激光掃描共聚焦顯微GHX

采用激光作為光源，在傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡基礎(chǔ)上，使用紫外或可見光激發(fā)熒光探針，采用共軛聚焦原理和裝置，從而得到細(xì)胞或組織內(nèi)部微細(xì)結(jié)構(gòu)的熒光圖像，在亞細(xì)胞水平上觀察生理信號及細(xì)胞形態(tài)的變化，并利用計(jì)算機(jī)對所觀察的對象進(jìn)行數(shù)字圖象處理的一套集觀察、分析和輸出為一體系統(tǒng)。它把光學(xué)成像的分辨率提高了30%~40%，成為形態(tài)學(xué)，分子生物學(xué)，神經(jīng)科學(xué)，藥理學(xué)，遺傳學(xué)等領(lǐng)域中新一代的研究工具。目前一頁\總數(shù)六十五頁\編于十五點(diǎn)LSCM的發(fā)展1957年提出了共聚焦顯微鏡技術(shù)的某些基本原理，并獲得了美國的專利。1967年成功的應(yīng)用共聚焦顯微鏡產(chǎn)生了一個光學(xué)橫面。1970年牛津和阿姆斯特丹同時向科學(xué)界推薦了一種新型的掃描共聚焦顯微鏡。1984年Bio-Rad公司推出了世界第一臺共聚焦顯微鏡品。1987年White和Amos在英國《自然》雜志發(fā)表了“共聚焦顯微鏡時代的到來”一文，標(biāo)志著LSCM已成為進(jìn)行科學(xué)研究的重要工具。隨后Zeiss、Leica、Meridian等多家公司相繼開發(fā)出不同型號的共聚焦顯微鏡。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，產(chǎn)品的性能也不斷改進(jìn)和更新，應(yīng)用的范圍也越來越廣泛。目前二頁\總數(shù)六十五頁\編于十五點(diǎn)HippocampusneuronsexpressingGFP目前三頁\總數(shù)六十五頁\編于十五點(diǎn)目前四頁\總數(shù)六十五頁\編于十五點(diǎn)目前五頁\總數(shù)六十五頁\編于十五點(diǎn)

目前六頁\總數(shù)六十五頁\編于十五點(diǎn)目前七頁\總數(shù)六十五頁\編于十五點(diǎn)目前八頁\總數(shù)六十五頁\編于十五點(diǎn)目前九頁\總數(shù)六十五頁\編于十五點(diǎn)LSCM與普通熒光顯微鏡的圖像質(zhì)量比較熒光顯微鏡LSCM目前十頁\總數(shù)六十五頁\編于十五點(diǎn)目前十一頁\總數(shù)六十五頁\編于十五點(diǎn)LSCM的重要組件

主要系統(tǒng)包括激光光源、自動顯微鏡、掃描模塊（包括共聚焦光路通道和針孔、掃描鏡、檢測器）、數(shù)字信號處理器、計(jì)算機(jī)以及圖象輸出設(shè)備（顯示器、彩色打印機(jī)）等。目前十二頁\總數(shù)六十五頁\編于十五點(diǎn)目前十三頁\總數(shù)六十五頁\編于十五點(diǎn)激光器顯微鏡：物鏡載物臺計(jì)算機(jī)系統(tǒng)：圖像分析與控制系統(tǒng)目前十四頁\總數(shù)六十五頁\編于十五點(diǎn)激光掃描共聚焦顯微鏡vs熒光顯微鏡激光掃描共聚焦顯微鏡熒光顯微鏡目前十五頁\總數(shù)六十五頁\編于十五點(diǎn)激光作為光源的優(yōu)點(diǎn)單色性強(qiáng)譜線寬度可小于10-8nm方向性強(qiáng)發(fā)射角僅為毫弧度數(shù)量級高亮度相干性好基于上述主要特點(diǎn)，激光作為掃描共聚焦顯微鏡的光源是最理想的波長功率（mW）激光器類型325351457-514543.5632.8700-1100115210-30300251.253.520001氦鎘(He-Cd)激光器帶紫外的水冷氬離子激光小型氬離子激光綠氦氖(He-Ne)激光紅氦氖(He-Ne)激光藍(lán)寶石激光氦氖(He-Ne)激光激光掃描共聚焦顯微鏡中常見的激光器激光器目前十六頁\總數(shù)六十五頁\編于十五點(diǎn)顯微鏡LeicaDMIRBE倒置熒光顯微鏡目前十七頁\總數(shù)六十五頁\編于十五點(diǎn)物鏡目前十八頁\總數(shù)六十五頁\編于十五點(diǎn)LSCM物鏡的重要參數(shù)NA目前十九頁\總數(shù)六十五頁\編于十五點(diǎn)

數(shù)值孔徑又叫做鏡口率，簡寫為N.A。是物鏡的主要技術(shù)參數(shù)，是判斷物鏡性能高低的重要標(biāo)志。N.A=n*sina/2n：物體與物鏡間媒質(zhì)的折射率a\2：物鏡孔徑角的一半溴萘折射率1.66，香柏油1.515，玻璃1.52，水的為1.3，空氣為1。香柏油與玻璃折射率相似，故光折射少，透光率高，成像清楚。

N.A.越大：放大倍數(shù)越大，分辨率越高，N.A.越大：視場寬度與工作距離越小目前二十頁\總數(shù)六十五頁\編于十五點(diǎn)MagnificationNumericalApertureWorkingDistance(mm)AchromatCorrection4x0.1030.0010x0.256.1020x0.402.1040x0.650.6560x0.800.30100x(oil)1.250.18目前二十一頁\總數(shù)六十五頁\編于十五點(diǎn)4x20x10x40x60x100x目前二十二頁\總數(shù)六十五頁\編于十五點(diǎn)載物臺目前二十三頁\總數(shù)六十五頁\編于十五點(diǎn)計(jì)算機(jī)系統(tǒng)目前二十四頁\總數(shù)六十五頁\編于十五點(diǎn)圖像分析與控制系統(tǒng)分析軟件控制軟件+目前二十五頁\總數(shù)六十五頁\編于十五點(diǎn)目前二十六頁\總數(shù)六十五頁\編于十五點(diǎn)目前二十七頁\總數(shù)六十五頁\編于十五點(diǎn)

目前二十八頁\總數(shù)六十五頁\編于十五點(diǎn)激光共聚焦顯微鏡原理目前二十九頁\總數(shù)六十五頁\編于十五點(diǎn)圖1.共聚焦顯微鏡簡化原理圖用于激發(fā)熒光的激光束(Laser)透過入射小孔(lightsourcepinhole)被二向色鏡(Dichroicmirror)反射，通過顯微物鏡(Objectivelens)匯聚后入射于待觀察的標(biāo)本(specimen)內(nèi)部焦點(diǎn)(focalpoint)處。激光照射所產(chǎn)生的熒光(fluorescencelight)和少量反射激光一起，被物鏡重新收集后送往二向色鏡。其中攜帶圖像信息的熒光由于波長比較長，直接通過二向色鏡并透過出射小孔(Detectionpinhole)到達(dá)光電探測器(Detector)（通常是光電倍增管（PMT）或是雪崩光電二極管（APD）），變成電信號后送入計(jì)算機(jī)。而由于二向色鏡的分光作用，殘余的激光則被二向色鏡反射，不會被探測到。目前三十頁\總數(shù)六十五頁\編于十五點(diǎn)共軛目前三十一頁\總數(shù)六十五頁\編于十五點(diǎn)圖2.探測針孔的作用示意圖（解釋了出射小孔所起到的作用）只有焦平面上的點(diǎn)所發(fā)出的光才能透過出射小孔；焦平面以外的點(diǎn)所發(fā)出的光線在出射小孔平面是離焦的，絕大部分無法通過中心的小孔。因此，焦平面上的觀察目標(biāo)點(diǎn)呈現(xiàn)亮色，而非觀察點(diǎn)則作為背景呈現(xiàn)黑色，反差增加，圖像清晰。在成像過程中，出射小孔的位置始終與顯微物鏡的焦點(diǎn)(focalpoint)是一一對應(yīng)的關(guān)系（共軛conjugate）,因而被稱為共聚焦（con-focal）顯微技術(shù)。目前三十二頁\總數(shù)六十五頁\編于十五點(diǎn)LSCM掃描圖像方式單一光學(xué)切片掃描(singleopticalsection,x-y)時程活細(xì)胞掃描(timelapselivecellimaging,x-y-t)三維掃描及重構(gòu)(3-Dreconstruction,x-y-z)四維掃描(4-Dimaging,x-y-z-t)ZXYXY平面目前三十三頁\總數(shù)六十五頁\編于十五點(diǎn)單一光學(xué)切片掃描(singleopticalsection,x-y)Opticalsectionscollectedsimultaneouslyatthreedifferentexcitationwavelengths(488,568,and647nanometers).Thespecimenisthefruitflythirdinstarwingimaginaldisk.XYXY平面目前三十四頁\總數(shù)六十五頁\編于十五點(diǎn)時程活細(xì)胞掃描(timelapselivecellimaging,x-y-t)

XYXY平面timeTime-lapseimagingofalivingfruitflyembryoinjectedwithcalciumgreenispresentedinFigure2.Theseriesofimagesshowsthechangeindistributionofthefluorescentprobeovertime.0s10s20s30s目前三十五頁\總數(shù)六十五頁\編于十五點(diǎn)三維掃描及重構(gòu)(3-Dreconstruction,x-y-z)PeripheralnervoussystemofafruitflyembryoZXYXY平面目前三十六頁\總數(shù)六十五頁\編于十五點(diǎn)三維掃描及重構(gòu)(3-Dreconstruction,x-y-z)目前三十七頁\總數(shù)六十五頁\編于十五點(diǎn)一種高分辨率的顯微成像技術(shù)1用激光做光源，激光單色性好，光源波長相同，從根本上消除了色差。2采用共聚焦技術(shù)在物鏡的焦平面上放置了一個帶有小孔的擋板，將焦平面以外的雜散光擋住，消除了球差，并進(jìn)一步消除了色差。顯微圖象的清晰度和細(xì)節(jié)分辨能力。3采用點(diǎn)掃描技術(shù)將樣品分成無數(shù)個點(diǎn)，用十分細(xì)小的激光束逐點(diǎn)逐行掃描成像，再通過電腦組合成一個整體。傳統(tǒng)的光鏡在場光源下一次成像，標(biāo)本上每一點(diǎn)都會受到相鄰點(diǎn)的衍射光和散射光的干擾。這兩種圖像的清晰度和精密度是無法相比的。目前三十八頁\總數(shù)六十五頁\編于十五點(diǎn)4用計(jì)算機(jī)采集和處理光信號，并利用光電倍增管放大信號，它代替了人眼和照相機(jī)進(jìn)行觀察，攝像，得到的圖像是數(shù)字化的，可以在電腦中進(jìn)行處理，進(jìn)一步提高圖像的清晰度。5觀察活細(xì)胞、活組織：ＬＳＣＭ在不損傷細(xì)胞的前提下,對活組織、活細(xì)胞進(jìn)行觀察和測量，這不僅省去了繁瑣的樣品前期處理過程(如脫水、脫蠟、染色等);而且觀察過的樣品還可以繼續(xù)用于其他的研究。這種功能對于細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)基因研究尤為重要。這可以說是ＬＳＣＭ最大的優(yōu)勢。目前三十九頁\總數(shù)六十五頁\編于十五點(diǎn)6生化成分精確定位觀察配合專用的分子探針,對于要檢測的成分不僅可以定位到細(xì)胞水平,還可以定位到亞細(xì)胞水平和分子水平。7動態(tài)觀察在同一樣品平面上隨時間進(jìn)行連續(xù)掃描,就可分析細(xì)胞結(jié)構(gòu)、內(nèi)含、和標(biāo)記等動力學(xué)變化。目前在這方面做得最多的是使用ＬＳＣＭ觀察心肌或平滑肌細(xì)胞內(nèi)游離鈣、鈉、鉀離子濃度或ｐＨ的動態(tài)變化。8定量測量：首先應(yīng)用專一的熒光探針對樣品進(jìn)行染色,樣品的熒光強(qiáng)度和所測成分的含量呈正比,如果其余條件固定,通過對比各組樣品之間的熒光強(qiáng)度值,可得出特定成分的含量比。目前四十頁\總數(shù)六十五頁\編于十五點(diǎn)應(yīng)用范圍細(xì)胞生物學(xué)：細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞骨架、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、流動性、受體、細(xì)胞器結(jié)構(gòu)和分布變化生物化學(xué)：酶、核酸、FISH（熒光原位雜交）、受體分析藥理學(xué)：藥物對細(xì)胞的作用及其動力學(xué)生理學(xué)：膜受體、離子通道、細(xì)胞內(nèi)離子含量、分布動態(tài)神經(jīng)生物學(xué)：神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)、神經(jīng)遞質(zhì)的成分、運(yùn)輸和傳遞、遞質(zhì)受體、離子內(nèi)外流、神經(jīng)組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞分布微生物學(xué)和寄生蟲學(xué)：細(xì)菌、寄生蟲形態(tài)結(jié)構(gòu)病理學(xué)及臨床應(yīng)用：活檢標(biāo)本診斷、腫瘤診斷、自身免疫性疾病診斷、HIV等遺傳學(xué)和組胚學(xué)：細(xì)胞生長、分化、成熟變化、細(xì)胞的三維結(jié)構(gòu)、染色體分析、基因表達(dá)、基因診斷目前四十一頁\總數(shù)六十五頁\編于十五點(diǎn)LSCM在生物學(xué)上的應(yīng)用熒光組織化學(xué)動態(tài)熒光測量(細(xì)胞內(nèi)鈣測量、細(xì)胞內(nèi)pH測量、細(xì)胞膜流動性測量、膜電位測定)細(xì)胞間隙連接的細(xì)胞間通訊目前四十二頁\總數(shù)六十五頁\編于十五點(diǎn)熒光探針的選擇合適的熒光探針是有效地進(jìn)行實(shí)驗(yàn)并獲取理想實(shí)驗(yàn)結(jié)果的保障。(1)現(xiàn)有儀器所采用的激光器(2)熒光探針的光穩(wěn)定性和光漂白性(3)熒光的定性或定量定性:單波長激發(fā)探針定量:雙波長激發(fā)比率探針(4)熒光探針的特異性和毒性。(5)熒光探針適用的pH目前四十三頁\總數(shù)六十五頁\編于十五點(diǎn)

*不同的熒光探針在不同標(biāo)本的效果常有差異，故除綜合考慮以上因素以外，有條件者應(yīng)進(jìn)行染料的篩選，以找出最適的熒光探針。*許多熒光探針是疏水性的，很難或不能進(jìn)入細(xì)胞，需使熒光探針與AM（乙酰羥甲基酯）結(jié)合后變成不帶電荷的親脂性化合物方易于通過質(zhì)膜進(jìn)入細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)熒光探針上的AM被非特異性酯酶水解，去掉AM后的熒光探針不僅可與細(xì)胞內(nèi)的靶結(jié)構(gòu)或靶分子結(jié)合且不易透出質(zhì)膜，從而能有效的發(fā)揮作用。目前四十四頁\總數(shù)六十五頁\編于十五點(diǎn)常見應(yīng)用及其熒光探針

1．細(xì)胞內(nèi)游離鈣共聚焦激光掃描顯微鏡常用的有Fluo-3、Fluo-4、Rhod-1、Rhod-2、Indo-1、Fura-2等，前四者為單波長熒光探針，利用其單波長激發(fā)特點(diǎn)可直接測量細(xì)胞內(nèi)Ca2+動態(tài)變化，為鈣定性探針；后兩者為雙波長激發(fā)探針，利用其雙波長激發(fā)特點(diǎn)和比率技術(shù)，能定量細(xì)胞內(nèi)鈣，為鈣定量探針。目前四十五頁\總數(shù)六十五頁\編于十五點(diǎn)

2．DNA和RNA核酸的熒光探針用于共聚焦激光掃描顯微鏡的主要有AcridineOrange(吖啶橙，AO)、PropidiumIodide(碘化丙啶，PI)。兩種染料既可標(biāo)記DNA又可標(biāo)記RNA，如為獲得單獨(dú)的DNA或RNA分布，染色前可用RNA酶或DNA酶處理細(xì)胞。PI不能進(jìn)入完整的細(xì)胞膜，故不能標(biāo)記活細(xì)胞內(nèi)的DNA和RNA。目前四十六頁\總數(shù)六十五頁\編于十五點(diǎn)

3．膜電位共聚焦激光掃描顯微鏡則可利用熒光探針在細(xì)胞膜內(nèi)外分布的差異測出膜電位，不但可以觀察細(xì)胞膜電位的變化結(jié)果，更重要的是可以用于連續(xù)監(jiān)測膜電位的迅速變化。

DiBAC4(3)：帶負(fù)電荷慢反應(yīng)染料。本身無熒光，當(dāng)進(jìn)入細(xì)胞與胞漿內(nèi)的蛋白質(zhì)結(jié)合后才發(fā)出熒光，測量時要求細(xì)胞浸在熒光染料中。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度增加即膜電位；反之，即膜電位降低。Rhodamine123：主要用于線粒體膜電位測量。是一種親脂性陽離子熒光探針，當(dāng)線粒體膜內(nèi)側(cè)負(fù)電荷增多時，熒光強(qiáng)度增加，與DiBAC4(3)的表示形式相反。目前四十七頁\總數(shù)六十五頁\編于十五點(diǎn)

4．細(xì)胞內(nèi)活性氧基：活性氧(activeoxygenspecies)可影響細(xì)胞代謝，與蛋白質(zhì)、核酸、脂類等發(fā)生反應(yīng)，有些反應(yīng)是有害的，因此測量活性氧在毒理學(xué)研究中有一定的意義。常用熒光探針有Dichlorodihydrofluoresceindiacetate(2，7-二氯二氫熒光素乙酰乙酸、H2DCFDA)，其原理是不發(fā)熒光的H2DCFDA進(jìn)入細(xì)胞后能被存在的過氧化物、過氧化氫等氧化分解為二氯熒光黃（dichlorofluorescein，DCF)而產(chǎn)生熒光。目前四十八頁\總數(shù)六十五頁\編于十五點(diǎn)

5．細(xì)胞間通訊：熒光光漂白恢復(fù)(fluorescencerecoveryafterphotobleading，F(xiàn)RAP)技術(shù)可用于檢測細(xì)胞縫隙連接通訊。該方法的原理是一個細(xì)胞內(nèi)的熒光分子被激光漂白或淬滅，失去發(fā)光能力。而臨近未被漂白細(xì)胞中的熒光分子可通過縫隙連接擴(kuò)散到已被漂白的細(xì)胞中，熒光可以逐漸恢復(fù)。由于光漂白過程是不可逆的，因此可通過觀察已發(fā)生熒光漂白細(xì)胞其熒光恢復(fù)過程的變化量來判斷細(xì)胞縫隙連接的通訊功能。目前四十九頁\總數(shù)六十五頁\編于十五點(diǎn)

6．細(xì)胞膜流動性：熒光光漂白恢復(fù)(FRAP)技術(shù)。利用NBD-C6-HPC標(biāo)記膜磷脂，然后用高強(qiáng)度的激光束照射活細(xì)胞膜表面的某一區(qū)域(1～2μm)，使該區(qū)域的熒光淬滅或漂白，再用較弱的激光束照射該區(qū)域?？蓹z測到細(xì)胞膜上其他地方未被漂白的熒光探針流動到漂白區(qū)域時的熒光重新分布情況。熒光恢復(fù)的速率和程度可提供有關(guān)的信息。目前五十頁\總數(shù)六十五頁\編于十五點(diǎn)

7．細(xì)胞亞微結(jié)構(gòu)(細(xì)胞器探針）共聚焦激光掃描顯微鏡可獲得較高分辨率的細(xì)胞內(nèi)線粒體、高爾基復(fù)合體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體等細(xì)胞器圖像，同時還可動態(tài)觀察活細(xì)胞狀態(tài)下細(xì)胞器的形態(tài)學(xué)變化情況，此外還可通過光學(xué)切片即斷層掃描技術(shù)進(jìn)行三維重建，顯示細(xì)胞器的空間關(guān)系及其變化。適用于線粒體的熒光探針較多，如Mitotracker、DASPMI、DASPEI、JC-1、羅丹明123等。高爾基復(fù)合體常用的熒光探針有NBD?；拾贝迹╟eramide）、BODIPY酰基鞘氨醇。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)主要用Dil、DiOC6(3)。溶酶體的熒光探針有DAMP、neutralred。目前五十一頁\總數(shù)六十五頁\編于十五點(diǎn)

8.pH值正常細(xì)胞胞漿內(nèi)的pH一般在6.8～7.4的范圍，而某些細(xì)胞器如溶酶體的pH則在4.5～6.0之間。根據(jù)檢測對象pH的不同將熒光探針分為用于偏中性和酸性兩類。常用于偏中性pH即細(xì)胞胞漿pH檢測的熒光探針有SNARF類(SNARF-1、SNARF-calcein)、SNAFL類(SNAFL-1、SNAFL-calcein)、BCECF等，這些探針均為疏水性探針，須使用其AM形式。FITC-dextran則適用于pH范圍4～6之間，如溶酶體pH的檢測，該探針也不能透過質(zhì)膜，但可通過細(xì)胞胞飲作用進(jìn)入溶酶體，因此應(yīng)選擇分子量稍小的Dextran(葡聚糖)。目前五十二頁\總數(shù)六十五頁\編于十五點(diǎn)

9．標(biāo)記抗體、配體等常用的熒光探針共聚焦激光掃描顯微鏡不僅可用免疫熒光分析固定的細(xì)胞或組織切片，還可用于分析活細(xì)胞，得到特異性抗體或其他熒光免疫探針識別靶分子的表達(dá)、定位、分布變化等信息。10．檢測酶活性的熒光探針共聚焦激光掃描顯微鏡在檢測活細(xì)胞酶活性動態(tài)變化方面有著無可比擬的優(yōu)勢。通過對細(xì)胞施予不同的處理因素可檢測細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)的酶被激活或滅活的動態(tài)變化過程。有的酶熒光探針是自身就可發(fā)出熒光、有的是與酶結(jié)合后發(fā)出熒光、有的則是被酶分解后發(fā)出熒光。目前五十三頁\總數(shù)六十五頁\編于十五點(diǎn)實(shí)例1細(xì)胞內(nèi)游離鈣的測量鈣的熒光探針Fura-2最常用的比例測量法熒光探針，激發(fā)峰為340/380nm，發(fā)射波長在505-520nm之間。Fura-2可以和鈣離子結(jié)合，結(jié)合鈣離子后在330-350nm激發(fā)光下可以產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光，而在380nm激發(fā)光下則會導(dǎo)致熒光減弱。這樣就可以使用340nm和380nm這兩個熒光的比值來檢測細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度，可以消除不同細(xì)胞樣品間熒光探針裝載效率的差異，熒光探針的滲漏，細(xì)胞厚度差異等一些誤差因素。目前五十四頁\總數(shù)六十五頁\編于十五點(diǎn)實(shí)例1測定爪蟾卵母細(xì)胞內(nèi)鈣變化手術(shù)分離卵母細(xì)胞膠原酶消化中和消化液，停止消化18C靜止細(xì)胞4小時，以備后用Xenopusoocytes目前五十五頁\總數(shù)六十五頁\編于十五點(diǎn)卵母細(xì)胞微注射Calciumgreen用細(xì)胞內(nèi)液稀釋Calciumgreen導(dǎo)入微注射器以20nL/oocyte注射卵母細(xì)胞18C避光放置40分鐘共聚焦顯微鏡觀察目前五十六頁\總數(shù)六十五頁\編于十五點(diǎn)IP3引起的卵母細(xì)胞內(nèi)鈣升高目前五十七頁\總數(shù)六十五頁\編于十五點(diǎn)實(shí)例2Fluo-4測定HEK293細(xì)胞內(nèi)鈣變化前一天HEK293消化傳代Fluo-4AM孵育液的配制Fluo-4AM5uM+20%F127避光孵育HEK細(xì)胞15分鐘DMEM+10%FBS沖洗細(xì)胞2次在細(xì)胞外液中避光靜置30分鐘移入共聚焦顯微鏡載物臺，進(jìn)行觀察目前五十八頁\總數(shù)六十五頁\編于十五點(diǎn)目前五十九頁\總數(shù)六十五頁\編于十五點(diǎn)目前六十頁\總數(shù)六十五頁\編于十五點(diǎn)目前六十一頁\總數(shù)六十五頁\編于十五點(diǎn)實(shí)例3細(xì)胞膜磷脂PIP2的動態(tài)測定HEK293cellsexpressingPLC-PH-GFPPLC-PH-GFP+H1receptorLipofactAMINE2000混合20分鐘混合物孵育細(xì)胞4-6小時洗掉轉(zhuǎn)染液，加入正常培養(yǎng)液，培養(yǎng)24hLSCM觀察目前六十二頁\總數(shù)六十五頁\編于十五點(diǎn)ControlHistaminewashout實(shí)例3細(xì)胞膜磷脂PIP2的動態(tài)測定HEK293cellsexpressingPLC-PH-GFPA目前六十三頁\總數(shù)六十五頁\編于十五點(diǎn)BoyiLiu,HuilingLiang,LiLiuandHailinZhangPhosphatidylinositol4,5-bisphosphatehydrolysismediateshistamine-inducedKCNQ/Mcurrentinhibition.AmJPhysiolCellPhysiol.2008ZhanfengJia,YueqinJia,BoyiLiu,ZhiyingZhao,QingzhongJia,Huil