杜氏肌營養(yǎng)不良癥DMD與遺傳

杜氏肌營養(yǎng)不良癥DMD與遺傳目前一頁\總數(shù)三十六頁\編于九點疾病概述目前二頁\總數(shù)三十六頁\編于九點DystrophiemusculairedeDuchenneDMD，杜氏肌營養(yǎng)不良，假肥大型肌營養(yǎng)不良Dystrophine（Dys）抗肌萎縮蛋白缺失MaladiemonogeniqueHétédité:XRDuchenne,unneurologistefran?ais,adonnéunedescriptioncomplètede13maladiesattaints目前三頁\總數(shù)三十六頁\編于九點PhénotypeCliniquedelaDMDLesmusclesjumeauxdesjambsdesgar?onsatteintsapparaissentqu’ilssoientdéveloppésMaisasthéniques假性肌肥大Tissuconjonctifetlagraisse目前四頁\總數(shù)三十六頁\編于九點PhénotypeCliniquedelaDMD1~2ansnormal3~5ansdéveloppeunefaiblessemusculaireDèsl’agede12ansconfinéenchaiseroulantAu-delàdel’agede20ansnesurvivraQI智商unechutemodéréd’environ20points目前五頁\總數(shù)三十六頁\編于九點LabCréatinekinase(niveausérique)血清濃度50~100foislalimitesupérieuredelanormaledanslesstadesprécoces目前六頁\總數(shù)三十六頁\編于九點DystrophiemusculairedeBeckerlegènedeladystrophieBeaucoupplusatténué緩和Aprèsl’agede16ansparvientàmarcher之后多年也可行走目前七頁\總數(shù)三十六頁\編于九點DMD與BMD的差異DMD——致死BMD——存活率非常高(70%),易產(chǎn)生新的突變目前八頁\總數(shù)三十六頁\編于九點遺傳目前九頁\總數(shù)三十六頁\編于九點遺傳特征Hétédité:XR親代生殖細胞子代XH

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正常女性正常男性女性攜帶者男性患者目前十頁\總數(shù)三十六頁\編于九點遺傳特征（1）系譜中常常只有男性患者（2）父母都無病時，女兒則不會發(fā)病，兒子可能發(fā)??；（3）由于交叉遺傳，患者的同胞、舅舅、姨表兄弟、外甥常常為本病患者；（4）由于男性患者的子女都正常，故可見隔代遺傳；（5）女性患者的父親一定是患者,母親一定是攜帶者。目前十一頁\總數(shù)三十六頁\編于九點DMD—男女差異男性致死1/3néomutation,2/3mèreporteuse女性攜帶者Majorité無任何臨床表現(xiàn)，70%肌酸激酶(Créatinekinase)增高8%輕微的肌肉癥狀,有些還有嚴重的近心端肌肉障礙。女性很少患有DMD目前十二頁\總數(shù)三十六頁\編于九點母系鑲嵌某男性是家族中DMD的先證者他的母親沒有攜帶突變基因遺傳位點上發(fā)生了新近的突變大約5%-15%的這些發(fā)生的例子是由于母系生殖鑲嵌目前十三頁\總數(shù)三十六頁\編于九點DMD—發(fā)病率較高Gar?onsnouveau-nés：1/3300Untauxdemutation：1/10000每天一個男性每11-12秒會產(chǎn)生1個新突變的精子（8x107parjour）目前十四頁\總數(shù)三十六頁\編于九點基因與蛋白目前十五頁\總數(shù)三十六頁\編于九點GèneDMD人類最大的基因之一，2300kb位于Xp??占X染色體全長的1.5%99%的序列由內(nèi)含子組成編碼區(qū)包括79個外顯子及7個組織特異性的啟動子其mRNA序列長114kb主要表達于骨骼肌、心肌，少量表達于腦組織目前十六頁\總數(shù)三十六頁\編于九點7個組織特異性的啟動子,B(腦皮質(zhì))、M(肌組織)、P(蒲肯野纖維)、R(視網(wǎng)膜)、B3(腦組織)、S(施旺細胞)和G(肌組織之外的多種組織器官)B型：大腦皮層、海馬回神經(jīng)元P型：小腦蒲肯野細胞,在骨骼肌也有極少量的表達M型：骨骼肌、心肌組織,同時在腦神經(jīng)膠質(zhì)細胞也有少量表達目前十七頁\總數(shù)三十六頁\編于九點Dystrophin抗肌萎縮蛋白全長型dystrophin是一種427kDa的棒狀蛋白,長約150nm,分為4個區(qū)域，氨基端區(qū)域中央棒狀區(qū)富含半胱氨酸區(qū)域羧基端區(qū)域目前十八頁\總數(shù)三十六頁\編于九點A.位于Xp21,黑色的豎線代表分布于整個基因上的79個外顯子,黑色箭頭指示各組織特異性啟動子不同的啟動位點,分別以不同的字母縮寫來代表,B(腦皮質(zhì))、M(肌組織)、P(蒲肯野纖維)、R(視網(wǎng)膜)、B3(腦組織)、S(施旺細胞)和G(肌組織之外的多種組織器官)。B.不同形式的dystrophin蛋白及其區(qū)域組成,氨基端、中央棒狀區(qū)域、富含半胱氨酸區(qū)域及羧基端區(qū)域目前十九頁\總數(shù)三十六頁\編于九點DMD患者：60%基因突變表現(xiàn)為缺失一般在基因的5’端和中央棒區(qū)兩個區(qū)域BMD患者：可能缺失了一個或者幾個基因序列dystrophine蛋白的特點DMD患者體內(nèi)很少或者沒有BMD患者體內(nèi)有表達，但是仍然比正常人少目前二十頁\總數(shù)三十六頁\編于九點目前二十一頁\總數(shù)三十六頁\編于九點臨床治療目前二十二頁\總數(shù)三十六頁\編于九點DMD治療目前為止尚無治療DMD的有效方法藥物治療（對癥治療）：糖皮質(zhì)激素治療短期口服激素治療可增強骨骼肌力量和功能，并可能在更長時間內(nèi)穩(wěn)定骨骼肌力量和功能基因治療：利用不直接引起人類疾病，免疫原性較小的腺相關(guān)病毒（AAV）為載體，導(dǎo)入人工剪裁的Dys基因修正肌肉組織(占全身體重40％)的基因缺陷遇到各種各樣的困難康復(fù)治療、矯形治療、社會心理治療等目前二十三頁\總數(shù)三十六頁\編于九點臨床檢測目前二十四頁\總數(shù)三十六頁\編于九點產(chǎn)前診斷和雜合子診斷90%攜帶者孕婦中產(chǎn)前診斷可能有至少95%的精確度由于基因突變導(dǎo)致基因的缺失或者多倍體的家庭中，60%-70%可以直接通過southern印跡雜交技術(shù)或者PCR技術(shù)來測量胎兒的DNA得到在其余的基因缺失不能明確診斷出來的家庭中，可以通過鍵的標記來完成產(chǎn)前診斷與患病男性結(jié)婚的女性中75%的女性：DNA檢查、CK血清濃度檢查——胎兒是否攜帶25%女性難檢測：第一，在病程的一些時期，基因缺陷是無法被檢查出來的（可能情況就是等位基因是正常的或者突變的等位基因位于另外一條X染色體上）第二，一些家庭的一些成員的樣本丟失了第三，兩個標記基因之間的基因重組在X染色體傳入下一代之前發(fā)生了（母系鑲嵌）目前二十五頁\總數(shù)三十六頁\編于九點產(chǎn)前檢測生物化學(xué)檢查——CK血清濃度基因診斷多重PCRSouthernblot探針連接多重擴增(MLPA)變性高效液相色譜(DHPLC)抗肌萎縮蛋白的免疫組化目前二十六頁\總數(shù)三十六頁\編于九點多重PCR方法——DMD、BMD相關(guān)基因的缺失、重復(fù)可直接檢出DMD／BMD的缺失型突變65％的患者為基因缺失所致多重PCR:使用多對引物的針對DMD基因的缺失熱區(qū)，利用多對PCR引物在一個PCR管中同時擴增多個外顯子，通過和正常對照相比較而判斷外顯子的缺失情況目前二十七頁\總數(shù)三十六頁\編于九點多重PCR方法優(yōu)點：1、具有敏感、特異性強和可重復(fù)性好的優(yōu)點2、需要的DNA量少、操作簡單局限性:1.女性攜帶者——正常x染色體的屏蔽效應(yīng)，無法檢出2.多重PCR體系內(nèi)，由于引物之間的相互競爭，有時也會出現(xiàn)個別片段擴增的假陰性結(jié)果。（對初次擴增呈陰性結(jié)果的片段進行再次擴增，以驗證結(jié)果的準確性）目前二十八頁\總數(shù)三十六頁\編于九點Southernblot方法——DMD、BMD相關(guān)基因的缺失、重復(fù)是一種常用的DNA定量的分子生物學(xué)方法原理將待測的DNA樣品固定在固相載體(硝酸纖維膜或尼龍膜)上與同位素標記的核酸探針進行雜交在與探針有同源序列的固相DNA的位置上顯示出雜交信號通過檢測信號的有無、強弱可以對樣品定性、定量，從而計算出轉(zhuǎn)入的拷貝數(shù)目前二十九頁\總數(shù)三十六頁\編于九點Southernblot方法優(yōu)點：Southern雜交準確性高、特異性強缺點：1、不經(jīng)過靶片段的擴增(PCR)，一般每個電泳通道需要10~30μg的DNA，在實際操作中就需較大量的DNA樣品2、Soutllem雜交不能確定缺失的準確外顯子范圍，對檢測女性重復(fù)突變(duplication)或三重重復(fù)(triplication)攜帶者存在困難3、由于DMD基因很大，需要6到8個cDNA探針，雜交反應(yīng)才能覆蓋整個DMD基因，要1～2周時間用來分析，勞動量大4、需要使用放射性同位素作為示蹤物，會對工作環(huán)境帶來污染目前三十頁\總數(shù)三十六頁\編于九點多重探針連接依賴性擴增技術(shù)MLPA

multiplexprobeligationdependentamplification原理針對所有需要檢測突變的DNA序列，設(shè)計多對特異探針固定在尼龍膜上和待測樣品DNA雜交然后洗膜（正常序列和探針雜交后不被洗脫）利用連接酶把探針連接起來使用一套通用引物進行PCR擴增PCR產(chǎn)物用PCR儀進行分析，DNA片段的缺失／重復(fù)以及拷貝數(shù)以測序儀得到信號的有無及信號的峰高或面積進行計算目前三十一頁\總數(shù)三十六頁\編于九點優(yōu)點：可以在1個PCR管中完成多達40個外顯子的缺失／重復(fù)檢測專門用于DMD缺失／重復(fù)檢測的試劑盒，通過2個PCR反應(yīng)就可以完成79個外顯子及其非翻譯序列的缺失／重復(fù)突變篩查靈敏度高、操作簡單、可重復(fù)性好、經(jīng)濟快捷目前三十二頁\總數(shù)三十六頁\編于九點DMD患者(A)及其母親(B)的20-47號外顯子的MLPA檢測結(jié)果目前三十三頁\總數(shù)三十六頁\編于九點變性高效液相色譜DHPLCdenaturinghighperformanceliquidchromatography原理用離子對逆向?qū)游龇ǚ蛛x并檢測異源雙鏈通過三乙基醋酸鈉（TEAA)作為橋分子，帶正電的氨基與核酸分子帶負電電荷的磷酸基相互作用，烷基端與色譜