化學生物學化學物質(zhì)和蛋白質(zhì)的相互作用

化學生物學化學物質(zhì)和蛋白質(zhì)的相互作用化學生物學化學物質(zhì)和蛋白質(zhì)的相互作用第1頁第一節(jié)化學物質(zhì)對蛋白質(zhì)沉淀作用化學生物學化學物質(zhì)和蛋白質(zhì)的相互作用第2頁一、沉淀作用類型1．可逆沉淀(非變性沉淀

)條件溫和結構和性質(zhì)不改變分離和純化蛋白質(zhì)基礎方法含有個別純化、濃縮特點等電點沉淀法鹽析法有機溶劑沉淀法化學生物學化學物質(zhì)和蛋白質(zhì)的相互作用第3頁一、沉淀作用類型2．不可逆沉淀（變性沉淀

）強烈沉淀條件破壞了蛋白質(zhì)膠體溶液穩(wěn)定性破壞了蛋白質(zhì)結構和性質(zhì)加熱沉淀強酸堿沉淀重金屬鹽沉淀3．抗體-抗原沉淀化學生物學化學物質(zhì)和蛋白質(zhì)的相互作用第4頁二、沉淀劑類型1．無機物沉淀（1）鹽析鹽析方程lgS=lgS0-KsISo代表當離子強度為零時溶解度；S為蛋白質(zhì)在某一離子強度溶液中溶解度；I為中性鹽離子強度；Ks為鹽析常數(shù)，Ks值越大，該鹽鹽析效果很好化學生物學化學物質(zhì)和蛋白質(zhì)的相互作用第5頁陰離子對蛋白質(zhì)鹽析影響較顯著，而陽離子影響次之。含高價陰離子鹽，效果比1價鹽好陰離子鹽析效果高價陽離子效果不如低價陽離子對于1價陽離子：

NH4+>K+>Na+最常見鹽析劑是硫酸銨、硫酸鈉、磷酸鉀或磷酸鈉枸橡酸鹽

>PO43->SO42->CHCOO->Cl->NO3->SCN-化學生物學化學物質(zhì)和蛋白質(zhì)的相互作用第6頁（2）金屬離子沉淀法①Mn2+、Fe2+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+、Cd2+

與蛋白質(zhì)分子表面羧基、氨基、咪唑基、胍基等側鏈結合②Ca2+、Ba2+、Mg2+、Pb2+

與蛋白質(zhì)分子表面羧基結合，但不與含氮化合物相結合③Ag2+、Hg2+與蛋白質(zhì)分子表面巰基相結合化學生物學化學物質(zhì)和蛋白質(zhì)的相互作用第7頁2．等電點沉淀適合用于疏水性較強蛋白質(zhì)化學生物學化學物質(zhì)和蛋白質(zhì)的相互作用第8頁優(yōu)點：（1）很多蛋白質(zhì)等電點都在偏酸性范圍內(nèi)，而無機酸通常較廉價；（2）一些酸，如磷酸、鹽酸和硫酸應用能為蛋白質(zhì)類食品所允許；（3）常可直接進行其它純化操作，無需將殘余酸除去。缺點：酸化時易使蛋白質(zhì)失活化學生物學化學物質(zhì)和蛋白質(zhì)的相互作用第9頁3．有機物沉淀主要效應是水活度降低（1）有機溶劑優(yōu)點：溶劑易蒸發(fā)除去，無殘留用途：適合用于制備食品蛋白質(zhì)缺點：易使蛋白質(zhì)變性失活，且有機溶劑易燃、易爆，安全要求較高最常見溶劑是乙醇和丙酮化學生物學化學物質(zhì)和蛋白質(zhì)的相互作用第10頁（2）酚類化合物及有機酸沉淀鞣酸（又稱單寧）、苦味酸（即2，4，6-三硝基苯酚）、三氯乙酸、磺酰水楊酸水解類單寧縮合類單寧化學生物學化學物質(zhì)和蛋白質(zhì)的相互作用第11頁單寧-蛋白質(zhì)結合是分子識別經(jīng)典例子。要考慮作為供體多酚和作為受體蛋白質(zhì)分子組成、結構和構型，也要考慮它們協(xié)同作用。Haslam等認為，可用“手-手套”(Hand-in-Glove)模型說明此反應。蛋白質(zhì)分子中疏水基團較集中部位組成“疏水袋”，單寧分子進入“疏水袋”中并經(jīng)過氫鍵加強結合。所以影響單寧與蛋白質(zhì)結合原因有：單寧分子尺寸，分子量大于500時產(chǎn)生較牢靠結合；單寧酚羥基和疏水基數(shù)量多者結合強；含有柔性分子構型者結合強；水溶性低者結合強。所以水解單寧收斂性與其所含疏水基多少有直接關系，縮合單寧則與其聚合程度相關，往往前者收斂性大于后者?；瘜W生物學化學物質(zhì)和蛋白質(zhì)的相互作用第12頁4．聚合物沉淀（1）非離子型聚合物沉淀法（2）聚電解質(zhì)沉淀法羧甲基纖維素、海藻酸鹽、果膠酸鹽和卡拉膠聚丙烯酸聚乙二醇（PEG）化學生物學化學物質(zhì)和蛋白質(zhì)的相互作用第13頁第二節(jié)化學物質(zhì)對蛋白質(zhì)穩(wěn)定作用化學生物學化學物質(zhì)和蛋白質(zhì)的相互作用第14頁蛋白質(zhì)變性：一些物理或化學原因破壞了維持蛋白質(zhì)結構天然狀態(tài)，引發(fā)蛋白質(zhì)理化性質(zhì)改變并造成其生理活性喪失現(xiàn)象蛋白質(zhì)不可逆失活化學原因強酸和強堿氧化劑：分子氧、H2O2、過氧化物(如過氧甲酸)、氧自由基去污劑和表面活性劑：十二烷基硫酸鈉（SDS）變性劑：8~10mol/L脲、6mol/L鹽酸胍、有機溶劑、EDTA重金屬離子和巰基試劑：Hg2＋、Cd2＋、Pb2＋、巰基乙醇化學生物學化學物質(zhì)和蛋白質(zhì)的相互作用第15頁使蛋白質(zhì)穩(wěn)定化學方法（1）固定化（2）添加劑（3）化學修飾共溶劑抗氧化劑和還原劑底物、輔酶金屬離子化學生物學化學物質(zhì)和蛋白質(zhì)的相互作用第16頁第三節(jié)化學物質(zhì)對蛋白質(zhì)側鏈基團共價修飾作用化學生物學化學物質(zhì)和蛋白質(zhì)的相互作用第17頁一、生物體內(nèi)蛋白質(zhì)加合物形成相互作用方式非共價結合共價結合不可逆化學生物學化學物質(zhì)和蛋白質(zhì)的相互作用第18頁1．

可與蛋白質(zhì)發(fā)生反應化合物化學生物學化學物質(zhì)和蛋白質(zhì)的相互作用第19頁2．蛋白質(zhì)分子中可反應基團氨基酸氨基和羧基絲氨酸和蘇氨酸所特有羥基半胱氨酸巰基精氨酸胍基組氨酸咪唑基酪氨酸中酚基色氨酸吲哚基化學生物學化學物質(zhì)和蛋白質(zhì)的相互作用第20頁3．與白蛋白共價結合4．與血紅蛋白共價結合5．與細胞內(nèi)蛋白共價結合化學生物學化學物質(zhì)和蛋白質(zhì)的相互作用第21頁二、特定氨基酸殘基側鏈基團修飾蛋白質(zhì)側鏈基團修飾是經(jīng)過選擇性試劑或親和標識試劑與蛋白質(zhì)分子側鏈上特定功效基團發(fā)生化合反應而實現(xiàn)作用：探測活性部位結構選擇好修飾試劑判斷必需基團性質(zhì)和數(shù)目化學生物學化學物質(zhì)和蛋白質(zhì)的相互作用第22頁1．巰基化學修飾烷基化試劑（碘乙酸、碘乙酰胺）多肽鏈氨基酸次序分析過程中預防半胱氨酸氧化N-乙基馬來酰亞胺有較強專一性和光吸收改變，易于確定反應程度5,5’-二硫-2-硝基苯甲酸（DTNB）化學生物學化學物質(zhì)和蛋白質(zhì)的相互作用第23頁有機汞試劑（對氯汞苯甲酸）

溶于水中形成羥基衍生物，與巰基相互作用時在255nm處光吸收含有較大增強效應化學生物學化學物質(zhì)和蛋白質(zhì)的相互作用第24頁2．氨基化學修飾非質(zhì)子化賴氨酸ε-氨基是蛋白質(zhì)分子中親核反應活性很高基團三硝基苯磺酸（TNBS）與賴氨酸殘基反應，在420nm和367nm能夠產(chǎn)生特定光吸收2,4-二硝基氟苯（DNFD）法、丹磺酰氯（DNS）法和苯異硫氰酸酯（PITC）法都是常見氨基修飾方法?；瘜W生物學化學物質(zhì)和蛋白質(zhì)的相互作用第25頁3．羧基化學修飾水溶性碳化二亞胺類化合物化學生物學化學物質(zhì)和蛋白質(zhì)的相互作用第26頁4．咪唑基化學修飾組氨酸殘基咪唑基能夠經(jīng)過氮原子烷基化或碳原子親核取代來進行修飾。焦碳酸二乙酯（DPC）是最常見修飾組氨酸殘基試劑?；瘜W生物學化學物質(zhì)和蛋白質(zhì)的相互作用第27頁5．酚和脂肪族羥基化學修飾四硝基甲烷（TNM）是酪氨酸殘基修飾最常見修飾試劑化學生物學化學物質(zhì)和蛋白質(zhì)的相互作用第28頁6．胍基化學修飾丁二酮或1，2-環(huán)乙二酮與胍基反應可逆地生成精氨酸-丁二酮復合物化學生物學化學物質(zhì)和蛋白質(zhì)的相互作用第29頁苯乙二醛能夠與精氨酸殘基不可逆結合4-羥基-3-硝基苯乙二醛可使被修飾精氨酸殘基在405nm處含有光吸收效應。對硝基苯乙二醛修飾精氨酸殘基能夠得到含有旋光性惟一產(chǎn)物，在pH9.0情況下能夠用340nm處光吸收值來定量。化學生物學化學物質(zhì)和蛋白質(zhì)的相互作用第30頁三、親和性標識親和性標識試劑優(yōu)點：能夠選擇性地結合在蛋白質(zhì)分子表面上特定部位含有飽和性，與底物或天然配體競爭蛋白質(zhì)分子結合位點。兩種類型光親和標識試劑自殺性抑制劑化學生物學化學物質(zhì)和蛋白質(zhì)的相互作用第31頁第四節(jié)蛋白質(zhì)光譜探針化學生物學化學物質(zhì)和蛋白質(zhì)的相互作用第32頁紫外吸收或熒光光譜進行蛋白質(zhì)定量分析理論基礎：蛋白質(zhì)含有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸殘基，在280nm附近有最大光吸收，而且在340~350nm有熒光發(fā)射。蛋白質(zhì)光譜探針：就是能與蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用無機離子、有機小分子或絡合物，這些物質(zhì)與蛋白質(zhì)結合生成超分子復合物之后，體系光譜性質(zhì)發(fā)生改變，從而能夠提供蛋白質(zhì)濃度或結構方面信息。化學生物學化學物質(zhì)和蛋白質(zhì)的相互作用第33頁一、蛋白質(zhì)吸光探針1．金屬探針（1）雙縮脲法雙縮脲在堿性溶液中與銅離子（Cu2+）生成紫紅色化合物反應，可在540nm測量吸光度紫紅色化學生物學化學物質(zhì)和蛋白質(zhì)的相互作用第34頁（2）Folin-Lowry法產(chǎn)物最大光吸收波長：640nm優(yōu)點：比雙縮脲法靈敏100倍缺點：反應受各種原因干擾，在顯色靈敏度方面存在差異。應用范圍：本法可測定范圍是25~250μg/mL蛋白質(zhì)化學生物學化學物質(zhì)和蛋白質(zhì)的相互作用第35頁（3）二喹啉甲酸法（BCA，bicinchoninicacid）原理：堿性條件下，蛋白質(zhì)分子中肽鍵與銅離子反應生成Cu＋，Cu＋再與BCA反應形成紫色絡合物，在565nm測量吸光度。優(yōu)點：試劑穩(wěn)定，干擾少，各種蛋白質(zhì)之間顯色差異小化學生物學化學物質(zhì)和蛋白質(zhì)的相互作用第36頁2．染料探針原理：利用蛋白質(zhì)與染料結合成沉淀或改變結合染料光吸收特征，借助染料顏色減退或改變程度來測定蛋白質(zhì)含量。λ＝600nm化學生物學化學物質(zhì)和蛋白質(zhì)的相互作用第37頁考馬斯亮藍G-250測蛋白質(zhì)含量λ＝595nm優(yōu)點：使用方便，反應時間短，染色穩(wěn)定，對顯色時間不嚴格要求，抗干擾性強，為常見蛋白濃度測定方法。該法線性范圍1~2μg/mL，是靈敏度最高染料探針分析方法?；瘜W生物學化學物質(zhì)和蛋白質(zhì)的相互作用第38頁二、蛋白質(zhì)熒光探針作為一個好熒光探針應滿足以下條件：①探針分子與蛋白質(zhì)分子某一微區(qū)必須有特異性結合，而且結合比較牢靠。②探針熒光必須對環(huán)境條件敏感。③蛋白質(zhì)分子與探針結合后不影響其原來結構和特征。在滿足這些條件基礎上可進行蛋白質(zhì)測定及與金屬離子結合計量化學等?；瘜W生物學化學物質(zhì)和蛋白質(zhì)的相互作用第39頁常見蛋白質(zhì)熒光探針1-苯氨基-8-萘磺酸（ANS）

與組合蛋白質(zhì)在酸性條件下結合時能產(chǎn)生很強熒光，激發(fā)峰位于375nm，熒光峰位于500nm，可用于組蛋白含量測定化學生物學化學物質(zhì)和蛋白質(zhì)的相互作用第40頁常見蛋白質(zhì)熒光探針αβγδ-四（對磺苯基）卟啉（TPPS4）微量蛋白質(zhì)對TPPS4含有熒光猝滅作用，能夠測定納克級蛋白質(zhì)?；瘜W生物學化學物質(zhì)和蛋白質(zhì)的相互作用第41頁常見蛋白質(zhì)熒光探針2-對甲苯氨基萘-6-磺酸（TNS）1-（N-二甲胺）萘-5-磺酸（DNS）熒光胺αβγδ-四（對羧苯基）卟咻（TCPP）鉻天青S吖啶橙化學生物學化學物質(zhì)和蛋白質(zhì)的相互作用第42頁三、蛋白質(zhì)光散射探針共振光散射技術研究小分子物質(zhì)與蛋白質(zhì)、核