一質(zhì)粒的提取及瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)

分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室規(guī)則自我防護(hù)：實(shí)驗(yàn)服、一次性手套請(qǐng)勿吃東西正確操作實(shí)驗(yàn)器材，保管好自己的實(shí)驗(yàn)器材實(shí)驗(yàn)廢液和廢物不可亂扔進(jìn)垃圾桶污染環(huán)境保持實(shí)驗(yàn)清潔衛(wèi)生分組做實(shí)驗(yàn)、團(tuán)隊(duì)合作交流，勤動(dòng)手、動(dòng)腦分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)成績(jī)?cè)u(píng)定考勤10%實(shí)驗(yàn)操作能力20%實(shí)驗(yàn)報(bào)告成績(jī)70%實(shí)驗(yàn)報(bào)告要求目的意義基本原理實(shí)驗(yàn)用品實(shí)驗(yàn)步驟結(jié)果分析討論（未達(dá)預(yù)期結(jié)果的分析等）實(shí)驗(yàn)大綱質(zhì)粒DNA的提取及瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)植物基因組DNA的提取與檢測(cè)質(zhì)粒DNA限制性內(nèi)切酶酶切及連接重組重組DNA的轉(zhuǎn)化及重組子鑒定和PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因?qū)嶒?yàn)一質(zhì)粒DNA的提取及檢測(cè)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?學(xué)習(xí)堿裂解法提取質(zhì)粒的原理和方法。2學(xué)習(xí)DNA瓊脂糖凝膠電泳的原理和方法。1.1質(zhì)粒DNA的提取

質(zhì)粒(Plasmid)是一種染色體外的穩(wěn)定遺傳因子，大小從1-200kb不等，為雙鏈、閉環(huán)的DNA分子，并以超螺旋狀態(tài)存在于宿主細(xì)胞中。質(zhì)粒主要發(fā)現(xiàn)于細(xì)菌、放線菌和真菌細(xì)胞中，常常編碼一些對(duì)宿主有利的酶的基因，這些基因的表型包括抗生素抗性，產(chǎn)生抗生素、限制酶、修飾酶等。一、實(shí)驗(yàn)原理載體(Vector)：要把一個(gè)有用的外源基因通過基因工程手段，轉(zhuǎn)化到細(xì)胞中去進(jìn)行繁殖和表達(dá)，需要運(yùn)載工具，攜帶外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞的這種工具就叫載體。目前除了大腸桿菌中的質(zhì)粒、λ噬菌體、M13噬菌體、噬菌粒外，還有酵母人工染色體載體以及動(dòng)、植物病毒載體等。一、實(shí)驗(yàn)原理分離質(zhì)粒DNA的方法一般包括三個(gè)基本步驟：培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增

收集和裂解細(xì)菌

分離和純化質(zhì)粒DNA一、實(shí)驗(yàn)原理（堿裂解法）溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖，

10mmol/EDTA-Na，

25mmol/LTris-HCl(pH8.0)

溶液Ⅱ：0.4mol/LNaOH，

2%SDS

臨用前1：1配制。溶液Ⅲ：5mol/L醋酸鉀60ml

冰醋酸11.5ml

雙蒸水28.5ml作用：分散細(xì)胞，螯合金屬離子使酶失活，防止DNA的降解作用：細(xì)胞在NaOH和SDS溶液中裂解時(shí)，蛋白質(zhì)與染色體DNA發(fā)生變性作用：酸性條件上質(zhì)粒DNA復(fù)性，留在上清液。大腸桿菌DNA和蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等發(fā)生沉淀二、實(shí)驗(yàn)用品1、儀器恒溫?fù)u床，高壓滅菌鍋，超凈工作臺(tái)，

10、100、1000μL取液器各一支，臺(tái)式高速離心機(jī)，制冰機(jī)，漩渦器。臺(tái)式高速離心機(jī)制冰機(jī)微量移液器漩渦混合器二、實(shí)驗(yàn)用品2、材料：含質(zhì)粒pUC18大腸桿菌1.5ml塑料離心管EP管架微量取液器和取液器吸頭常用玻璃器皿（如三角瓶、量筒、試劑瓶等）二、實(shí)驗(yàn)用品3、試劑LB培養(yǎng)液:胰蛋白胨（Tryptone）10g，酵母提取物（Yeastextract）5g，NaCl5g，瓊脂（固體培養(yǎng)基）15g，用1NNaOH調(diào)pH7.5。溶液Ⅰ，溶液Ⅱ，溶液Ⅲ氨芐青霉素(50mg/mL)抽提液（飽和酚：氯仿：異戊醇=25：24：1）

作用：氯仿可使蛋白質(zhì)變性，有助于液相與有機(jī)相的分離。平衡酚密度大，可是DNA在上清中。異戊醇防止抽提液起泡。無水乙醇作用：除去DNA水化層，使DNA沉淀。70%乙醇作用：純化質(zhì)粒DNA。TE緩沖液或ddH2O作用：溶解DNA三、實(shí)驗(yàn)步驟（1）將帶有質(zhì)粒pUC18的大腸桿菌接種在液體培養(yǎng)基中（加氨芐青霉素50μg/mL），370C培養(yǎng)過夜。取培養(yǎng)菌液1.5mL置Eppendorf小管中，10000rpm×2min，棄上清液。加入100μL溶液I，漩渦器上充分混勻，在室溫下放置10min。加入200μL新配制的溶液Ⅱ，輕輕翻轉(zhuǎn)2~3次，使之混勻，冰上放置5min。三、實(shí)驗(yàn)步驟（2）加入150μL冰冷的溶液Ⅲ，蓋緊后，溫和顛倒3-5次使混勻，產(chǎn)生白色絮狀物，冰上放置15min。10000rpm×5min，取上清液于另一干凈的離心管中。向上清液中加入等體積（約400μL）酚：氯仿/異戊醇（25：24:1，v/v），振蕩混勻，10000rpm×10min，將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中。加入等體積（約370μL）氯仿/異戊醇（24:1），混勻，10000rpm×2min,取上清液于新離心管中。三、實(shí)驗(yàn)步驟（3）向上清液加入2倍體積無水乙醇，混勻，-200C放置1h。12000rpm×5min，倒去上清液，吸干液體。加800μL70%乙醇，離心12000rpm×1min，倒盡上清液，吸水紙吸干液體，室溫自然干燥30min，直至變得透明無乙醇味。加20μLddH2O，混勻使DNA溶解完全，取5μL做電泳檢測(cè)，剩余的溶液放置-200C保存?zhèn)溆谩Ｋ?、注意事?xiàng)1）飽和酚（取下層）單獨(dú)吸200μL，氯仿：異戊醇（24：1）吸200μL。

2）制備質(zhì)粒過程中，所有操作必須緩和，不要?jiǎng)×艺袷帲ㄌ貏e是加入溶液II和III），以避免機(jī)械剪切力對(duì)DNA的斷裂作用。

3）在取各種試劑的過程中，一定注意移液器吸頭的更換，避免污染。1.2DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)

電泳：帶電荷的物質(zhì)，在電場(chǎng)中的趨向運(yùn)動(dòng)稱為電泳。

DNA的瓊脂糖凝膠電泳可以分離長(zhǎng)度為200bp至近50kb的DNA分子。DNA的遷移率（U）的對(duì)數(shù)與凝膠濃度（T）之間存在反平行線性關(guān)系。因此，要有效地分離不同大小的DNA片段，選用適當(dāng)?shù)沫傊悄z濃度是非常重要的。一、實(shí)驗(yàn)原理

在質(zhì)粒提取的過程中，由于操作原因，提取的質(zhì)?？赡苡腥N：線性DNA、開環(huán)DNA、閉環(huán)超螺旋DNA。

當(dāng)提取的質(zhì)粒DNA電泳時(shí),同一質(zhì)粒DNA泳動(dòng)速度：閉環(huán)超螺旋〉線狀〉開環(huán)。但有時(shí)也有也會(huì)出現(xiàn)相反情況，因?yàn)榕c瓊脂糖濃度、電流強(qiáng)度、離子強(qiáng)度及核酸染料含量有關(guān)。1、儀器電泳儀，電泳槽，樣品槽模板（梳子），有機(jī)玻璃內(nèi)槽，水平儀，取液器，微波爐，凝膠成像系統(tǒng)。

二、實(shí)驗(yàn)用品凝膠電泳系統(tǒng)凝膠成像系統(tǒng)二、實(shí)驗(yàn)用品2、材料：提取的pUC18，瓊脂糖，錐形瓶，一次性手套，膠鏟，封口膜，剪刀，取液器吸頭。3、試劑：

Goldview（DNA染料）

1×TAE緩沖液上樣緩沖液（6×）三、實(shí)驗(yàn)步驟1、瓊脂糖凝膠板的制備

稱取0.3g瓊脂糖，置于錐形瓶中，加入30mL1×TAE緩沖液，微波爐加熱直至瓊脂糖溶解。待膠液冷卻到650C（不燙手為宜），加入1μLGoldview混勻，攪拌器上攪拌排除氣泡，（如右圖）緩慢倒入事先準(zhǔn)備的制膠有機(jī)玻璃槽（插入樣品槽模板梳子）內(nèi)。靜置30min左右，輕輕晃動(dòng)拔出梳子。三、實(shí)驗(yàn)步驟2、加樣

膠板放入電泳槽中（樣品孔位于負(fù)極），注入1×TAE緩沖液淹沒過膠板5mm，用取液器將提取的質(zhì)粒DNA5μL與1μL上樣緩沖液（6×）混勻，加入膠板的樣品小槽內(nèi)。3、電泳

將電泳槽與電泳儀接通，調(diào)節(jié)電壓為100V左右，直至緩沖液的藍(lán)色指示劑移動(dòng)到距離膠板邊沿約1~2cm處，停止