白前苷B對肝損傷保護作用及機理研究

白前苷B對肝損傷保護

作用及機理的研究答辯人：梁爽專業(yè)：藥理學導師：李沛波講師目前一頁\總數五十五頁\編于十二點學位論文原創(chuàng)性聲明

本人鄭重聲明：所呈交的學位論文，是本人在導師的指導下，獨立進行研究工作所取得的成果。除文中已經注明引用的內容外，本論文不包含任何其他個人或集體已經發(fā)表或撰寫過的作品成果。對本文的研究作出重要貢獻的個人和集體，均已在文中以明確方式標明。本人完全意識到本聲明的法律結果由本人承擔。目前二頁\總數五十五頁\編于十二點目錄總結

白前苷B對D-GalN/LPS誘導小鼠急性肝損傷保護作用及機制研究

白前苷B對GCDC誘導肝細胞凋亡保護作用及機制研究白前苷B提取分離及檢測研究目的、研究內容背景

創(chuàng)新點

展望

目前三頁\總數五十五頁\編于十二點一、背景—肝損傷的研究概況指標影響分類機理模型肝損傷目前四頁\總數五十五頁\編于十二點一、背景—肝損傷概況

肝損傷引發(fā)的肝臟疾病已成為常見病、多發(fā)病。肝損傷可導致肝纖維化，肝硬化,是肝癌發(fā)生的重要始動因素。發(fā)病率和死亡率高，極大地威脅著人類的健康。我國現有各類型肝病患者已超過2億之眾，其中乙肝病毒攜帶者約9300萬，每年新增病例超過100萬人，治療費用達1000億人民幣以上。對肝臟疾病的治療已成為研究熱點，但迄今尚無治療肝病的特效藥物，因此需要尋找一種有效預防和治療肝損傷的藥物。目前五頁\總數五十五頁\編于十二點藥物性肝損傷感染性肝損傷酒精性肝損傷缺血再灌注肝損傷膽汁淤積性肝損傷急性肝損傷慢性肝損傷免疫性肝損傷化學性肝損傷一、背景—肝損傷的分類發(fā)病速度發(fā)病原因發(fā)病機理目前六頁\總數五十五頁\編于十二點一、背景—肝損傷的機理質膜損害線粒體功能障礙胞內離子濃度改變降解酶被激活自由基損害

免疫性肝損傷化學性肝損傷細胞因子作用NO作用補體系統(tǒng)激活細胞間的協(xié)作

免疫變態(tài)反應

細胞凋亡

受體介導途徑顆粒-排粒途徑通過基因調控目前七頁\總數五十五頁\編于十二點一、背景—肝損傷實驗模型手術造成肝損傷模型5酒精性肝損傷模型4黃疸性肝損傷模型

3免疫性肝損傷模型

2化學性肝損傷模型

1目前八頁\總數五十五頁\編于十二點CCl4誘導肝損傷

PAPA誘導肝損傷

其它

DMN誘導肝損傷

TTA誘導肝損傷

D-GalN誘導肝損傷

化學性肝損傷模型最早，最廣泛的選擇性肝毒性物質。與病毒性肝炎所造成的損傷類似常見的致肝癌劑

急性藥物肝功能損傷模型

接近人類肝硬化

乙硫氨酸甲基偶氮苯黃曲霉素

目前九頁\總數五十五頁\編于十二點BCG/LPS誘導法

異種血清法

D-GalN/LPS

誘導法

conA誘導法

免疫性肝損傷模型肝炎免疫性肝損傷機制相似常用于肝纖維化模型，以豬血清最為常用

目前十頁\總數五十五頁\編于十二點

此方法誘發(fā)的動物肝損傷模型被公認為與臨床上急性重癥肝炎（急性肝壞死）病情相似。其損傷機制為：D-GalN為特異性肝細胞損傷藥物，可促使肥大細胞釋放組胺，引發(fā)結腸水腫，腸源性內毒素吸收增加。因此，經D-GalN處理后的動物,接受很小劑量的外源性LPS即可以引起以肝臟細胞凋亡為主要特征的急性肝損傷。其損傷過程中產生大量的炎癥因子，與濕熱黃疸發(fā)病機制最相似。

D-GalN/LPS

誘導法

目前十一頁\總數五十五頁\編于十二點膽汁酸及其鹽誘導黃疸性肝損傷ANIT所致小鼠黃疸性肝損傷

膽管結扎致梗阻性黃疸

ABC黃疸性肝損傷模型目前十二頁\總數五十五頁\編于十二點

膽汁在細胞內的堆積是導致黃疸性肝細胞損傷的主要原因之一。GCDC是人體內作用最強的膽汁酸。其作用機理包括：

1.對細胞產生毒性，誘導肝細胞壞死

2.誘導肝細胞凋亡3.氧化應激作用

4.誘導線粒體功能失調膽汁酸及其鹽誘導黃疸性肝損傷A目前十三頁\總數五十五頁\編于十二點1.????其它細胞活性及凋亡內皮細胞生化指標氧化指標MDA,SOD,GSH-Px,CAT,LPO

ALT,AST,LDH,血清總膽紅素,甘油三脂

透明質酸,ET

MTT，FCM，TUNEL

相關基因，受體及其酶

組織觀察

HE染色,Masson三色膠原染色,電子透射電鏡檢查

Na-K-ATP酶，Ca-ATP酶，Ca

2+一、背景—肝損傷的實驗檢測指標目前十四頁\總數五十五頁\編于十二點一、背景—中藥抗肝損傷作用研究概況

中藥作為我國的特色藥物，因其副作用低，而且在保肝退黃方面獨具優(yōu)勢，逐漸受到了大家的關注。對于肝損傷保護的中藥研究，主要有抗內毒素治療及抗自由基、促進肝細胞再生、調節(jié)免疫功能、改善微循環(huán)和抗細胞凋亡等。

目前已開發(fā)出很多療效確切的活性物質用于肝損傷的治療。其中包括：甘草—甘草酸、苦參–苦參堿、黃芩—黃芩苷等。目前十五頁\總數五十五頁\編于十二點一、背景—田基黃及白前苷B

田基黃民間用于治療濕熱黃疸，臨床常用于急、慢性肝炎的治療，1977版中國藥典就已收載了以田基黃為原料制成的田基黃注射液?，F代藥理學研究證明田基黃對免疫性、感染性、膽汁淤積性肝損傷具有保護作用。

目前十六頁\總數五十五頁\編于十二點一、背景—田基黃及白前苷B研究基礎本實驗室研究表明：（1）田基黃的有效部位為黃酮類化合物，目前十七頁\總數五十五頁\編于十二點一、背景—田基黃及白前苷B研究基礎（2）白前苷B是黃酮類化合物中含量較高

目前十八頁\總數五十五頁\編于十二點一、背景—田基黃及白前苷B研究基礎（3）白前苷B提取分離

目前十九頁\總數五十五頁\編于十二點一、背景—田基黃及白前苷B研究基礎（4）白前苷B對D-GalN、CCl4所致化學性肝損傷和ANIT、BDL所致黃疸性肝損傷具有顯著保護作用。

目前二十頁\總數五十五頁\編于十二點二、研究目的

本文的研究目的是：以白前苷B為研究對象，利用體內外實驗方法，結合田基黃的功用（治療濕熱黃疸），對其進行肝損傷保護作用及機理的研究。目前二十一頁\總數五十五頁\編于十二點三、研究思路田基黃具有清熱利濕解毒之功，用于治療濕熱黃疸（1）黃疸（2）濕熱目前二十二頁\總數五十五頁\編于十二點三、研究思路231白前苷B的提取分離體外實驗，選擇GCDC誘導肝細胞凋亡模型，闡明白前苷B的退黃機理

動物實驗，選擇D-GalN/LPS誘導小鼠肝損傷模型，對白前苷B保肝的作用及其機制進行研究。

1目前二十三頁\總數五十五頁\編于十二點四、白前苷B的提取分離—方法水提液制備白前苷B分離含量測定水提醇沉法聚酰胺吸附60%乙醇洗脫HPLC目前二十四頁\總數五十五頁\編于十二點四、白前苷B的提取分離—結果圖2-1白前苷B對照品HPLC圖譜圖2-2提取物HPLC圖譜名稱供試品濃度（mg/ml）峰面積含量樣品0.5629623.8098.30%白前苷B含量計算結果目前二十五頁\總數五十五頁\編于十二點四、白前苷B的提取分離及檢測—小結

本實驗中主要采用了水提醇沉、聚酰胺柱層析、重結晶，獲得一個單體化合物，經過HPLC與對照品比較，其保留時間一致。從紫外光譜圖上看，此樣品UVI（nm）為257.8；UVII（nm）分別為376.5，與白前苷B對照品一致。因此，故推斷該單體化合物為白前苷B，計算其純度達到98.3%。

目前二十六頁\總數五十五頁\編于十二點五、白前苷B對GCDC誘導人正常肝細L-02凋亡保護作用及機理研究—方法細胞內鈣離子：激光共聚焦顯微鏡線粒體膜電位：RH123染色氧化相關指標：ROS，GSH細胞活性：MTT，細胞凋亡：HOE33258染色

AnnexinV/pI染色白前苷B抗凋亡作用機制白前苷B對凋亡保護作用白前苷B安全范圍檢測肝損傷模型的建立MTT法檢測細胞活性

GCDC誘導肝細胞凋亡目前二十七頁\總數五十五頁\編于十二點五、白前苷B對GCDC誘導人正常肝細L-02凋亡保護作用及機理研究—結果1、GCDC對L-02肝細胞活性的影響

注：與空白對照組比較：*p<0.05,**P<0.01。細胞存活率與GCDC呈劑量依賴關系

目前二十八頁\總數五十五頁\編于十二點五、白前苷B對GCDC誘導人正常肝細L-02凋亡保護作用及機理研究—結果2、Hoechst33258染色注：與空白對照組比較：*p<0.05,**P<0.01。隨著GCDC的給藥劑量增加，凋亡小體明顯增多，凋亡率增加，結果與MTT一致。目前二十九頁\總數五十五頁\編于十二點五、白前苷B對GCDC誘導人正常肝細L-02凋亡保護作用及機理研究—結果

注：圖中以AnnexinV為橫軸，PI為縱軸；左上象限為機械性損傷細胞；右上為晚期凋亡細胞或者壞死細胞；左下為陰性正常細胞；右下為早期凋亡細胞。注：與空白對照組比較：*

p<0.05,**P<0.01。3、GCDC對L-02細胞凋亡率的影響

隨著GCDC給藥劑量增加，細胞凋亡（Q4區(qū)）明顯增加。

目前三十頁\總數五十五頁\編于十二點五、白前苷B對GCDC誘導人正常肝細L-02凋亡保護作用及機理研究—結果4、線粒體膜電位變化

如圖所示，隨GCDC給藥劑量增加，熒光強度逐漸減少，證明線粒體膜電位逐漸下降，細胞凋亡增加。目前三十一頁\總數五十五頁\編于十二點五、白前苷B對GCDC誘導人正常肝細L-02凋亡保護作用及機理研究—結果

Ca2+被認為與細胞凋亡誘導和抑制的信號轉導通路有關。隨著GCDC給藥量增加，細胞內Ca2+濃度逐漸增加，細胞凋亡增加。注：與空白對照組比較：**P<0.01。5、細胞內鈣離子濃度變化目前三十二頁\總數五十五頁\編于十二點五、白前苷B對GCDC誘導人正常肝細L-02凋亡保護作用及機理研究—結果

6、細胞內ROS變化注：與空白對照組比較：*p<0.05,**P<0.01。ROS產物的增多檢測是細胞氧化應激反應的重要指標，隨著GCDC給藥量的增加，ROS釋放量增加。目前三十三頁\總數五十五頁\編于十二點五、白前苷B對GCDC誘導人正常肝細L-02凋亡保護作用及機理研究—結果7、細胞內GSH變化注：與空白對照組比較：**P<0.01。

隨著GCDC的給藥量增加，細胞內的GSH有明顯的降低。細胞內ROS升高，是造成細胞內GSH降低的原因之一。

目前三十四頁\總數五十五頁\編于十二點五、白前苷B對GCDC誘導人正常肝細L-02凋亡保護作用及機理研究—小結

本實驗根據文獻報道及細胞凋亡相關機理，選用線粒體膜電位、鈣離子濃度及氧化應激相關指標檢測，確定GCDC誘導L-02肝細胞凋亡最佳濃度為100μmol/L。目前三十五頁\總數五十五頁\編于十二點五、白前苷B對GCDC誘導人正常肝細L-02凋亡保護作用及機理研究—結果

1、白前苷B安全濃度范圍

注：本實驗中選擇白前苷B的最大作用濃度為250μmol/L為含有1%DMSO溶劑所能溶解的最大劑量。目前三十六頁\總數五十五頁\編于十二點五、白前苷B對GCDC誘導人正常肝細L-02凋亡保護作用及機理研究—結果2、白前苷B對GCDC處理的肝細胞的存活率影響

注：與空白對照組比較：##P<0.01;與GCDC組比較:*P<0.05,**P<0.01。

白前苷B對GCDC誘導的肝細胞存活率降低有保護作用，并且有劑量依賴性。

GCDC100μM目前三十七頁\總數五十五頁\編于十二點五、白前苷B對GCDC誘導人正常肝細L-02凋亡保護作用及機理研究—結果3、Hoechst33258染色檢測對細胞凋亡的保護注：與空白對照組比較：##P<0.01;

與GCDC組比較:*P<0.05,**P<0.01。隨著白前苷B的給藥劑量增加，凋亡小體明顯減少，細胞凋亡率降低，高濃度時與正常相似。說明白前苷B細胞凋亡有保護作用。正常對照GCDC100μM目前三十八頁\總數五十五頁\編于十二點五、白前苷B對GCDC誘導人正常肝細L-02凋亡保護作用及機理研究—結果

注：與空白對照組比較：##P<0.01;與GCDC組比較:

**P<0.01。4、白前苷B對細胞凋亡率的影響

隨著白前苷B給藥劑量增加，細胞凋亡（Q4區(qū)）明顯減少，證明白前苷B對GCDC誘導的早期肝細胞凋亡有明顯的保護作用。

注：圖中以AnnexinV為橫軸，PI為縱軸；左上象限為機械性損傷細胞；右上為晚期凋亡細胞或者壞死細胞；左下為陰性正常細胞；右下為早期凋亡細胞。GCDC100μM目前三十九頁\總數五十五頁\編于十二點五、白前苷B對GCDC誘導人正常肝細L-02凋亡保護作用及機理研究—結果

5、細胞線粒體膜電位白前苷B對肝細胞凋亡的保護作用與線粒體途徑相關。目前四十頁\總數五十五頁\編于十二點五、白前苷B對GCDC誘導人正常肝細L-02凋亡保護作用及機理研究—結果6、白前苷B對細胞內鈣離子濃度的影響

注：與空白對照組比較：##P<0.01;與GCDC組比較:**P<0.01。GCDC100μM白前苷B給藥組可以逆轉GCDC誘導的細胞內Ca2+濃度升高。證明其保護肝細胞凋亡機理與調節(jié)細胞內Ca2+濃度相關。

目前四十一頁\總數五十五頁\編于十二點五、白前苷B對GCDC誘導人正常肝細L-02凋亡保護作用及機理研究—結果

7、白前苷B肝細胞內ROS的影響注：與空白對照組比較：##P<0.01;與GCDC組比較:*P<0.05，**P<0.01。

說明白前苷B對GCDC造成的肝細胞凋亡有明顯的保護作用，其保護作用機制與抗細胞氧化作用相關。GCDC100μM目前四十二頁\總數五十五頁\編于十二點五、白前苷B對GCDC誘導人正常肝細L-02凋亡保護作用及機理研究—結果8、白前苷B對GCDC誘導細胞內GSH的影響

注：與空白對照組比較：##P<0.01;與GCDC組比較:**P<0.01。GCDC100μMGCDC可以產生細胞內氧化應激作用，使GSH降低，對肝細胞造成損傷，而白前苷B則對此產生保護作用。綜合上述ROS檢測，充分證明白前苷B保護肝細胞凋亡作用機制與抗細胞氧化應激作用相關。目前四十三頁\總數五十五頁\編于十二點五、白前苷B對GCDC誘導人正常肝細L-02凋亡保護作用及機理研究—小結

本實驗結果表明：白前苷B在50—200μmol/L劑量范圍內對GCDC誘導的黃疸性肝細胞凋亡有保護作用，并有明顯的劑量依賴性。研究證明白前苷B抑制肝細胞凋亡的作用機理是：降低細胞內線粒體膜電位、抑制細胞內Ca2+的釋放增多以及保護細胞氧化應激作用。目前四十四頁\總數五十五頁\編于十二點六、白前苷B對D-GalN/LPS誘導的肝損傷保護作用及機制的研究—方法肝細胞凋亡的檢測

mRNA及蛋白水平TNF-α

、IL-6

的表達肝組織結構HE染色血清及肝組織相關生化指標檢測

抑制小鼠死亡的量效關系實驗

對小鼠肝損傷保護作用及機理研究

抑制小鼠死亡的時效關系實驗

血清：ALT、AST、總膽紅素肝組織：MDA、GSH、NO目前四十五頁\總數五十五頁\編于十二點六、白前苷B對D-GalN/LPS誘導的肝損傷保護作用機制的研究—結果1、量效關系及時效關系研究ED50=4.01（）mg/kg目前四十六頁\總數五十五頁\編于十二點六、白前苷B對D-GalN/LPS誘導的肝損傷保護

作用及機制的研究—結果（n=10）組別ALT（卡門氏）AST（卡門氏）總膽紅素（μmol/L）空白對照39.49±10.1551.69±14.517.64±2.60D-GalN/LPS263.91±4.86##297.64±48.92##32.33±2.85##白前苷B低劑量239.45±6.81**188.84±24.55**20.44±1.81**白前苷B中劑量196.63±22.34**132.19±18.45**17.83±2.74**白前苷B高劑量100.94±19.35**66.43±15.7**11.54±1.61**（n=10）

組別NO（umol/gprot）MDA（nmol/mgprot）GSH（mgGSH/gprot）空白對照1.27±0.101.16±0.172.37±0.59D-GalN/LPS1.95±0.17##2.47±0.25##0.38±0.06##白前苷B低劑量1.71±0.26*1.93±0.16**0.60±0.06**白前苷B中劑量1.52±0.02**1.60±0.11**0.80±0.13**白前苷B高劑量1.37±0.10**1.33±0.24**1.43±0.39**注：與空白對照組比較：##P<0.01;與GCDC組比較:

*P<0.05,**P<0.01。

白前苷B具有保肝降酶、退黃作用。

白前苷B能提高肝臟抗氧化能力。2、血清及組織生化指標目前四十七頁\總數五十五頁\編于十二點六、白前苷B對D-GalN/LPS誘導的肝損傷保護作用及機制的研究—結果3、HE染色觀察肝組織結構

肝組織結構清楚，肝索排列整齊，細胞核較大，核仁明顯，結構清晰，肝細胞無變性、壞死、出血。肝索排列紊亂，細胞核明顯不等，呈不同程度的固縮，細胞界限不清，并可見點狀壞死。肝小葉周邊肝細胞出現中至重度脂肪變性，細胞脂質，呈空泡狀。

治療各組，隨給藥劑量增加，肝組織結構逐漸清晰，高劑量組肝索結構排列與空白對照組相似，細胞碎片減少，細胞核結構恢復。目前四十八頁\總數五十五頁\編于十二點六、白前苷B對D-GalN/LPS誘導的肝損傷保護作用及機制的研究—結果4、HOE33342染色圖

細胞核彌散均勻藍色熒光

細胞核則出現濃染致密顆粒塊狀熒光，染色不均勻，核呈固縮圓珠狀，有大量碎片存在，染色質邊聚。

隨給藥劑量增加，核固縮數量減少，染色質邊聚和碎片也逐漸減少，高劑量組細胞核形態(tài)恢復與正常對照組相似。目前四十九頁\總數五十五頁\編于十二點六、白前苷B對D-GalN/LPS誘導的肝損傷保護作用及機制的研究—結果（

n=10）組別TNF-α（ng/L）IL-6（pg/ml）空白對照30.88±10.4042.07±9.26D-GalN/LPS437.99±50.97##324.49±13.27##白前苷B低劑量253.01±20.64**197.39±22.55**白前苷B中劑量177.52±8.01**132.46±19.25**白前苷B高劑量93.04±28.27**67.97±12.71**注：與空白對照組比較：##P<0.01;與GCDC組比較:

*P<0.05,**P<0.01。

ABCDE

TNF-α

IL-6

β-actinA空白組B造模組C低劑量組D中劑量組E高劑量組5、TNF-α和IL-6蛋白及mRNA水平表達

白前苷B對D-GalN/LPS所致的小鼠急性肝損傷起到保肝護肝作用機理與調節(jié)免疫應答有關，通過調節(jié)炎癥相關細胞因子而實現。

白前苷B可能通過下調TNF-α和IL-6的表達，使肝細胞炎癥和壞死得以減輕，凋亡減少，從而對急性肝損傷起保護作用。目前五十頁\總數五十五頁\編于十二點六、白前苷B對D-GalN/LPS誘導的肝損傷保護作用及機制的研究—小結

本實驗通過對生化指標、組織切片、細胞凋亡以及細胞因子的檢測，結果表明白前苷B對D-GalN/LPS誘導的小鼠急性肝損傷模型有保護作用。