微生物培養(yǎng)基Culturalmedium

4.微生物培養(yǎng)基

CulturalmediaAculturalmediumisthesubstanceinwhichaspecificorganismlivesandgrows.Itmustcontaintheessentialnutrientsneededforthemicrobetogrow.Agoodmediumisveryimportanttothe

successofanindustrialfermentation.Themediumsupplies

nutrientsforgrowth,energy,buildingofcellsubstance,and

biosynthesisoffermentationproducts.

第一頁，共五十四頁。4.1

培養(yǎng)基的類型及功能

Classificationsofmediaandtheirfunctions

按純度分類：

--合成培養(yǎng)基

chemicallydefinedmedia:

compoundidentityandconcentrationofallcomponentsareknown.Syntheticmedia--天然培養(yǎng)基

chemicallyundefined

media:

ingredientsincludeoneormorechemicallycomplexsubstancessuchasproteinhydrolysatesandextracts.Crudemedia

第二頁，共五十四頁。Thechoiceofdefinedorundefinedmediumisdependentuponitsapplication.---Chemicallydefinedmediaareusefulinbiochemicalormetabolicstudiesoforganisms.--Generallaboratorygrowthmediaandindustrialmediaareoftenchemicallycomplex.Suchas花生餅、蛋白胨等。一般不需外加微量元素(traceelements)、維生素等。

第三頁，共五十四頁。按狀態(tài)分類：

-Solidmedia：suitabletocultureandpreservespeciesandspores;cultivatingfungi.-Liquidmedia:80%-90%water,industrialfermentationmedia.-Semi-solidmedia:liquidmedium+agar

主要用于鑒定細菌、觀察細菌運動特征等。第四頁，共五十四頁。按用途分類孢子培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基1.孢子培養(yǎng)基

sporemedia

要求：使菌體迅速生長，產(chǎn)生較多的優(yōu)質(zhì)孢子，不易引起菌種發(fā)生變異(variation)?；九渲埔螅孩舗otrichinnutrition,especiallyorganicnitrogensoure.⑵optimalmineralsaltconcentration⑶optimalpHandhumidity第五頁，共五十四頁。生產(chǎn)上常用孢子培養(yǎng)基：麩皮、大米、小米培養(yǎng)基；由葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏和食鹽等配制的瓊脂斜面培養(yǎng)基。大米和小米常用作霉菌孢子培養(yǎng)基，因它們含氮少、疏松、表面積大，是較好的孢子培養(yǎng)基。水分控制在21％－25％。第六頁，共五十四頁。種子培養(yǎng)基

inoculum

media:

種子培養(yǎng)基是供孢子發(fā)芽、生長和大量繁殖菌絲體，并使菌絲體長得粗壯，成為活力強的‘種子’。

Inoculummediaareusuallylessnutritiousthan

areproductionmedia,andtheyusuallycontainaconsiderably

lowerlevelofthemainnutritivecarbonsource.第七頁，共五十四頁。一般種子培養(yǎng)基常包括有機氮源和無機氮源最后一級的種子培養(yǎng)基的成分最好接近發(fā)酵培養(yǎng)基。發(fā)酵培養(yǎng)基

productionmedia

發(fā)酵培養(yǎng)基是供菌體生長、繁殖和合成產(chǎn)物之用。要求：既要使種子接種后能迅速生長，達到一定的菌絲濃度，又要使長好的菌體迅速合成所需產(chǎn)物。第八頁，共五十四頁。配制要求：其組成除有菌體生長所必需的元素和化合物外，還需有合成產(chǎn)物所需的特定元素、前體和促進劑等。Inadditiontothecarbonandnitrogencompounds,amediumcontainsinorganicsalts,vitamins,growthfactors,precursorsoffermentationproducts.第九頁，共五十四頁。Microbialgrowthunderindustrialfermentationconditionsusuallyutilizesa“l(fā)uxurymetabolism”oftheorganisms.Thus,goodyieldsoffermentationproductsoccuronlyifrelativelylargeamountsofcarbon,andpossiblynitrogen,arechanneledthroughthemetabolicpathwaysofthemicroorganism.第十頁，共五十四頁。4.2發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及來源

CompositionofmediaandtheirsourcesTheparticularcompositionofafermentationmediumcanbesimpletocomplexdependingontheparticularmicroorganismanditsfermentation.Autotrophic(自養(yǎng)的)microorganismsrequireonlythesimplestofinor-ganicmedia.Heterotrophic

(異養(yǎng)的)microorganismslacktheabilitytosynthesizemanyoftheirsustenanceandgrowthrequirements.第十一頁，共五十四頁。4.2.1碳源carbonsourcesCarbonsourceisoneofmaincompositionofmedia.Thefunctionsare:providingcarbonsandenergy;thecomponentsforsynthesisofproducts.

Thesecanincludesimplesugars,complexcarbohydrates,alcohols,aminoandotherorganicacids,andshort-chainlipids.

常用的碳源有糖類、油脂、有機酸和低碳醇。蛋白質(zhì)、氨基酸也可用作碳源。第十二頁，共五十四頁。4.2.1.1糖類sugarsSugarsusedmainly:glucose,molasses(糖蜜),dextrin(糊精).Glucose:mostmicrobescanutilizeit.

速效碳源、

highconcentrationspeedrespirationupDOnoenoughintermediates(中間產(chǎn)物）accumulationinhibitinggrowth第十三頁，共五十四頁。molasses(糖蜜)Beet(甜菜)andcanemolassesareby-productsofthesugarindustry.containing50%-75%fermentablesugars,mainlysucrose.Alsocontainingnitrogenouscompounds,vitaminsandminerals.Cheaper第十四頁，共五十四頁。Starchanddextrin(糊精)Starch:----widelyusedinfermentationindustry---starchhydrolyzeusingmicrobialamylasedextringlucose-Mostcommonusedstarches:corn,wheat,potatostarches.Alsousingcornflour.--advantages:緩效碳源、cheaperthanglucose第十五頁，共五十四頁。油和脂肪oilsandfatsOilandfatsarealsousedascarbonsourcesbecausesomemicrobescontainlipase(脂肪酶)Fatglycerol(甘油)andfattyacids

oxidizeCO2+water,releasingmuchenergyProvidingenoughO2isimportant.常用的油：豆油、菜子油、豬油、魚油、棉子油等。第十六頁，共五十四頁。有機酸

organicacidsSomemicrobescanuseorganicacidsascarbonsources,suchaslacticacid,citricacid,aceticacid.pHofculturalmediumwillincrease.CH3COONa+O2

2CO2+H2O+NaOH第十七頁，共五十四頁。烴和醇類

hydrocarbonandethanol石油及裂解產(chǎn)物如正烷烴也可用作carbonsources.自然界中能同化乙醇的微生物和能同化糖質(zhì)的微生物一樣普遍。第十八頁，共五十四頁。4.2.2氮源

nitrogensources氮源主要用于構(gòu)成細胞物質(zhì)（氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸等）和含氮代謝物。有機氮源

organicnitrogensources

常用的:花生餅、棉子餅、玉米漿、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、魚粉、蠶蛹粉、尿素、廢菌絲體和酒糟等。

organicnitrogensourcesmicrobialproteinaseaminoacidsmetabolizedbymicrobes.第十九頁，共五十四頁。organicnitrogensourcescontainrichproteins,peptides,aminoacids,vitaminsandgrowthfactors.在含有機碳源的培養(yǎng)基中，微生物常表現(xiàn)出生長旺盛、菌絲或細胞濃度增長迅速的特點。有些微生物對氨基酸有特殊的需求。如纈氨酸可提高紅霉素的發(fā)酵單位。第二十頁，共五十四頁。玉米漿

CornsteepLiquorCornsteepliquoristhewaterextractby-productresultingfrom

thesteeping(浸泡)ofcornduringthecommercialproductionofcorn

starchandothercornproducts.Ofthe

50%solidsofcornsteepliquor,nearlyhalfislactic

acid.

Therestincludesaminoacids,glucoseandotherreducing

sugars,salts,vitamins,andprecursors(前體)suchasthoseforthe

penicillinmolecule.

第二十一頁，共五十四頁。Thehighlacticacidcontentofcornsteepliquorresultsfromthegrowthoflacticacidbacteriaduringitsmanufacture.Thisvariationincomposition,

attimes,canleadtopoorreproducibilityofanindustrial

fermentation.

第二十二頁，共五十四頁。尿素

ureaUreaisalsoacommonlyusednitrogensource.Itsfeature:---singlecomponent,nonutritionalfeatureofcomplexnitrogensources;---cheaper,oftenusedinproductionofpenicillinandglutamicacid.第二十三頁，共五十四頁。yeastextractpeptones有機氮源除了作為菌體生長繁殖的營養(yǎng)外，有的還是產(chǎn)物的前體。纈氨酸、半胱氨酸和-是合成青霉素和頭孢菌素的主要前體；甘氨酸可作為L-絲氨酸的前體等。第二十四頁，共五十四頁。無機氮源

inorganicnitrogensource常用的：氨水(ammonia)、銨鹽(ammonium)和硝酸鹽(nitrate)Microbescanutilizeitfaster.Afteritisutilized,thepHofmediumwillbechanged.(NH4)2SO4

2NH3+H2SO4NaNO3+4H2

NH3+2H2O+NaOH第二十五頁，共五十四頁。生理酸性物質(zhì)：NH4

酸性物，硫酸銨生理堿性物質(zhì)：NH4

堿性物，硝酸銨正確使用生理酸堿性物質(zhì)Exceptusingasanitrogensource,ammoniaisoftenusedtoadjustpHofmedia.Stirringisnecessary.第二十六頁，共五十四頁。4.2.3無機鹽及微量元素

mineralsaltsandtraceelementsMineralsaltsandtraceelementsareneededwhenmicrobialcellsgrowandreproduce.Mostcommonmineralsaltsandtraceelements:

磷(phosphorus)、鎂(magnesium)、硫(sulphur)、鉀(potassium)、鈉(sodium)、鐵(iron)、氯(chlorine)、錳(manganese)、鋅(zinc)、鈷(cobalt)、鈣等第二十七頁，共五十四頁。作為微生物細胞生理活性物質(zhì)組成或生理活性作用的調(diào)節(jié)物。Whentheirconcentrationislow,theyshowastimulationfunctionforcellgrowandproductsynthesis.Whentheirconcentrationishigh,theywillinhibitthecellgrowth.Theiroptimalconcentrationsdependonthespeciesandstrains.第二十八頁，共五十四頁。無機鹽成分一般所用的濃度范圍成分濃度g/L成分濃度g/LKH2PO4MgSO4·7H2OKClCaCO3FeSO4·4H2O1.0~4.00.25~3.00.5~12.05~170.01~0.1ZnSO4·8H2OMnSO4·H2OCuSO4·5H2ONa2MoO4·2H2O0.1

~1.00.01~0.10.003~0.010.01~0.1第二十九頁，共五十四頁。Theseelementsareaddedintoculturalmediaintheformoftheirsalts.Exceptsyntheticmedia,cobalt鈷,copper,iron,manganese錳,zinc,molybdenum鉬arenotaddedintocrudemedia.第三十頁，共五十四頁。Phosphoruselementisoneofnucleicacidsandproteinscomposition,onecomponentofATP,energytransfer.Phosphoruscanstimulatemicrobialgrowthandmetabolism.Butitinhibitscellgrowthwhenitsconcentrationishigh.許多次級代謝過程對磷酸鹽濃度的承受限度比生長繁殖過程低，故必須嚴格控制。第三十一頁，共五十四頁。Magnesiumdoesnotinvolvethecellinstitution.ButMgistheactivatorformanyimportantenzymes.如己糖磷酸化酶、檸檬酸脫氫酶等鎂離子可提高抗生素產(chǎn)生菌的抗生素耐受能力，如鏈霉素、卡那霉素等產(chǎn)生菌。常以硫酸鎂的形式加入培養(yǎng)基。第三十二頁，共五十四頁。硫存在于細胞的蛋白質(zhì)中，是含硫氨基酸的組分和某些輔酶的活性基，如輔酶A

(coenzymeA),谷胱甘肽等。硫是某些產(chǎn)物如青霉素、頭孢菌素等分子的組成部分，在培養(yǎng)基中加入Na2SO4等含硫化合物作硫源。第三十三頁，共五十四頁。鐵(iron)是細胞色素、細胞色素氧化酶和過氧化氫酶的成分，因此鐵是菌體有氧氧化必不可少的元素。Iniron-madefermentor,generallyironionconcentrationcanbe

30μg/ml.Soironcontainingcompoundsarenotnecessaryforindustrialmedia.第三十四頁，共五十四頁。Chlorinedoesnothavenutritionalfunctionsformostmicroorganisms,butitisnecessaryforcellgrowthofhalophile.一些產(chǎn)含氯代謝物如金霉素和灰黃霉素等的發(fā)酵中，除天然含有外，通常還需加入0.1%氯化鉀。在啤酒生產(chǎn)中，20－60mg/ml

的氯對酶和酵母有一定的促進作用。

第三十五頁，共五十四頁。Sodium,potassium,calciumarenotcomponentsofcellconstitution,theyarestillnecessarycompositionforculturalmedia.鈉、鉀離子與維持細胞的滲透壓有關。鉀離子是許多酶的激活劑，能促進糖代謝。鈣是某些酶(如蛋白酶)的激活劑，還參與細胞膜通透性的調(diào)節(jié)。培養(yǎng)基中鈣鹽過多時，會形成磷酸鈣沉淀。。第三十六頁，共五十四頁。

鋅、鎂、鈷、錳等是某些酶的輔基或激活劑。鎂離子還可提高抗生素生產(chǎn)菌對自己所產(chǎn)生抗生素的耐性；鈷既是一些酶的激活劑，又是VB12的組成元素，發(fā)酵中加入一定量的鈷鹽，能使VB12的產(chǎn)量提高數(shù)倍；錳對于羧化作用是必需的，糖代謝中許多酶的活性都與錳有關。第三十七頁，共五十四頁。4.2.4Water

MaincompositionofmediaFunctions:---joindirectlysomemetabolisms---solvents---providingaphysiologicalenvironmentsforcellgrowthandsynthesisofproducts.Effectofwaterqualityonfermentation第三十八頁，共五十四頁。4.2.5生長因子、前體、產(chǎn)物促進劑(1)

生長因子growthfactorsDefinition:smallamountoforganiccompounds

necessaryformicrobialgrowth.

Features:nosynthesisbyitself.Examples：aminoacids,purines,vitaminsSources:normallyorganicnitrogensource.Cornsteepliquor.第三十九頁，共五十四頁。(2)前體precursorsDefinition:substancesaddedprior

toorsimultaneouslywiththe

fermentation,whichareincorporated

withoutanymajorchangeintothemoleculeofthe

fermentationproduct,andwhichgenerallyservetoincreasethe

yieldorimprovethequalityoftheproduct.第四十頁，共五十四頁。前體是指某些化合物加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，能直接被微生物在生物合成過程中結(jié)合到產(chǎn)物分子中去，而其自身的結(jié)構(gòu)并沒有多大變化，但是產(chǎn)物的產(chǎn)量卻因加入前體而有較大的提高。Examples：苯乙酸青霉素G

苯氧乙酸青霉素V第四十一頁，共五十四頁。發(fā)酵過程中所用的一些前體物質(zhì)產(chǎn)品前體產(chǎn)品前體青霉素G青霉素V金霉素灰黃霉素紅霉素苯乙酸苯氧乙酸氯化物氯化物正丙醇核黃素類胡蘿卜素L-異亮氨酸L-色氨酸L-絲氨酸丙酸鹽β-紫羅酮-氨基丁酸鄰氨基苯甲酸甘氨酸第四十二頁，共五十四頁。(3)產(chǎn)物促進劑產(chǎn)物促進劑productstimulator

Definition:substancesareneithernutrientsnorprecursors,andincreaseproductyieldafteraddingthem.Examples:Tween(0.1%)amylase(淀粉酶),

cellulase(纖維素酶)

大豆酒精提取物

cellulase第四十三頁，共五十四頁。Mechanisms:

notveryclearPossiblereasons:---enzymeinducers誘導劑

---improvementofcellpermeability滲透性

---protectiononenzymeactivity第四十四頁，共五十四頁。4.3培養(yǎng)基的設計及優(yōu)化

mediadesignanditsoptimization

ImportanceofmediadesignCurrentsituationsofmediadesign:manyfactorsempirical經(jīng)驗+scientific4.3.1培養(yǎng)基成分選擇的原則

(1)菌體的同化能力：

largemolecules+enzymessmallmolecules第四十五頁，共五十四頁。

Selectionofcarbonsources:

glucose,starches不同糖化工藝所得糖液質(zhì)量的比較項目酸法酸酶法雙酶法葡萄糖值(DE值)葡萄糖含量％灰分％色度羥甲基糠氨％葡萄糖收率91861.610.00.3095930.40.30.008較酸法高5％98970.10.20.003較酸法高10％第四十六頁，共五十四頁。Selectionofnitrogensources:---Ifthemicrobeproducesproteolyticenzymes,avarietyofcrudenitrogensourcessuchassoybeanmealcanbeused.--Ifthemicrobelackofproteases,theorganicnitrogensourceshouldbehydrolyzed.

豆餅粉＋water+hydrochloricacid鹽酸,pH1.0100°Caminoacids.第四十七頁，共五十四頁。(2)

代謝物的阻遏和誘導

---葡萄糖效應

---combinationoforganicandinorganicnitrogen/carbonsources---enzymeagentproduction:Formanyinducedenzymes,starchanddextrinarecommoncarbonsource.

第四十八頁，共五十四頁。碳源對生長和產(chǎn)酶的影響碳源地衣芽孢桿菌細胞量g/l

淀粉酶活/(U/ml)glucose

4.20FructoseSucroseDextrinstarch

4.1804.0203.0638.23.0940.2第四十九頁，共五十四頁。

---ageofmicro