基因組學(xué)與比較基因組學(xué)課件

第十一章基因組學(xué)與比較基因組學(xué)ByHongweiGuo,PekingUniversity,2008.12.29GenomicsandComparativeGenomics基礎(chǔ)分子生物學(xué)期末安排考試時(shí)間：

2009年

1月

12日下午

2:00-4:00考試地點(diǎn)：三教/301(60人)、三教/304(38人)、三教/306(37人)、三教/308(37人)

基因組計(jì)劃基因組（genome）是生物體內(nèi)遺傳信息的集合，是某個(gè)特定物種細(xì)胞內(nèi)全部DNA分子的總和?；蚪M學(xué)（genomics）是指研究并解析生物體整個(gè)基因組的所有遺傳信息的學(xué)科?；蚪M計(jì)劃（GenomeProject）是指對(duì)人類以及其它生物體全基因組的測(cè)序工作(sequencing)。人類基因組計(jì)劃（HumanGenomeProject，HGP）：90年代提出并已基本完成，同40年代原子彈爆炸，60年代人類登月一起被認(rèn)為是二十世紀(jì)科技發(fā)展史上的三大創(chuàng)舉。Publiceffort-strategy:Celera-strategy:SequencingStrategiesCelera’sviewofInternationalConsortiumInternationalConsortium’sviewofCeleraUnfaircompetition:ICdeliveringthesamegoodsbutwithstatefunding.Unfaircompetition:CeleradeliveringthesamegoodsbutcanuseICdata,whileICcannotuseCeleradata.Publiceffort-strategy:

基因組DNA大片段文庫的構(gòu)建

YAC（yeastartificialchromosome,酵母人工染色體）：含有三種必需成分：著絲粒、端粒和復(fù)制起點(diǎn)。是迄今容量最大的克隆載體，插入片段平均長度為200-1000Kbp，最大的可以達(dá)到2Mbp。BAC（Bacterialartificialchromosome），用細(xì)菌的F質(zhì)粒及其調(diào)控基因構(gòu)建了細(xì)菌染色體克隆載體，其克隆能力在125~150Kbp左右。以BAC為基礎(chǔ)的克隆載體形成嵌合體的頻率較低，轉(zhuǎn)化效率高，而且以環(huán)狀結(jié)構(gòu)存在于細(xì)菌體內(nèi)，易于分辨和分離純化，已被科學(xué)界廣泛接受。BAC的構(gòu)建pBAC108L來自細(xì)菌的一個(gè)小型F質(zhì)粒，其中oriS和repE控制了質(zhì)粒的復(fù)制起始，parB和parA控制了拷貝數(shù)。100-150KbpinsertionDNA遺傳標(biāo)記(DNAmarker)第一代DNA遺傳標(biāo)記是RFLP（RestrictionFragmentLengthPolymorphism）。DNA序列上的微小變化，甚至1個(gè)核苷酸的變化，也能引起限制性內(nèi)切酶切點(diǎn)的丟失或產(chǎn)生，導(dǎo)致酶切片段長度的變化。第二代DNA遺傳標(biāo)記SSLP（SimpleSeqeuceLengthPolymorphism)利用了存在于人類基因組中的大量重復(fù)序列，包括重復(fù)單位長度在15-65個(gè)核苷酸左右的小衛(wèi)星DNA（minisatelliteDNA），重復(fù)單位長度在2-6個(gè)核苷酸之間的微衛(wèi)星DNA（microsatelliteDNA）。第三代DNA遺傳標(biāo)記SNP

（singlenucleotidepolymorphism），也是最廣泛的遺傳標(biāo)記，是分散于基因組中的單個(gè)堿基的差異。這種差異包括單個(gè)堿基的缺失和插入，但更常見的是單個(gè)核苷酸的替換，即單核苷酸的多態(tài)性。到目前為止已經(jīng)在人類基因組發(fā)現(xiàn)了超過1000萬個(gè)SNP位點(diǎn)，平均每300bp中就有一個(gè)SNP！RFLPmarkerSSLPmarkersWTmutSNPmarker鳥槍法序列測(cè)定技術(shù)全基因組鳥槍法測(cè)序（shotgunsequencing)技術(shù)：隨機(jī)挑選帶有基因組DNA的質(zhì)粒進(jìn)行末端序列測(cè)定，然后用計(jì)算機(jī)程序進(jìn)行序列拼接。鳥槍法測(cè)序的主要缺點(diǎn)是，隨著所測(cè)基因組總量增大，所需測(cè)序的片段大量增加；其次，高等真核生物（如人類）基因組中有大量重復(fù)序列，導(dǎo)致判斷失誤DNAtargetsampleSHEAR&SIZEe.g.,10Kbp±8%std.dev.EndReads/MatePairsCLONE&ENDSEQUENCE590bp10,000bpMate-PairShotgunDNASequencing大規(guī)模DNA序列拼接

DNA序列拼接問題與組合數(shù)學(xué)中的最短超串問題相似。最短超串問題即給定一個(gè)字符串的集合，找出一最短的字符串稱為超串，并將集合中的任何一元素作為其子串。PopularAssemblersTIGRAssembler(TIGR)Phrap(WashU)CeleraAssembler(Celera,TIGR)Arachne(MITBroad)Phusion(Sanger–usesPhrap)Atlas(BaylorHGSC)AssemblyoftheIndividualSequencesKeepaddingindividualsequencingreadstobuildlargerandfewercontigsAssemblyoftheIndividualSequencesEventuallyallsequencingreads

mergetoasingleconsensussequence(alargecontig)foreachchromosome.鳥槍法測(cè)序技術(shù)不能鑒別高等真核生物基因組中的重復(fù)序列

高通量DNA序列分析技術(shù)

人類基因組計(jì)劃的成功很大程度上得益于有效減少DNA測(cè)序成本的技術(shù)更新。通過改良測(cè)序方法，不斷提升其自動(dòng)化程度，DNA測(cè)序的成本降低了100倍，從20世紀(jì)70-80年代$10/bp降低到本世紀(jì)初$0.1/bp！如果一個(gè)熟練的DNA序列分析人員采取早期80年代方法每天測(cè)定1000bp計(jì)算，人類基因組（約3×109bp）的全序列分析，至少也得需要100名這樣的工人花上100年的時(shí)間才能完成。而2000年代的高通量測(cè)序儀可達(dá)到月測(cè)序1-6Mbp！目前？？？$2/1Mbp3Gbp/machine/dayDNAsequencingtechnologies

?“Classical” –Sangerdideoxysequencing?“NextGeneration”,commercialized

–Roche454Pyrosequencing –Solexa/Illuminacyclicalbaseaddition –ABISOLiDsequencingbyligation?Singlemolecule(tetheredDNApolymerase)

–Heliscope(cyclicalbaseaddition) –VisiGen(realtime,FRET-based)Illumina/SolexaGeneticAnalyzer2000Mb/runAppliedBiosystemsABI3730XL1Mb/dayRoche/454GenomeSequencerFLX100Mb/runAppliedBiosystemsSOLiD3000Mb/runRoche/454:GenomeSequencerFLXRealTimeSequencingbySynthesisChemiluminescencedetectioninpicotiterplatesAmplification:emulsionPCRPyrosequencingupto400,000reads/runonaverage250bases/readupto100Mb/runRoche/454GenomeSequencerFLX100Mb/runPyrosequencing---454SequencingGenomesequencinginmicrofabricatedhigh-densitypicolitrereactorsMargulies,M.Eghold,M.etal.Nature.2005Sep15;437(7057):326-7AsectionofPyrosequencingreadsIllumina/Solexa:GeneticAnalyzerRealTimeSequencingbySynthesisClonalSingleMoleculeArrayAmplification:bridgingPCR60millionreads/runupto50bases/read2Gb/run8channels,app.5mioreads/channelFluorescentlabelsReversible3‘OHblockingIllumina/SolexaGeneticAnalyzer2000Mb/runReversibleterminator-basedsequencing(Solexa)FragmentDNAandligateadaptorsComparisonWGS454SolexaCloningYesNoNoChemistrySangerpyrosequencingreversibleterminatorsCost$$$$to$$$$$$$$$$$AccuracyConsensus99.99%Singleread>99.5%;Consensus>99.99%?AssemblyBestBetterBadGapClosureandFinishingToughTougherPossible?RealTimeSequencingbyLigationEmulsionPCRandBeadsonslides85millionreads/runUpto35bases/read3Gb/rundualfluorescentlabels8individualchannels/flowcell2flowcells/runAppliedBiosystemsSOLiD3000Mb/runOligonucleotide

Ligation&Detection(SOLiD)SOLiD:Substrateattachment;dibaseprobesMakesequencinglibrarybyshearingandadapterligationAttachDNAfragmentstobeadsandamplifypoloniesinemulsionAttachbeadstoslideSOLiD:SequencingligationcyclesSOLiD:DataCollectionandImageAnalysisSOLiD:DecodingthesequenceMardis2008Comparisonof“NextGeneration”SequencingTechnologiesApplicationsGeneticAnalyzerSingleMolecule

SequencingTechnologies:onthehorizon

?ArrayoftetheredDNApolymerasemolecules?Boundtotemplatestrand+primer?Heliscope –Cyclicalbaseaddition(similartoSolexa)?VisiGen –Realtime,imagingFRETflashes –Hopefulprediction:1Mb/sec“NextGeneration”Sequencing

Technologies:RateLimitingFactors

?Frontend:Makingthesequencinglibrary?Backend:Bioinformaticstomakesenseof

the“sequencetsunami”---essemblyWhatdowesequence?denovogenomesequencinggenomeresequencing(SNPidentification)metagenomesorcomplexsamplestranscriptomeprofilingsmallRNAidentification(applications)ExamplesofApplicationsof“NextGeneration”SequencingTechnologiesBestfor“re-sequencing”,i.e.,aligninggeneratedsequencetoareferencegenomeNextgenerationDNAtechnologiesmayreplacemicroarraysforsomeapplicationsShendure&Ji2008The“$10,000humangenomesequencing”prize?Tothefirstteamthatcanbuildadeviceanduseittosequence:–100humangenomeswithin10daysorless,–Accuracy:atmost1errorper100,000bases,–Accuratecoverageofatleast98%ofthegenome,–Recurringcostofnomorethan$10,000(US)pergenome.?Prize:$10million?Deadline:12:01AMPST,October4,2013.?Donors:XFoundation,J.CraigVenterFoundationHumanHapMapProjectHapMap的構(gòu)建分為三個(gè)步驟：（a）在多個(gè)個(gè)體的DNA樣品中鑒定單核苷酸多態(tài)性（SNPs）；（b）將群體中頻率大于1%的那些共同遺傳的相鄰SNPs組合成單體型；（c）在單體型中找出用于識(shí)別這些單體型的標(biāo)簽SNPs。通過對(duì)圖中的三個(gè)標(biāo)簽SNPs進(jìn)行基因分型，可以確定每個(gè)個(gè)體擁有哪一個(gè)單體型。SCIENCE315:1781(30MARCH2007)Metagenomesor

complexsamples轉(zhuǎn)錄圖（transcriptprofiling）

基因轉(zhuǎn)錄圖（cDNA圖），或者基因的cDNA片段圖，即表達(dá)序列標(biāo)簽圖（EST，expressedsequencetag），是基因組圖的重要組成部分。大規(guī)模生產(chǎn)EST的主要程序如下：分離特定組織在某一發(fā)展階段或某種生理?xiàng)l件下的總mRNA，合成雙鏈cDNA，克隆到plasmid中并進(jìn)行兩端測(cè)序。PyrosequencingProvidesEvidenceforNovelTranscriptsandTranscriptArchitecture

smallRNAidentification

(i.e.microRNA)到2006年底已完成的基因組項(xiàng)目（）

根據(jù)2007年1月的數(shù)據(jù)，全球已啟動(dòng)2296個(gè)基因組項(xiàng)目，其中607個(gè)項(xiàng)目已經(jīng)完成，已經(jīng)公開發(fā)表481個(gè)基因組序列，包括403個(gè)細(xì)菌基因組，33個(gè)古細(xì)菌基因組和45個(gè)真核生物基因組。其它基因組計(jì)劃到2006年12月全世界主要基因組計(jì)劃的進(jìn)展情況

Whydowesequencegenomes?Tocatalogallthegenespresentinoneorganism.Tocomparethegenecontentofoneorganismtoanotherorganism.Tostudygene/genomeevolution.Tostudyorganismalevolution.Asafoundationforfutureexperimentation.不同模式生物基因組的比較物種基因組大小估計(jì)基因數(shù)尿殖道支原體

Mycoplasmagenitalium580Kb467肺炎支原體

Mycoplasmapneumoniae816Kb677流感嗜血桿菌

Haemophilusinfluenzae1.8Mb1709枯草芽孢桿菌

Bacillussubtilis4.2Mb4100大腸桿菌

Escherichiacoli4.6Mb4288釀酒酵母

Saccharomycescerevisiae13Mb6275線蟲

Caenorhabditiselegans100Mb18891擬南芥

Arabidopsisthaliana125Mb25498果蠅

Drosophilamelanogaster165Mb14113人類

Homosapiens3Gb約2.5萬比較基因組學(xué)（Comparativegenomics）比較基因組學(xué)的威力在于它能根據(jù)對(duì)一種生物相關(guān)基因的認(rèn)識(shí)來理解、詮釋甚至克隆分離另一種生物的基因。遠(yuǎn)緣基因組間的比較為認(rèn)識(shí)生物學(xué)機(jī)制的普遍性，尋找研究復(fù)雜生理和病理過程所需的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ吞峁┝死碚撘罁?jù)，而近緣基因組間的比較則為認(rèn)識(shí)基因結(jié)構(gòu)與功能等細(xì)節(jié)提供了參數(shù)。物種名基因數(shù)目轉(zhuǎn)錄因子數(shù)量比例擬南芥約2938815335.9酵母約58852093.5線蟲約188916693.5果蠅約133796354.5FunctionalCategoriesinEukaryoticProteomesApplicationstoMedicineAkeyapplicationofhumangenomeresearchistofinddiseasegenesbypositionalcloningThismethodinvolvesmappingthechromosomalregioncontainingthegenebylinkageanalysisinaffectedfamiliesThehumangenomicse