基因工程資料

第一章基因工程1基因工程的基本定義：（關(guān)鍵詞：供體、載體、受體）將一種生物體（供體）的基因與載體在體外進(jìn)行拼接重組，然后轉(zhuǎn)入另一個(gè)受體內(nèi)，使之按照人們的意愿穩(wěn)定遺傳并表達(dá)出新產(chǎn)物或新性狀的DNA體外操作程序。2基因工程的主要操作步驟：切、接、轉(zhuǎn)、增、選。第二章、基因工程的基本原理技術(shù)：1核酸凝膠電泳技術(shù)：DNA、RNA是多聚陰離子，向正極遷移分離特點(diǎn)：1）分子量較小DNA分子比分子量大的快2）同等分子量，松散的DNA分子比線性的DNA分子快2電泳制備DNA或RNA的目的：區(qū)分與純化3應(yīng)用脈沖電場(chǎng)凝膠電泳可以成功分離分子量高達(dá)10加的DNA大分子。一核酸分子雜交技術(shù)：分子雜交是通過(guò)各種方法將核酸分子固定在固相支持物上，然后用放射性或非放射性標(biāo)記的探針與被固定的分子雜交，經(jīng)顯影后顯示出目的DNA或RNA分子所處的位置。Southern雜交：被檢對(duì)象為DNA，探針為DNA或RNA（DNA片段電泳分離后）Northern雜交，被檢對(duì)象為RNA，探針為DNA或RNA細(xì)菌遺傳信息的轉(zhuǎn)移：接合、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)化：某一基因型的細(xì)胞從周?chē)橘|(zhì)中吸收來(lái)自另一基因型的DNA而使它的基因型和表現(xiàn)型發(fā)生相應(yīng)變化的現(xiàn)象。感受態(tài)：指細(xì)菌能從周?chē)h(huán)境中吸收DNA分子進(jìn)行轉(zhuǎn)化的生理狀態(tài)。轉(zhuǎn)染：采用與質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞相似的方法，將重組噬菌體DNA分子直接導(dǎo)入受體細(xì)胞中的過(guò)程。轉(zhuǎn)導(dǎo)：通過(guò)噬菌體病毒顆粒感染宿主細(xì)胞的途徑把外源DNA分子轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞的過(guò)程。DNA序列分析技術(shù)：確定一條染色體片段的堿基順序。第三章基因工程的基本條件：A:用核酸操作的工具酶B：用于基因克隆的載體C:用于基因轉(zhuǎn)移的受體菌或細(xì)胞A：用核酸操作的工具酶：限制性核酸內(nèi)切酶DNA連接酶DNA聚合酶限制系統(tǒng)：限制外來(lái)基因核酸酶修飾系統(tǒng)：修飾內(nèi)源基因核酸修飾酶一限制性?xún)?nèi)切酶：識(shí)別雙鏈DNA分子中的特定序列，并切割DNA雙鏈，主要存在于原核細(xì)菌中，幫助細(xì)菌限制外來(lái)DNA的入侵細(xì)菌的限制與修飾作用。1限制性核酸內(nèi)切酶的類(lèi)型I型II型III型2II型的主要特征：限制修飾：?jiǎn)喂δ艿鞍捉Y(jié)構(gòu)：同源二聚體輔助因子：Mg2+切割位點(diǎn)：識(shí)別序列內(nèi)或附近特異性切割識(shí)別序列：旋轉(zhuǎn)對(duì)稱(chēng)序列：ACGTGCCGTGCA2限制性核酸內(nèi)切酶的命名例：屬名種名株名Haemophilusinfluenzaed嗜血流感桿菌d株HindIII同一菌株中所含的多個(gè)不同的限制性核酸內(nèi)切酶3II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性：識(shí)別雙鏈DNA分子中4?8對(duì)堿基的特定序列大部分酶的切割位點(diǎn)在識(shí)別序列內(nèi)部或兩側(cè)識(shí)別切割序列呈典型的旋轉(zhuǎn)對(duì)稱(chēng)型回文結(jié)構(gòu)4II型限制性核酸內(nèi)切酶的切割結(jié)果：獲得5’粘性末端或3’粘性末端平頭末端1U核酸內(nèi)切酶的酶活性：在最佳反應(yīng)條件下反應(yīng)1hr,完全水解lug標(biāo)準(zhǔn)DNA所需的酶量4II型核酸內(nèi)切酶的多酶聯(lián)合酶解：a對(duì)鹽濃度要求相同的酶，原則上可以同時(shí)酶切，但應(yīng)注意：識(shí)別序列是否有重疊，選擇沒(méi)有重疊片段的酶進(jìn)行切割b對(duì)鹽濃度要求不同的酶，可采取下列措施：1使用較貴的酶的鹽濃度，加大便宜酶的用量，同時(shí)酶解2低鹽酶先切，然后補(bǔ)加鹽，高鹽酶再切3一種酶先切，然后更換緩沖液，另一種酶再切5影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素：1DNA樣品的純度：蛋白質(zhì)、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等解決方案：加大酶的用量，1ugDNA的用10U酶加大反應(yīng)總體積延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間2DNA樣品的甲基化程度：3核酸內(nèi)切酶的緩沖液性質(zhì)：高濃度的酶、高濃度的甘油、低離子強(qiáng)度、極端PPH值等，會(huì)使一些核酸內(nèi)切酶的識(shí)別和切割序列發(fā)生低特異性，即所謂的“staractivity”

現(xiàn)象會(huì)使一些核酸內(nèi)切酶的識(shí)別和切割序列發(fā)生低特異性，即所謂的“*”活性二DNA連接酶1DNA連接酶的基本性質(zhì)：修復(fù)雙鏈DNA上缺口處的磷酸二酯鍵修復(fù)與RNA鏈結(jié)合的DNA鏈上缺口處的磷酸二酯鍵連接多個(gè)平頭雙鏈DNA分子1UDNA連接酶的酶活性：在最佳反應(yīng)條件下15oC反應(yīng)1hr，完全連接lugA-DNA（HindIII片段）所需的酶量。2平頭雙鏈DNA片段的連接操作從分子動(dòng)力學(xué)的角度講，由限制性核酸內(nèi)切酶創(chuàng)造的粘性末端的連接屬于分子內(nèi)部的連接，而平頭末端的連接則屬于分子間的連接，因此后者反應(yīng)速度要慢得多3提高平頭末端連接效率的方法包括：加大連接酶用量（10倍大于粘性末端的連接）加大平頭末端底物的濃度，增加分子間碰撞機(jī)會(huì)加入10%PEG8000，促進(jìn)大分子之間的有效作用加入單價(jià)陽(yáng)離子（NaCl），最終濃度150--200mM三DNA聚合酶1大腸桿菌DNA聚合酶I（DNApolI）aDNApolI的基本性質(zhì)T^3’的DNA聚合酶活性5—-3’的核酸外切酶活性3—5’的核酸外切酶活性b大腸桿菌DNA聚合酶I的基本用途：缺口平移標(biāo)記法：其原理是用DNA酶在雙鏈DNA探針的一條鏈上制造一個(gè)缺口，缺口處形成3’-OH末端，在大腸桿菌DNA菌和酶I的催化下將核苷酸殘基加在3’-OH上。同時(shí)根據(jù)大腸桿菌DNA聚合酶I的5’3’核酸外切酶活性，將缺口5’端核苷酸依次切除，結(jié)果是在缺口的5’端不斷消除核苷酸而在3’端依次添加核苷酸，從而使缺口沿著互補(bǔ)DNA鏈移動(dòng)，故稱(chēng)缺口平移（NickTranscription）。TOC\o"1-5"\h\z5’3’3’5’1,DNase5’3’3’5’DNApolI]Mg2+5’dNTP5’pppN（A、T、C、G）5’N3’3’N5’用途：制備32P標(biāo)記的探針2大腸桿菌DNA聚合酶I大片段（Klenow）大腸桿菌DNA聚合酶I經(jīng)枯草芽孢桿菌蛋白酶處理，獲得N端三分之二的大肽段，即為Klenow酶aKlenow酶的基本性質(zhì)：Klenow酶擁有5’一3’的DNA聚合酶活性3’5’的核酸外切酶活性失去了5’一3’的核酸外切酶活性3’5’的核酸外切酶活性bKlenow酶的基本用途：補(bǔ)平由核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的5’粘性末端DNA片段的同位素末端標(biāo)記cDNA第二鏈的合成雙脫氧末端終止法測(cè)定DNA序列3T4-DNA聚合酶aT4-DNA酶的基本特性：5’一3’的DNA聚合酶活性3’一5'的核酸外切酶活性在無(wú)dNTP時(shí)，可以從任何3'--OH端外切在只有一種dNTP時(shí)，外切至互補(bǔ)核苷酸暴露時(shí)停止在四種dNTP均存在時(shí)，聚合活性占主導(dǎo)地位bT4-DNA聚合酶的基本用途：切平由核酸酶切酶產(chǎn)生的3’粘性末端注意：該酶也能降解雙鏈DNA,只是其活性比單鏈降解活性低很多DNA片段的同位素末端標(biāo)記4依賴(lài)于RNA的DNA聚合酶（反轉(zhuǎn)錄酶）a反轉(zhuǎn)錄酶的基本特性：以RNA為模板聚合cDNA鏈雙向外切DNA-RNA雜合鏈中的RNA鏈三核酸酶a單鏈核酸外切酶：核酸外切酶VII（ExoVll）注：大腸桿菌的核酸外切酶VII不需要Mg2+b雙鏈核酸外切酶：核酸外切酶III（ExoIII）大腸桿菌的核酸外切酶III特異性地從3’端外切入核酸外切酶（入Exo）入核酸外切酶特異性地從5’端外切（+Mg2+）c單鏈核酸內(nèi)切酶：S1核酸酶（來(lái)自稻谷曲霉菌Aspergillusoryzae）S1核酸酶的基本特性：降解單鏈DNA的速度比降解雙鏈DNA快75000倍Zn2+必需最適pH范圍為4.0-4.3降解單鏈DNA的速度比降解單鏈RNA快7倍S1核酸酶的基本反應(yīng)：內(nèi)切單鏈DNA或RNA內(nèi)切帶缺口或缺刻的雙鏈DNA或RNAS1核酸酶的重要用途：在DNA上定位RNA（S1mapping）D單鏈內(nèi)切雙鏈外切的核酸酶：Bal31核酸酶（來(lái)自艾氏交替單胞菌A.espejiana）Bal31核酸酶的基本特性：（+Ca2+）Bal31核酸酶的基本用途：誘發(fā)DNA突變四核酸修飾酶末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶（TdT）來(lái)自小牛胸腺1TdT的基本特性：不需要模板的DNA聚合酶，隨機(jī)摻入dNTPs（需加Mg2+）堿性磷酸單酯酶來(lái)自小牛胸腺的堿性磷酸單酯酶（CIP）來(lái)自大腸桿菌的堿性磷酸單酯酶（BAP）5'pppdN或5'pppN\BAP或CIP5’-OHdN或5’-OHN2T4-多核苷酸磷酸激酶（T4-PNP）T4-PNP的基本特性：在DNA、RNA、dNR、NR的5’-OH上加磷用途：用于探針末端同位素標(biāo)記（需加Mg2+）B用于基因克隆的載體質(zhì)粒（plasmid）、噬菌體或病毒DNA、考斯質(zhì)粒與噬菌粒、人造染色體載體a載體的功能：運(yùn)送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力為外源基因的擴(kuò)增或表達(dá)提供必要的條件b載體應(yīng)具備的條件：具有針對(duì)受體細(xì)胞的親緣性或親和性（可轉(zhuǎn)移性）具有與特定受體細(xì)胞相適應(yīng)的復(fù)制位點(diǎn)和整合點(diǎn)具有較高的外源DNA的裝載能力具有多種單一的核酸內(nèi)切酶識(shí)別切割位點(diǎn)具有合適的篩選標(biāo)記一質(zhì)粒1質(zhì)粒的基本特征：質(zhì)粒是生物細(xì)胞內(nèi)固有的、能獨(dú)立于寄主染色體而自主復(fù)制、并被穩(wěn)定遺傳的一類(lèi)核酸分子。質(zhì)粒常見(jiàn)于原核細(xì)菌和真菌中，絕大多數(shù)的質(zhì)粒是DNA型的，絕大多數(shù)的天然DNA質(zhì)粒具有共價(jià)、封閉、環(huán)狀的分子結(jié)構(gòu)，即cccDNA。質(zhì)粒DNA的分子量范圍：1?300kb2質(zhì)粒的基本特性a質(zhì)粒的自主復(fù)制性質(zhì)粒能利用寄主細(xì)胞的DNA復(fù)制系統(tǒng)進(jìn)行自主復(fù)制質(zhì)粒DNA上的復(fù)制子結(jié)構(gòu)決定了質(zhì)粒與寄主的對(duì)應(yīng)關(guān)系根據(jù)在每個(gè)細(xì)胞中的分子數(shù)（拷貝數(shù)）多寡，質(zhì)粒可分為兩大復(fù)制類(lèi)型：（1）嚴(yán)緊型復(fù)制控制的質(zhì)粒：1?3拷貝（2）松弛型復(fù)制控制的質(zhì)粒：10?60拷貝a質(zhì)粒的自主復(fù)制性：拷貝數(shù)的控制機(jī)制-質(zhì)粒DNA復(fù)制啟動(dòng)控制控制復(fù)制引物與模板的結(jié)合控制復(fù)制起始因子與復(fù)制起始位點(diǎn)ori的結(jié)合b質(zhì)粒的不相容性：c質(zhì)粒的可轉(zhuǎn)移性：d攜帶特殊的遺傳標(biāo)記：這些標(biāo)記基因?qū)NA重組分子的篩選具有重要意義4質(zhì)粒的分類(lèi)：人工構(gòu)建的質(zhì)粒根據(jù)其功能和用途可分成如下幾類(lèi)：高拷貝質(zhì)粒：突變拷貝數(shù)控制基因拷貝數(shù)1000--3000擴(kuò)增基因低拷貝質(zhì)粒：來(lái)自PSC101拷貝數(shù)小于10表達(dá)某些毒性基因溫敏質(zhì)粒：在不同溫度下表現(xiàn)出拷貝數(shù)、整合等不同性質(zhì)測(cè)序質(zhì)粒：含有測(cè)序通用引物互補(bǔ)序列和多酶接頭polylinker整合質(zhì)粒：裝有整合促進(jìn)基因及位點(diǎn)便于外源基因的整合穿梭質(zhì)粒：裝有針對(duì)兩種不同受體的復(fù)制子便于基因克隆表達(dá)質(zhì)粒：裝有強(qiáng)化外源基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄、翻譯、純化的元件探針質(zhì)粒：裝有報(bào)告基因便于啟動(dòng)子等元件的克隆篩選5重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體：PBR322：松弛型復(fù)制、氯毒素可擴(kuò)增、拷貝數(shù)50?100/cell、由于基因克隆PUC18/19：拷貝數(shù)2000?3000/cell、裝有多克隆位點(diǎn)（MCS）、正選擇顏色標(biāo)記lacZ’\用于基因克隆和測(cè)序GEM-3Z：多拷貝、裝有多克隆位點(diǎn)（MCS）、正選擇顏色標(biāo)記lacZ’、裝有兩個(gè)噬菌體的強(qiáng)啟動(dòng)子、用于外源基因的高效表達(dá)6質(zhì)粒DNA的分離純化：實(shí)驗(yàn)室一般使用下列三種方法制備質(zhì)粒DNA：a氯化銫密度梯度離心法：質(zhì)粒DNA純度高、周期長(zhǎng)、設(shè)備要求高、漠乙錠污染b沸水浴法：質(zhì)粒DNA純度低、快速、操作簡(jiǎn)便c堿溶法：質(zhì)粒DNA純度、操作周期介于氯化銫法和堿溶法之間a氯化銫密度梯度離心法：用含有EDTA的緩沖液懸浮菌體加溶菌酶裂解細(xì)菌細(xì)胞壁加CsCl和漠乙錠超速離心過(guò)夜在紫外燈下吸取cccDNA稀釋沉淀cccDNAB沸水浴法：用含有EDTA和TritonX--100的緩沖液懸浮菌體加溶菌酶裂解細(xì)菌細(xì)胞壁沸水浴40秒鐘離心，用無(wú)菌牙簽挑去沉淀物乙醇或異丙醇沉淀質(zhì)粒DNAC堿溶法：用含有EDTA的緩沖液懸浮菌體加溶菌酶裂解細(xì)菌細(xì)胞壁加NaOH和SDS的混合溶液，去膜釋放內(nèi)含物加高濃度的醋酸鉀溶液，沉淀染色體，去除染色體DNA及大部分蛋白質(zhì)離心取上清液，用苯酚--氯仿萃取，去除痕量的蛋白質(zhì)乙醇或異丙醇沉淀水相質(zhì)粒DNA用無(wú)DNase的RNase去除殘余的RNA二噬菌體或病毒DNA噬菌體或病毒是一類(lèi)非細(xì)胞微生物，能高效率高特異性地侵染宿主細(xì)胞，然后或自主復(fù)制繁殖，或整合入宿主基因組中潛伏起來(lái)，而且在一定的條件下上述兩種狀態(tài)還會(huì)相互轉(zhuǎn)化。噬菌體或病毒的上述特性使得它們的DNA能被開(kāi)發(fā)成為基因工程的有用載體，因?yàn)椋焊咝实母腥拘阅苁雇庠椿蚋咝?dǎo)入受體細(xì)胞自主復(fù)制繁殖性能使外源基因在受體細(xì)胞中高效擴(kuò)增1大腸桿菌的入噬菌體DNAa入噬菌體的生物學(xué)特性入噬菌體是大腸桿菌的溫和型噬菌體入噬菌體由外殼包裝蛋白和入-DNA組成入-DNA全長(zhǎng)48502個(gè)核苷酸入-DNA上至少有61個(gè)基因b入噬菌體的溶原狀態(tài)：入噬菌體感染大腸桿菌后，除能裂解細(xì)胞外，也可能將其DNA直接整合到宿主細(xì)胞的染色體DNA上，并不產(chǎn)生子代噬菌體顆粒，這種情況為溶原狀態(tài)。整合主要由入-DNA上的cI和int兩基因的產(chǎn)物所激活，而這兩個(gè)基因的開(kāi)放與關(guān)閉又取決于宿主細(xì)胞本身的性質(zhì)。人們可以根據(jù)需要改變?nèi)?DNA或宿主細(xì)胞的性質(zhì)，使噬菌體或處于溶菌狀態(tài)，或處于溶菌狀態(tài)DNA重組技術(shù)一般需要入噬菌體進(jìn)入溶菌狀態(tài)c入-DNA載體的構(gòu)建：縮短長(zhǎng)度野生型入-DNA包裝的上限為51kb，本身長(zhǎng)度為48.5kb，只有當(dāng)插入的外源DNA片段不大于2.5kb時(shí)，才能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒。因此縮短野生型入-DNA的長(zhǎng)度，可以提高裝載量。其實(shí)野生型入-DNA上約有40?50%的片段是復(fù)制和裂解所非必需的。根據(jù)切除的多少，可入-DNA分成兩大類(lèi)載體：插入型載體、取代型載體入-DNA載體的構(gòu)建：刪除重復(fù)的酶切位點(diǎn)加裝選擇標(biāo)記構(gòu)建琥珀密碼子的突變體琥珀型突變(sup)是指由CAG(Gin)向UAG(stop)的突變。大腸桿菌的某些菌株含有特異性的校正基因，其編碼產(chǎn)物校正tRNA能專(zhuān)一性地糾正這一突變。入-DNA重組分子的體外包裝：入-DNA重組分子需體外人工包裝成有感染力的噬菌體重組顆粒，方可高效導(dǎo)入受體細(xì)胞。d入-DNA及其重組分子的分離純化：將大腸桿菌在含有麥芽糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，加入入噬菌體或重組入噬菌體的懸浮液，37°C培養(yǎng)1小時(shí)，用新鮮培養(yǎng)基稀釋?zhuān)^續(xù)培養(yǎng)4?12小時(shí)。這時(shí)噬菌體顆粒，密度已達(dá)1013?1014/L，大腸桿菌細(xì)胞已完全裂解，超速離心，沉淀噬菌體苯酚抽提，釋放入-DNA乙醇或異丙醇沉淀入-DNAE入-DNA作為載體的優(yōu)點(diǎn)：入-DNA可在體外包裝成噬菌體顆粒，能高效轉(zhuǎn)染大腸桿菌入-DNA載體的裝載能力為25kb，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于質(zhì)粒的裝載量重組入-DNA分子的篩選較為方便重組入-DNA分子的提取較為簡(jiǎn)便入-DNA載體適合克隆和擴(kuò)增外源DNA片段，但不適合表達(dá)外源基因2大腸桿菌的M13單鏈?zhǔn)删wDNAaM13噬菌體的生物學(xué)特性：M13噬菌體的外型呈絲狀M13噬菌體由外殼包裝蛋白和正鏈DNA組成M13DNA全長(zhǎng)6407個(gè)核苷酸M13DNA上至少有10個(gè)基因2700個(gè)外殼蛋白分子M1133噬菌體不裂解宿主細(xì)胞，但抑制其生長(zhǎng)bM13DNA載體的特點(diǎn)：使克隆的DNA片段以特定單鏈的形式輸出受體細(xì)胞外，這在DNA定向突變中非常有用M13重組分子篩選簡(jiǎn)便被M13噬菌體感染的受體細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，形成混濁斑，易于辨認(rèn)挑選。而且重組分子越大，混濁斑的混濁度亦越大但M13-DNA載體的最大缺陷是裝載量小，只有1.5kb3考斯質(zhì)粒與噬菌體A考斯質(zhì)粒(cosmid)a考斯質(zhì)粒載體的構(gòu)建：考斯質(zhì)粒是一類(lèi)人工構(gòu)建含有入-DNAcos序列和質(zhì)粒復(fù)制子的特殊類(lèi)型的載體1.8kb的入-DNA片段+pBR322片段裝載范圍為31?45kbb考斯質(zhì)粒載體的特點(diǎn)：能像A-DNA那樣進(jìn)行體外包裝，并高效轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞裝載量大（45kb）且克隆片段具有一定的大小范圍能像質(zhì)粒那樣在受體細(xì)胞中自主復(fù)制重組操作簡(jiǎn)便，篩選容易不能體內(nèi)包裝，不裂解受體細(xì)胞B噬菌粒噬菌粒載體的特點(diǎn)：噬菌粒是一類(lèi)人工構(gòu)建的含有單鏈?zhǔn)删w包裝序列、復(fù)制子以及質(zhì)粒復(fù)制子、克隆位點(diǎn)、標(biāo)記基因的特殊類(lèi)型的載體能像M13-DNA那樣體外包裝，并高效轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞裝載量比常規(guī)的M13mp系列要大很多（10kb）能像質(zhì)粒那樣在受體細(xì)胞中自主復(fù)制重組操作簡(jiǎn)便，篩選容易通過(guò)克隆雙鏈DNA能獲得同等長(zhǎng)度的單一單鏈DNA4人造染色體載體將細(xì)菌接合因子或酵母菌染色體上的復(fù)制區(qū)、分配區(qū)、穩(wěn)定區(qū)與質(zhì)粒組裝在一起，即可構(gòu)成染色體載體。當(dāng)大片段的外源DNA克隆在這些染色體載體上后，便形成重組人造染色體，它能像天然染色體那樣，在受體細(xì)胞中穩(wěn)定的復(fù)制并遺傳。目前常用的人造染色體載體包括：a細(xì)菌人造染色體（BAC）裝載量：50?300kb之間b酵母人造染色體（YAC）裝子量：350?400kb之間三用于基因轉(zhuǎn)移的受