基因表達(dá)的半定量PCR檢測(cè)

基因表達(dá)的半定量PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模阂詂DNA為模板，利用PCR技術(shù)制備目的基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶（Glyceraldehyde3-phosphatedehydrogenase,GAPDH）的大量拷貝，以便進(jìn)行目的基因的克??；此實(shí)驗(yàn)還包括PCR引物設(shè)計(jì)，PCR產(chǎn)物的瓊脂糖電泳檢測(cè)等內(nèi)容。實(shí)驗(yàn)原理:真核細(xì)胞含有三類基本RNA:核糖體RNA（rRNA）、信使RNA（mRNA）、轉(zhuǎn)移RNA（tRNA）。其中mRNA傳遞合成蛋白質(zhì)的全部遺傳信息，是蛋白質(zhì)生物合成的中間環(huán)節(jié)，具有特殊意義。Trizol試劑可從細(xì)胞中快速提取細(xì)胞總RNA，將其中的mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以一對(duì)特異性引物對(duì)目的。DNA進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增。由于每個(gè)循環(huán)中合成的引物延伸產(chǎn)物可作為下一循環(huán)中的模板，因而每次循環(huán)中靶DNA的拷貝數(shù)呈幾何級(jí)數(shù)增長(zhǎng)，因此，30次PCR循環(huán)將產(chǎn)生約1億倍（230）的擴(kuò)增片段。PCR技術(shù)又稱聚合酶鏈反應(yīng)（PolymeraseChainReaction）技術(shù)，是一種在體外（試管）擴(kuò)增核酸的技術(shù)。該技術(shù)模擬體內(nèi)天然DNA的復(fù)制過程。其基本原理是在模板、引物、4種dNTP和耐熱DNA聚合酶（TaqDNApolymerase）存在的條件下，特異擴(kuò)增位于兩段已知序列之間的DNA區(qū)段的酶促合成反應(yīng)。每一循環(huán)包括高溫變性、低溫退火、中溫延伸三步反應(yīng)。每一循環(huán)的產(chǎn)物作為下一個(gè)循環(huán)的模板，如此循環(huán)30次，介于兩個(gè)引物之間的新生DNA片段理論上達(dá)到230拷貝（約為109個(gè)分子）。PCR技術(shù)的特異性取決于引物與模板結(jié)合的特異性（圖3-1）。PCR反應(yīng)的基本步驟包括高溫變性（denaturation）；低溫退火（annealing）；中溫延伸（extension）三步反應(yīng)（圖3-2）。

①變性(denaturation)(95°C)；②退火(annealing)；③延伸(elogation)(72°C)圖3-1PCR擴(kuò)增DNA原理示意圖圖3-2PCR實(shí)驗(yàn)中各種組分的劑量：dNTP常用濃度為20~200pM，不能低于10~15pMo引物濃度一般在0.1~1.0pM。Mg2+濃度范圍通常為0.5~2mM°(3)在100plPCR反應(yīng)中，1.5~2U的TaqDNA聚合酶就足以進(jìn)行30輪循環(huán)。一般反應(yīng)中的模板數(shù)量為102~105個(gè)拷貝，對(duì)于單拷貝基因，這需要0.1曲的人基因組DNA,10ng的酵母DNA，1ng的大腸桿菌DNA；擴(kuò)增多拷貝序列時(shí)，用量更少。反應(yīng)緩沖液：反應(yīng)緩沖液一般含10~50mMTris-HCl(20C下pH8.3-8.8)，50mMKCl和適當(dāng)濃度的Mg2+。Tris-HCl在20C時(shí)pH為8.3-8.8，但在實(shí)際PCR反應(yīng)中，pH為6.8-7.8。50mM的KCl有利于引物的退火。另外，反應(yīng)液可加入5mM的二硫蘇糖醇(DDT)或100pg/ml的牛血清白蛋白(BSA)，它們可穩(wěn)定酶活性。各種TaqDNA聚合酶商品都有自己特定的一些緩沖液。PCR既可以擴(kuò)增制備全長(zhǎng)基因（圖3-3），也可以擴(kuò)增基因片段（圖3-4）圖3-3PCR擴(kuò)增全長(zhǎng)基因圖3-4PCR擴(kuò)增基因片段ExtensionofprimeronmRNARTStepSynthesisofletcDNAstrandAaSTl^iniSPNACigod^TPrimaj.orRTStepSynthesisofletcDNAstrandAaSTl^iniSPNACigod^TPrimaj.orAandomdetarr-srS'cDNAExtensionofprimeroncDNA0>苔ForwardPnm&rSynthesisof2ndcDNAstrand0>苔PCRSteparPCRamplificationofcDNAForwardPrimers1PCRStepTwo-stepRT-PCRAsTsT345Pnmtr實(shí)驗(yàn)材料:.cDNA:實(shí)驗(yàn)2獲得的cDNA。使用前用紫外分光廣度計(jì)測(cè)定濃度。.taq酶：5U/pl；附帶10xPCRbuffer（w/Mg）：20mMMgSO4,100mMKCl,80mM（NH4）2SO4,100mMTris-HCl,pH9.0,0.5%NP-40。上海申能博彩生物科技有限公司。上游引物內(nèi)含KpnI酶切位點(diǎn)（下劃線者）；下游引物內(nèi)含SalI酶切位點(diǎn)。.小鼠伊actin基因PCR擴(kuò)增引物（擴(kuò)增產(chǎn)物156bp）：P-actin-F：5'-CATCACTATCGGCAATGAGC-3'P-actin-R：5'-GACAGCACTGTGTTGGCATA-3'.DNAmarker：.瓊脂糖：.漠化乙錠（EB）：10mg/ml水溶液。.6x凝膠載樣緩沖液：0.25%漠芬藍(lán)，0.25%二甲苯青FF，40%（w/v）蔗糖。注意：在0.5~1.4%的瓊脂糖凝膠中，漠芬藍(lán)的泳動(dòng)速率是二甲苯青FF的2.2倍；漠芬藍(lán)的泳動(dòng)速率約與300bp的雙鏈線狀DNA的泳動(dòng)速率相同，而二甲苯青FF的泳動(dòng)速率約與4kb的雙鏈線狀DNA的泳動(dòng)速率相同。因此，兩種染料可指示DNA在凝膠電泳中的遷移位置，判斷電泳是否應(yīng)該停止。實(shí)驗(yàn)步驟：1、半定量PCR反應(yīng)[1].按順序?qū)⑾卤砀鞒煞旨尤?00pl薄壁PCR管：紹分W1）反應(yīng)1反應(yīng)2反應(yīng)3反應(yīng)4反應(yīng)6cDNAC10'500ng)555W?PCRBuffeiiwMg.務(wù)；20mMMg~+>5554XdNTP(2.5niMeach)222222GAPDH-F1lOnM4GAPDH-R14算二2刀GAPDH-F2lOuM44GAPDH-R2GOpM)44P^actin-FUOpM)44P-actiu-R.i.44Taq酶f5U/^)10.50.50.50.50505srerileddH?O29.529529.534.5345并.5匝心枳505050505050.將PCR反應(yīng)管瞬時(shí)離心，混勻反應(yīng)液;[3].將PCR反應(yīng)管置于PCR儀上，蓋好PCR儀頂蓋。[4].執(zhí)行下列程序：94°C預(yù)變性3min；30個(gè)循環(huán)：94°C變性45s,57.6°C復(fù)性40s,72°C延伸1.5min；72°C延伸10min；4C保溫。2、PCR產(chǎn)物電泳分析.配制1.0%瓊脂糖凝膠，加入終濃度為0.5pg/ml的漠化乙錠（EB）；.取5plPCR終產(chǎn)物及DNAmarker,以0.5xTBE為緩沖液，電壓100V電泳。期間根據(jù)漠芬藍(lán)和二甲苯青FF在凝膠中的遷移位置及其欲檢測(cè)的靶DNA分子的大小決定電泳是否已經(jīng)達(dá)到應(yīng)該停止的時(shí)間；若達(dá)到，停止電泳。.紫外透射儀或凝膠照相儀上觀察DNA擴(kuò)增情況；依據(jù)DNAmarker判斷是否有預(yù)期的擴(kuò)增產(chǎn)物；評(píng)價(jià)擴(kuò)增條件：特別是擴(kuò)增程序的復(fù)性溫度（決定擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性）。.用凝膠照相系統(tǒng)觀察凝膠圖象并拍照保存；用凝膠照相系統(tǒng)附帶的分析軟件對(duì)PCR產(chǎn)物條帶進(jìn)行區(qū)帶密度分析；.計(jì)算目的基因（GAPDH）的區(qū)帶與內(nèi)參（月-actin）區(qū)帶的密度比，結(jié)果表示目的基因與內(nèi)參mRNA的比值。注意事項(xiàng)：小鼠GAPDH基因引物F1/R1PCR擴(kuò)增引物（擴(kuò)增產(chǎn)物168bp）5'端帶有DIG標(biāo)記（也可以使用其他標(biāo)記，如Biotin等）的目的是回收純化PCR產(chǎn)物，用于后面的實(shí)驗(yàn)中做核酸雜交探針[3].4xdNTP混合物：10mM每種單核苷酸（dATP、dTTP、dGTP、dCTP）；上海申能博彩生物科技有限公司。[4].小鼠GAPDH基因PCR擴(kuò)增引物（擴(kuò)增產(chǎn)物168bp）：GAPDH-F1：5'-DIG/Biotin-GTGGCAAAGTGGAGATTGTT-3'Tm值：54.8°CGAPDH-R1：5'-DIG/Biot