方法、血清學(xué)和化學(xué)分類等。判定方法革新。新版在表型特征基礎(chǔ)上，以DNA資料對屬、種分類地位給予決定性判斷。將DNA中G+Cmol％含量測定、DNA雜交、RNA寡核苷酸次序分析、細胞化學(xué)分析、數(shù)值分類等方法應(yīng)用到細菌分類學(xué)上。食品微生物鑒定技術(shù)和方法專家講座第25頁第二章食品微生物判定技術(shù)和方法第一節(jié)食品微生物純培養(yǎng)取得和傳統(tǒng)判定方法應(yīng)用標準查閱相關(guān)盡可能資料每一步利用常識、結(jié)果判定最少試驗，最好結(jié)果食品微生物鑒定技術(shù)和方法專家講座第26頁第二章食品微生物判定技術(shù)和方法第一節(jié)食品微生物純培養(yǎng)取得和傳統(tǒng)判定方法判定步驟菌株純化化能自養(yǎng)菌、光合菌or化能異養(yǎng)菌確實定依據(jù)分離過程確定形態(tài)、Gram、Spore確實定色素等專一特征碳源類型、氧化性、發(fā)酵性歸屬；由屬特征選擇試驗；深入確定食品微生物鑒定技術(shù)和方法專家講座第27頁第二章食品微生物判定技術(shù)和方法第一節(jié)食品微生物純培養(yǎng)取得和傳統(tǒng)判定方法應(yīng)用實例（a-淀粉酶抑制劑產(chǎn)生菌分離、判定、保留）第一步：菌落純菌株取得第二步：設(shè)計一系列檢測反應(yīng)第三步：對照結(jié)果定名第四步：保留

生化反應(yīng)平板篩選：“抑制圈和顯色圈法”。食品微生物鑒定技術(shù)和方法專家講座第28頁第二章食品微生物判定技術(shù)和方法1.DNA同源性和DNA中（G+C）摩爾分數(shù)（G+C)%=（G+C)/(A+T+C+G)%Tm法（熱變溫度法）測定菌株間相差2.5～4.0％；種間相差5～10％以上；屬間相差10％以上第二節(jié)食品微生物學(xué)當代判定方法食品微生物鑒定技術(shù)和方法專家講座第29頁

每個生物種都有特定GC%范圍，所以能夠作為分類判定指標。細菌GC%范圍為25--75%，改變范圍最大，所以更適合于細菌分類判定。食品微生物鑒定技術(shù)和方法專家講座第30頁

GC%測定主要用于對表型特征難區(qū)分細菌作出判定，并可檢驗表型特征分類合理性，從分子水平上判斷物種親緣關(guān)系。G+C含量比較主要用于分類判定中否定

但含有相同G+C含量生物并不一定表明它們之間含有近親緣關(guān)系。食品微生物鑒定技術(shù)和方法專家講座第31頁

同一個種內(nèi)不一樣菌株G+C含量差異應(yīng)在4～5%以下；同屬不一樣種差異應(yīng)低于10～15%；

G+C含量已經(jīng)作為建立新微生物分類單元一項基本特征，它對于種、屬甚至科分類判定有主要意義。

若二個在形態(tài)及生理生化特征方面及其相同菌株，假如其G+C含量差異大于5%，則必定不是同一個種，大于15%則必定不是同一個屬。食品微生物鑒定技術(shù)和方法專家講座第32頁第二章食品微生物判定技術(shù)和方法第二節(jié)食品微生物學(xué)當代判定方法1.DNA同源性Southernblotting（DNA-DNA)Northernblotting(DNA-RNA)Westernblotting(Pro-Anti)Easternblotting

食品微生物鑒定技術(shù)和方法專家講座第33頁第二章食品微生物判定技術(shù)和方法第二節(jié)食品微生物學(xué)當代判定方法2.23S、16S、5SrRNA序列相同性核糖體

70S

30S50S

16S213423S+5S蛋白質(zhì)食品微生物鑒定技術(shù)和方法專家講座第34頁第二章食品微生物判定技術(shù)和方法第二節(jié)食品微生物學(xué)當代判定方法16S亞基保守性高，是細菌進化計時器普遍存在細胞RNA含量較高rRNA穩(wěn)定16sRNA序列保守16sRNA分子量適中16SrRNA基因約含有1540個核苷酸，分可變區(qū)和保守區(qū)，不一樣微生物可變區(qū)核苷酸序列不一樣，從而能夠利用這些特異性序列進行微生物判定；

食品微生物鑒定技術(shù)和方法專家講座第35頁2023/4/2536

細

菌

域

Domainbacteria

古（生）菌域

Domainarchaea

真

核

生

物

域

Domaineukaryota

紫色細菌

線粒體

甲烷球菌屬

甲烷桿菌屬

真菌

植物

葉綠體

革蘭氏陽性細菌

甲烷八疊球菌屬

極端嗜鹽菌

動物

藍細菌

無硫綠細菌

熱球菌屬

偽變形蟲

纖毛蟲

黃桿菌

棲熱胞菌屬

熱網(wǎng)菌屬

熱變形細菌

粘菌

鞭毛蟲

產(chǎn)液菌屬

微孢子

毛滴蟲

雙滴蟲（假滴蟲屬）

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生物總系統(tǒng)發(fā)育樹（依據(jù)16SrRNA序列比較繪制，引自《布氏微生物學(xué)》）食品微生物鑒定技術(shù)和方法專家講座第36頁第二章食品微生物判定技術(shù)和方法第二節(jié)食品微生物學(xué)當代判定方法詳細測定方法：采取RNaseT1酶能夠?qū)?6SrRNA酶解在G位點上切割，得到6～20個堿基大小序列對這些6～20堿基片段進行分離、測序比較不一樣微生物之間SAB（Dice型相關(guān)系數(shù)）相同性。

食品微生物鑒定技術(shù)和方法專家講座第37頁第二章食品微生物判定技術(shù)和方法第二節(jié)食品微生物學(xué)當代判定方法SAB=2×NAB/（NA+NB

）NAB代表兩菌所含相同寡核苷酸堿基總數(shù)，NA和NB分別代表兩菌寡核苷酸所含堿基總數(shù)SAB等于1，說明所比較兩菌株rRNA序列相同，是同一進化時間微生物，若SAB值小于0.1，兩菌親緣關(guān)系很遠食品微生物鑒定技術(shù)和方法專家講座第38頁第二章食品微生物判定技術(shù)和方法第二節(jié)食品微生物學(xué)當代判定方法分子生物學(xué)技術(shù)在細菌判定中應(yīng)用核酸探針技術(shù)核酸擴增技術(shù)（PCR技術(shù)）基因芯片技術(shù)食品微生物鑒定技術(shù)和方法專家講座第39頁2023/4/2540

核酸探針技術(shù)原理：兩條不一樣起源核酸鏈假如含有互補堿基序列，就能夠特異性結(jié)合而成為分子雜交鏈。據(jù)此，將己知核苷酸序列DNA片段用同位素或其它方法標識，加入己變性被檢DNA樣品中，在一定條件下即可與該樣品中有同源序列DNA區(qū)段形成雜交雙鏈，從而到達判定樣品中DNA目標。

這種能認識到特異性核苷酸序列有標識單鏈叫DNA分子核酸探針或基因探針。

食品微生物鑒定技術(shù)和方法專家講座第40頁

制備核酸探針要注意兩個關(guān)鍵性問題：

1.要選擇特異性強而又無交叉反應(yīng)核酸(DNA或RNA)片段，可經(jīng)過核酸重組和克隆以及人工合成、PCR擴增等技術(shù)取得

2.標識物，當前慣用同位素(32P、35S等）、光生物素及地高辛(digoxigenin)標識。核酸探針技術(shù)已被用于檢驗食品中一些常見病原菌。如產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌、沙門氏菌。食品微生物鑒定技術(shù)和方法專家講座第41頁2023/4/2542

PCR（PolymeraseChainReaction）即聚合酶鏈式反應(yīng)，又稱為無細胞克隆系統(tǒng)，是1985年由Mullis創(chuàng)建一項DNA體外擴增技術(shù)。

PCR全過程由變性（denature）、退火（annealing）和延伸（extension）三步組成若干個循環(huán)，每步之間經(jīng)過溫度改變來實現(xiàn)轉(zhuǎn)換。其基本原理是在體外對一特定雙鏈DNA片段（或稱靶DNA)進行高效擴增。首先將靶DNA雙鏈加熱變性為單鏈，然后加入兩段人工合成與靶DNA兩端鄰近序列互補寡核苷酸片段作為引物(primer)，即左端引物和右端引物，該對引物與互補DNA單鏈堿基互補結(jié)合后，在有DNA多聚酶和四種dNTPs底物存在情況下，引物沿模板DNA鏈（靶DNA單鏈）按5’→3’方向延伸，自動合成新DNA雙鏈。食品微生物鑒定技術(shù)和方法專家講座第42頁2023/4/2543

PCR技術(shù)有快速、特異、敏感等特點，因而該技術(shù)在食品中致病菌檢測方面含有很大應(yīng)用潛力。

PCR技術(shù)能快速地檢出肉食品中沙門氏菌，檢測敏感性和特異性均為100%，確保了檢測準確性。

PCR還可用于各種病原微生物同時檢測或判定，它是在同一PCR反應(yīng)管中同時加上各種病原微生物特異性引物，進行PCR擴增?？捎糜谕瑫r檢測各種病原體或判定出是那一型病原體感染。食品微生物鑒定技術(shù)和方法專家講座第43頁2023/4/2544

基因芯片（genechip）又稱DNA微陣列（DNAmicroarray），是指將許多特定寡居核苷酸片斷或基因片段作為探針，有規(guī)律排列固定于支持物上形成DNA分子陣列。芯片與待測熒光標識樣品基因按堿基配對原理進行雜交后，在經(jīng)過激光共聚焦熒光監(jiān)測系統(tǒng)等對其表面進行掃描即可獲取樣品分子數(shù)量和序列信息。因為該技術(shù)同時將大量探針固定于支持物上，所以能夠一次性對大量序列進行檢測和基因分析，處理了傳統(tǒng)核酸印跡雜交（southernblot和northernblot等）操作復(fù)雜，操作序列數(shù)量少等缺點?；蛐酒夹g(shù)突出特點在于其高度并行性、多樣化、微型化和自動化，以及靈敏、高效和低成本等優(yōu)點。食品微生物鑒定技術(shù)和方法專家講座第44頁第二章食品微生物判定技術(shù)和方法第二節(jié)食品微生物學(xué)當代判定方法3.寡核苷酸種類4.可溶性蛋白質(zhì)總量或形態(tài)學(xué)、生理生化特征數(shù)值分類法5.細胞壁分析6.血清反應(yīng)法7.細胞脂肪酸組成份析食品微生物鑒定技術(shù)和方法專家講座第45頁第二章食品微生物判定技術(shù)和方法1.化學(xué)方法熱穩(wěn)定性核酸酶法（金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus））鱟試劑法（Limulusamoebocytelysate（LAL）assay）（適合用于G-細菌）ATP測定法（適合用于活細胞）輻射線測定法熒光或發(fā)色測定法第三節(jié)食品微生物快速檢測技術(shù)食品微生物鑒定技術(shù)和方法專家講座第46頁1.化學(xué)方法1）熱穩(wěn)定性核酸酶法（金黃色葡萄球菌（S.aureus））

經(jīng)過測定食物中熱穩(wěn)定性核酸酶能夠檢測出食物中存在大量金黃色葡萄球菌。這是因為其產(chǎn)生熱穩(wěn)定性核酸酶以及凝固酶。研究表明：有0.34單位熱穩(wěn)定性核酸酶存在時，表明有某種金黃色葡萄球菌生長，而此時腸毒素含量還不會造成食物中毒。

0.34單位熱穩(wěn)定性核酸酶相當于金黃色葡萄球菌產(chǎn)生9.5×10－3ug腸毒素。熱穩(wěn)定性核酸酶檢測法能夠作為指示金黃色葡萄球菌生長方法。第三節(jié)食品微生物快速檢測技術(shù)食品微生物鑒定技術(shù)和方法專家講座第47頁1.化學(xué)方法

2）鱟試劑法鱟試劑法又稱鱟變形細胞溶解物試驗。革蘭氏陰性菌可經(jīng)過產(chǎn)生內(nèi)毒素進行判定，內(nèi)毒素是由菌體外膜裸露脂多糖和被外膜包圍脂A組成。鱟變形細胞溶解物試驗采取來自馬蹄蟹血液血細胞溶菌蛋白。溶菌蛋白是已知對內(nèi)毒素最敏感物質(zhì)。鱟試驗是在少許溶菌液中加入食物懸液或其它待測樣品，并在37℃培養(yǎng)1h。內(nèi)毒素存在會造成胞溶物凝膠。鱟試劑能檢出1.0pg脂多糖。因為大腸桿菌含有3.0fg脂多糖，所以能檢出＜300個革蘭氏陰性菌。食品微生物鑒定技術(shù)和方法專家講座第48頁鱟試劑法鱟試劑法首次應(yīng)用于食品檢驗是檢測碎牛肉中腐敗菌。內(nèi)毒素滴定度伴隨革蘭氏陰性細菌數(shù)量增加而增加。因為冷藏鮮肉變質(zhì)通常是由革蘭氏陰性菌引發(fā)，所以鱟試劑法是快速檢測革蘭氏陰性菌總菌數(shù)好方法。這種方法適合于評價巴氏殺菌前后乳大腸菌群衛(wèi)生質(zhì)量。食品微生物鑒定技術(shù)和方法專家講座第49頁3）ATP法ATP在細胞死亡2h后消失，而且每個細菌細胞中ATP含量恒定，每個細胞約含有10－18－10－17mol，相當于105cfu細菌含有4×104mol/LATP。一個最簡單ATP測定法之一是利用螢火蟲蟲熒光素－熒光素酶系統(tǒng)測定。在ATP存在時，用熒光檢測器檢測熒光素酶發(fā)射熒光強度。螢火蟲熒光素發(fā)光量與添加ATP量成正比。在106－109cfu/g范圍內(nèi)，微生物ATP含量和細菌數(shù)呈線性關(guān)系。ATP法已經(jīng)用于雞肉、豬肉和牛肉檢測。（cfu/mL指是每毫升樣品中含有細菌群落總數(shù)）食品微生物鑒定技術(shù)和方法專家講座第50頁第二章食品微生物判定技術(shù)和方法第二節(jié)食品微生物學(xué)當代判定方法4）輻射測定法

利用培養(yǎng)基中14C標識代謝物為基礎(chǔ)，當微生物利用這些物質(zhì)時，釋放14CO2并用放射能計數(shù)器檢測。

14C標識葡萄糖。對那些不能利用葡萄糖微生物，14C標識甲酸鹽或14C標識谷氨酸鹽。食品微生物鑒定技術(shù)和方法專家講座第51頁4）輻射測定法整個程序以下：向15ml帶蓋血清瓶中加入12－36ml含標識代謝物培養(yǎng)基，經(jīng)過充入適當氣體保持需氧或厭氧條件并培養(yǎng)。培養(yǎng)時測定頂空中14CO2