分子診斷劉斌

分子診斷劉斌分子診斷劉斌第1頁

腫瘤發(fā)生根本原因是因?yàn)榛虍惓８淖円l(fā)。伴隨分子生物學(xué)發(fā)展，尤其是人類基因組計(jì)劃順利實(shí)施、人類基因組序列剖析、相關(guān)基因功效識(shí)別，對(duì)腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸機(jī)制有了更深入了解，使人類除了能更早期發(fā)覺及診療腫瘤外，還可預(yù)測人群或個(gè)體發(fā)生腫瘤風(fēng)險(xiǎn)（腫瘤易感性）、病因檢測、腫瘤惡性特征、對(duì)特定治療伎倆反應(yīng)（療效預(yù)測）、轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)可能與早期發(fā)覺等，進(jìn)行腫瘤診療、分類、判斷預(yù)后及指導(dǎo)治療。分子診斷劉斌第2頁

如今檢測癌患者基因狀態(tài)有很多方法：

IHC，F(xiàn)ISH，CISH，SouthernBlot，PCR，RealTimePCR?，F(xiàn)如今FISH技術(shù)已應(yīng)用于實(shí)體瘤、血液腫瘤、產(chǎn)前產(chǎn)后多個(gè)領(lǐng)域。分子診斷劉斌第3頁熒光原位雜交Fluorescenceinsituhybridization原理利用DNA堿基正確互補(bǔ)性，將直接標(biāo)識(shí)了熒光單鏈DNA(探針)和與其互補(bǔ)目標(biāo)樣本DNA(玻片上標(biāo)本)雜交,經(jīng)過觀察熒光信號(hào)在染色體上位置反映對(duì)應(yīng)染色體情況FISH分子診斷劉斌第4頁分子診斷劉斌第5頁FISH檢測類型基因過表示檢測基因突變及其檢測基因易位與重排染色體數(shù)目標(biāo)檢測端粒酶與腫瘤關(guān)系檢測分子診斷劉斌第6頁一.基因過表示檢測1.對(duì)HER2檢測檢測方法檢測指標(biāo)優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)IHCHER2蛋白費(fèi)用低光鏡即可觀察結(jié)果準(zhǔn)確性差，判斷主觀性強(qiáng)，假陽性、陰性率高CISHHER2DNA光鏡即可觀察結(jié)果對(duì)低倍擴(kuò)增及染色體非整倍擴(kuò)增檢測靈敏度下降FISHHER2DNA對(duì)于低倍、高倍及染色體非整倍性擴(kuò)增檢測準(zhǔn)確性高，靈敏度特異性好，結(jié)果判斷比較客觀，是HER2基因檢測“金指標(biāo)”相對(duì)費(fèi)用較高其中FISH是FDA同意方法，被譽(yù)為“金標(biāo)準(zhǔn)”。分子診斷劉斌第7頁ICH赫賽汀分子診斷劉斌第8頁

FISH技術(shù)對(duì)HER2基因檢測HER-2基因?yàn)橹掳┗?，位?7q11.2-q12可編碼跨膜蛋白，基因有擴(kuò)增乳腺癌對(duì)三苯氧胺不敏感。HER-2基因擴(kuò)增是決定Herceptin是否有效關(guān)鍵性指標(biāo)。分子診斷劉斌第9頁赫賽汀(Herceptin)抗腫瘤機(jī)制

阻斷異常信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)增強(qiáng)抗體依賴性細(xì)胞毒作用分子診斷劉斌第10頁乳腺癌和胃癌中HER2基因擴(kuò)增比率所做乳腺癌中HER2基因檢出陽性率為65%；胃癌中HER2基因檢出陽性率為35.7%。標(biāo)本HER2總數(shù)陽性例數(shù)乳腺癌2617胃癌145總計(jì)40例分子診斷劉斌第11頁2.非小型細(xì)胞肺癌中EGFR基因擴(kuò)增檢測

EGFR擴(kuò)增EGFR無擴(kuò)增分子診斷劉斌第12頁

NSCLC中EGFR基因擴(kuò)增鱗癌擴(kuò)增為80%左右，腺癌與大細(xì)胞癌為60%左右基因擴(kuò)增能引發(fā)EGFR酪氨酸激酶活化，激發(fā)其下游一系列信號(hào)傳導(dǎo)路徑，促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展，基因擴(kuò)增與酪氨酸激酶抑制劑敏感性相關(guān)基因擴(kuò)增病人用藥有效率達(dá)38.9%，無擴(kuò)增病人用藥有效率在9.8%分子診斷劉斌第13頁

EGFR功效

EGFR在各種上皮性腫瘤高表示,其過表示與腫瘤細(xì)胞增殖、活動(dòng)性、粘連性、侵襲性、凋亡抑制和血管生成相關(guān),最終造成細(xì)胞轉(zhuǎn)化、增殖,抵抗細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞生存,與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、臨床分期、生存期、預(yù)后和對(duì)治療反應(yīng)相關(guān)。分子診斷劉斌第14頁TKGenetranscriptionCellCycleProgression抗凋亡CancerATPEGFR變異分子診斷劉斌第15頁當(dāng)前應(yīng)用于NSCLC靶向治療藥品吉非替尼(gefitinib,ZD-1839,商品名Iressa

FDAapproved)厄洛替尼(erlotinib,OSI-774,商品名TarcevaFDAapproved)西妥昔單抗:(cetuximabFDAapproved)

分子診斷劉斌第16頁二.基因突變及其檢測Real-time檢測基因突變?cè)鞹aqMan探針機(jī)理:DNA聚合酶在延伸階段把探針切碎，產(chǎn)熒光基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)分開，于是熒光得以檢測。分子診斷劉斌第17頁EGFR基因突變突變率在33%左右，其中腺癌高達(dá)48%（董強(qiáng)剛等）東方亞裔顯著高于高加索人種、女性高于男性、非吸煙高于吸煙EGFR19、21外顯子突變占95%左右EGFR變異使EGFR酪氨酸激酶ATP結(jié)合位點(diǎn)一些關(guān)鍵基團(tuán)發(fā)生重構(gòu),使得小分子酪氨酸激酶抑制劑更易與之結(jié)合，增強(qiáng)了與ATP競爭性抑制劑相互作用全球突變型NSCLC用Iressa/Tarceva有效率約80%；無突變NSCLC用ressa/Tarceva有效率約10%。

分子診斷劉斌第18頁Real-time檢測EGFR19、21突變分子診斷劉斌第19頁K-RAS基因突變檢測KRAS基因?qū)儆赗AS家族一員，包含K-RAS,N-RAS,H-RAS含有GTP酶活性，活化狀態(tài)與GTP結(jié)合，失活與GDP結(jié)合，絕大個(gè)別細(xì)胞是與GDP結(jié)合非活化狀態(tài)參加調(diào)整細(xì)胞生長、增殖、分化與凋亡15-20%NSCLC存在RAS基因突變，其中90%以上是K-RAS突變，12號(hào)密碼子突變占80%以上。而腺癌病人突變占30%，K-RAS突變與吸煙親密相關(guān)，終生未吸煙未發(fā)覺K-RAS基因突變與EGFR基因突變存在排斥性是Gefitinib與Erlotinib原發(fā)耐藥分子標(biāo)識(shí)之一分子診斷劉斌第20頁

在直腸癌中K-ras基因突變患者不會(huì)從EGFR單抗靶向治療中獲益，K-ras野生型患者對(duì)cetuximab/Erbitux（愛必妥）和panitumumab/Vectibix（維克替比）單藥或與基礎(chǔ)化療聯(lián)合治療反應(yīng)率顯著大于突變型患者。野生型分子診斷劉斌第21頁現(xiàn)臨床通常將EGFR和K-RAS基因聯(lián)合檢測，來針對(duì)非小細(xì)胞肺癌進(jìn)行靶向治療，對(duì)擬行TKI治療患者，能夠首先檢測KRAS突變狀態(tài)，排除陽性后對(duì)KRAS陰性者進(jìn)行EGFR突變檢測；若EGFR突變陽性，選擇TKI治療。

分子診斷劉斌第22頁三.基因易位與重排分子診斷劉斌第23頁1.慢性淋巴細(xì)胞白血?。–LL）檢測經(jīng)過對(duì)P53、RB1、D13S25、ATM基因以及12號(hào)染色體檢測來判斷預(yù)后。分子診斷劉斌第24頁2.慢性粒細(xì)胞白血?。–ML）檢測BCR/ABL融合基因1.輔助診療CML2.指導(dǎo)格列衛(wèi)用藥3.藥品使用效果評(píng)定4.骨髓移植效果評(píng)定BCR/ABL基因融合正常細(xì)胞分子診斷劉斌第25頁3.急性早幼粒細(xì)胞白血?。∕3）檢測PML/RARA融合基因。指導(dǎo)全反式維甲酸(Alltrans-retinoicacid，ATRA)用藥ATRA治療機(jī)制是靶向降解PML/RARA融合蛋白，促進(jìn)阻滯在早幼粒細(xì)胞階段白血病細(xì)胞分化成熟。PML/RARA融合基因正常細(xì)胞分子診斷劉斌第26頁3.性染色體骨髓錯(cuò)配移植檢測用于監(jiān)測性染色體錯(cuò)配骨髓移植效果女性患者骨髓移植前女性患者骨髓移植后分子診斷劉斌第27頁四.染色體數(shù)目標(biāo)檢測不明原因流產(chǎn)中較為常見有X單體，發(fā)生率約為20%；16號(hào)三體，發(fā)生率約為16%；18號(hào)三體，發(fā)生率約為3%；21三體，發(fā)生率約為5%；22三體，發(fā)生率約為5%。進(jìn)行染色體檢測能夠?yàn)橄乱惶ト焉镞z傳咨詢提供資料。

21三體13三體分子診斷劉斌第28頁其它項(xiàng)目一.基因重排在淋巴瘤診療中應(yīng)用 它在淋巴瘤分型、療效評(píng)價(jià)、預(yù)測復(fù)發(fā)和預(yù)后評(píng)定等方面有主要臨床意義。二.端粒酶與腫瘤關(guān)系檢測

因?yàn)門ERC（telomeraseofRNAcomponent）基因編碼端粒酶RNA組分，維持端粒長度，該基因擴(kuò)增使得端粒穩(wěn)定，阻止細(xì)胞凋亡，造成腫瘤產(chǎn)生。當(dāng)病理檢測不能明確患者分級(jí)情況下：