發(fā)光免疫技術

發(fā)光免疫技術發(fā)光免疫技術第1頁第十章化學發(fā)光免疫

分析技術第一節(jié)慨述一、化學發(fā)光二、化學發(fā)光效率第二節(jié)化學發(fā)光劑和標識技術一、化學發(fā)光劑二、發(fā)光劑標識技術發(fā)光免疫技術第2頁第三節(jié)化學發(fā)光免疫分析類型一、直接化學發(fā)光免疫分析二、化學發(fā)光酶免疫分析三、電化學發(fā)光免疫分析四、臨床應用思索題小結發(fā)光免疫技術第3頁發(fā)光免疫分析:是將發(fā)光分析和免疫反應相結合而建立起來一個新檢測微量抗原或抗體新型標識免疫分析技術。

發(fā)光免疫技術第4頁

第一節(jié)概述

發(fā)光免疫技術第5頁放射免疫技術酶免疫技術發(fā)光免疫技術三大經典標識技術發(fā)光免疫技術第6頁

發(fā)光:是指分子或原子中電子吸收能量后，由基態(tài)（較低能級）躍遷到激發(fā)態(tài)（較高能級），然后再返回到基態(tài)，并釋放光子過程。依據形成激發(fā)態(tài)分子能量起源不一樣可分為:光照發(fā)光、生物發(fā)光、化學發(fā)光等。

發(fā)光免疫技術第7頁

光照發(fā)光（photoluminescence）是指發(fā)光劑（熒光素）經短波長入射光照射后，電子吸收能量躍遷到激發(fā)態(tài)，在其回復至基態(tài)時，發(fā)射出較長波長可見光（熒光）。

生物發(fā)光（bioluminescence）是指發(fā)生在生物體內發(fā)光現象，如螢火蟲發(fā)光，反應底物為螢火蟲熒光素，在熒光素酶催化下，利用ATP能，生成激發(fā)態(tài)氧化型熒光素，它在回復基態(tài)時多出能量以光子形式釋放出來。發(fā)光免疫技術第8頁

化學發(fā)光（chemiluminescence）是指伴隨化學反應過程所產生光發(fā)射現象。一些物質(發(fā)光劑)在化學反應時，吸收了反應過程中所產生化學能，使反應產物分子或反應中間態(tài)分子中電子躍遷到激發(fā)態(tài)，當電子從激發(fā)態(tài)回復到基態(tài)時，以發(fā)射光子形式釋放出能量，這一現象稱為化學發(fā)光。一、化學發(fā)光發(fā)光免疫技術第9頁

一些化學反應能釋放足夠能量把參加反應物質激發(fā)到能發(fā)射光電子激發(fā)態(tài)，若被激發(fā)是一個反應產物分子，則這種反應過程叫直接化學發(fā)光。反應過程可簡單地描述以下：

A十BC*C*C＋h·γ其中γ為光子，C*表示C處于單線激發(fā)態(tài)。

發(fā)光免疫技術第10頁若激發(fā)能傳遞到另一個未參加化學反應分子D上，使D分子激發(fā)到電子激發(fā)態(tài)，D分子從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時發(fā)光，這種過程叫間接化學發(fā)光。反應過程可表示以下：

A十BC*C*十DC十D*D*D十h·γ發(fā)光免疫技術第11頁

化學發(fā)光效率決定于生成激發(fā)態(tài)產物分子化學激發(fā)效率（φCE）和激發(fā)態(tài)分子發(fā)射效率（φEM）?；瘜W發(fā)光反應發(fā)光效率、光輻射能量大小以及光譜范圍，完全由發(fā)光物質性質所決定，每一個發(fā)光反應都含有其特征性化學發(fā)光光譜和不一樣化學發(fā)光效率。二、化學發(fā)光效率發(fā)光免疫技術第12頁第二節(jié)化學發(fā)光劑和標識技術發(fā)光免疫技術第13頁

在化學發(fā)光反應中參加能量轉移并最終以發(fā)射光子形式釋放能量化合物，稱為化學發(fā)光劑或發(fā)光底物。

一、化學發(fā)光劑發(fā)光免疫技術第14頁能作為化學發(fā)光劑條件：①發(fā)光量子產率高；②它物理-化學特征要與被標識或測定物質相匹配；③能與抗原或抗體形成穩(wěn)定偶聯結合物；④其化學發(fā)光常是氧化反應結果；⑤在所使用濃度范圍內對生物體沒有毒性。發(fā)光免疫技術第15頁㈠直接化學發(fā)光劑

直接化學發(fā)光劑在發(fā)光免疫分析過程中不需酶催化作用，直接參加發(fā)光反應，它們在化學結構上有產生發(fā)光特有基團，可直接標識抗原或抗體。

發(fā)光免疫技術第16頁

1.吖啶酯在堿性條件下被H2O2氧化時,發(fā)出波長為470nm光，含有很高發(fā)光效率，其激發(fā)態(tài)產物N-甲基吖啶酮是該發(fā)光反應體系發(fā)光體。

發(fā)光免疫技術第17頁2．三聯吡啶釕

三聯吡啶釕[RU(bpy)3]2+是電化學發(fā)光劑，它和電子供體三丙胺（TPA）在陽電極表面可同時失去一個電子而發(fā)生氧化反應。三聯吡啶釕發(fā)光免疫技術第18頁電化學發(fā)光劑反應原理

發(fā)光免疫技術第19頁㈡酶促反應發(fā)光劑：是利用標識酶催化作用，使發(fā)光劑（底物）發(fā)光，這一類需酶催化后發(fā)光發(fā)光劑稱為酶促反應發(fā)光劑。1．魯米諾及其衍生物

2．AMPPD發(fā)光免疫技術第20頁1．魯米諾魯米諾發(fā)光原理發(fā)光免疫技術第21頁魯米諾增強發(fā)光反應原理發(fā)光免疫技術第22頁2．AMPPD〔3-(2‘-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3“-磷酰氧基)苯-1,2-二氧雜環(huán)丁烷〕〕發(fā)光免疫技術第23頁1.碳二亞胺（EDC）縮正當

二、發(fā)光劑標識技術發(fā)光免疫技術第24頁2.過碘酸鈉氧化法

發(fā)光免疫技術第25頁3．重氮鹽偶聯法發(fā)光免疫技術第26頁4.N-羥基琥珀酰亞胺活化法

發(fā)光免疫技術第27頁

1．發(fā)光劑選擇

2．被標識蛋白質性質

3．標識方法選擇

4．原料比

5．標識率

6．溫度

7．純化與保留影響標識原因發(fā)光免疫技術第28頁第三節(jié)化學發(fā)光免疫分析類型

發(fā)光免疫技術第29頁

用吖啶酯直接標識抗體(抗原)，與待測標本中對應抗原(抗體)發(fā)生免疫反應后，形成固相包被抗體-待測抗原-吖啶酯標識抗體復合物，這時只需加入氧化劑（H2O2）和NaOH使成堿性環(huán)境，吖啶酯在不需要催化劑情況下分解、發(fā)光。由集光器和光電倍增管接收、統計單位時間內所產生光子能，這個別光積分與待測抗原量成正比，可從標準曲線上計算出待測抗原含量。一、直接化學發(fā)光免疫分析發(fā)光免疫技術第30頁發(fā)光YYY磁微粒被測抗原+抗體+帶丫啶酯標識物抗體YYYYYYYYYYY沖洗后---夾心法（1）加入H2O2（pH<10）（2）加入堿（pH>10）直接化學發(fā)光機理發(fā)光免疫技術第31頁磁微粒模式圖YYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY特點抗原和抗體結合與未結合個別易分離磁微粒技術發(fā)光免疫技術第32頁

化學發(fā)光酶免疫分析（chemiluminescenceenzyme

immunoassay，CLEIA）是用參加催化某一化學發(fā)光反應酶如辣根過氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶(ALP)來標識抗原或抗體，在與待測標本中對應抗原(抗體)發(fā)生免疫反應后，形成固相包被抗體-待測抗原-酶標識抗體復合物，經洗滌后，加入底物(發(fā)光劑)，酶催化和分解底物發(fā)光，由光量子閱讀系統接收，光電倍增管將光信號轉變?yōu)殡娦盘柌⒓右苑糯?，再把它們傳送至計算機數據處理系統，計算出測定物濃度。二、化學發(fā)光酶免疫分析發(fā)光免疫技術第33頁該分析系統采取辣根過氧化物酶（HRP）標識抗體(或抗原)，在與反應體系中待測標本和固相載體發(fā)生免疫反應后，形成固相包被抗體-待測抗原-酶（HRP）標識抗體復合物，這時加入魯米諾發(fā)光劑、H2O2和化學發(fā)光增強劑使產生化學發(fā)光。㈠辣根過氧化物酶標識化學發(fā)光免疫分析發(fā)光免疫技術第34頁辣根過氧化物酶標識化學發(fā)光免疫分析示意圖

發(fā)光免疫技術第35頁該分析系統以堿性磷酸酶標識抗體(或抗原)，在與反應體系中待測標本和固相載體發(fā)生免疫反應后，形成固相包被抗體-待測抗原-酶標識抗體復合物，這時加入AMPPD發(fā)光劑，堿性磷酸酶使AMPPD脫去磷酸根基團而發(fā)光。

㈡堿性磷酸酶標識化學發(fā)光免疫分析發(fā)光免疫技術第36頁堿性磷酸酶標識化學發(fā)光免疫分析示意圖

發(fā)光免疫技術第37頁分析步驟分配樣品,磁顆粒和試劑孵育使反應物結合在磁場中清洗去除未結合物質加入底物產生信號孵育,促使信號產生信號檢測發(fā)光免疫技術第38頁電化學發(fā)光免疫分析（electrochemiluminescenceimmunoassay，

ECLIA）是以電化學發(fā)光劑三聯吡啶釕標識抗體(抗原)，以三丙胺(TPA)為電子供體，在電場中因電子轉移而發(fā)生特異性化學發(fā)光反應，它包含電化學和化學發(fā)光兩個過程。

三、電化學發(fā)光免疫分析發(fā)光免疫技術第39頁在電化學發(fā)光免疫分析系統中，磁性微粒為固相載體包被抗體(抗原)，用三聯吡啶釕標識抗體(抗原)，在反應體系內待測標本與對應抗原(抗體)發(fā)生免疫反應后，形成磁性微粒包被抗體-待測抗原-三聯吡啶釕標識抗體復合物，這時將上述復合物吸入流動室，同時引人TPA緩沖液。當磁性微粒流經電極表面時，被安裝在電極下面電磁鐵吸引住，而未結合標識抗體和標本被緩沖液沖走。與此同時電極加壓，開啟電化學發(fā)光反應，使三聯吡啶釕和TPA在電極表面進行電子轉移，產生電化學發(fā)光，光強度與待測抗原濃度成正比。發(fā)光免疫技術第40頁電化學發(fā)光免疫分析示意圖發(fā)光免疫技術第41頁電化學發(fā)光免疫測定示意圖發(fā)光免疫技術第42頁標識磁顆粒在電場中發(fā)光工作示意圖發(fā)光免疫技術第43頁1.甲狀腺激素

2．生殖激素

3．垂體激素和皮質激素

4．貧血因子

5．腫瘤標志物

6．感染性疾病

7．糖尿病胰島素、血清C-肽、血漿胰高糖素等。

8．心臟標志物

9．病毒標識物

10．過敏性疾病

11．治療藥品監(jiān)測

四、臨床應用發(fā)光免疫技術第44頁1．什么是發(fā)光免疫分析？什么是化學發(fā)光免疫分