第四章愈傷組織培養(yǎng)

愈傷組織概念：組織培養(yǎng)中，利用特定的條件，促使原已分化并具有一定功能的植物細胞脫離原來的發(fā)展軌道，失去原有的狀態(tài)和功能而成為能進行活躍分裂的一團細胞，稱為愈傷組織。愈傷組織的相關(guān)概念愈傷組織培養(yǎng)：將母體植株上的各個部分切下作為外值體，接種到無菌的培養(yǎng)基上，進行愈傷組織誘導、生長和發(fā)育的一門技術(shù)。目前一頁\總數(shù)三十九頁\編于十七點第一節(jié)愈傷組織的誘導郁李的愈傷組織目前二頁\總數(shù)三十九頁\編于十七點再分化：愈傷組織在一定的培養(yǎng)條件下又可以經(jīng)過胚胎發(fā)生形成雙極性的胚狀體，或經(jīng)過器官發(fā)生形成單極性的芽或根，進而重新形成完整的植株，這后一段過程一般稱為再分化。

脫分化：一個已停止分裂的成熟細胞轉(zhuǎn)變?yōu)榉稚鸂顟B(tài)，并形成未分化的愈傷組織的現(xiàn)象。細胞的全能性的體現(xiàn)目前三頁\總數(shù)三十九頁\編于十七點一、愈傷組織形成的條件外植體（explant)培養(yǎng)條件(conditionofculture)誘導愈傷組織的成敗關(guān)鍵主要不是實驗材料，而是培養(yǎng)條件，其中激素的成分和濃度是最重要的因素。目前四頁\總數(shù)三十九頁\編于十七點1、外植體的選擇一般情況下：雙子葉植物比單子葉和裸子植物容易幼年細胞和組織比成年的容易二倍體細胞比單倍體細胞容易同一種植物不同基因型誘導愈傷組織的能力也不相同（24個水稻抗稻瘟病單基因鑒別品系懸浮細胞系的建立，14.3%~97.1%,周曉罡等，西南農(nóng)業(yè)學報，2008年03期）目前五頁\總數(shù)三十九頁\編于十七點2、培養(yǎng)條件生長素：2,4-D、NAA、IAA等細胞分裂素：6-BA、KT、ZT等目前六頁\總數(shù)三十九頁\編于十七點二、愈傷組織的形成過程(王凱基等1981）圖3-2油橄欖愈傷組織形成過程中各期細胞形態(tài)和RNA含量變化目前七頁\總數(shù)三十九頁\編于十七點（一）誘導期（起動期）誘導期又稱起動期，指細胞準備進行分裂的時期，是愈傷組織形成的起點。目前八頁\總數(shù)三十九頁\編于十七點CallusarisingfromleaftissueCallusarisingfromvasculartissue

FromrootFromembryoculture目前九頁\總數(shù)三十九頁\編于十七點Photoindicatingwherethecallus(c)arisesfrom

目前十頁\總數(shù)三十九頁\編于十七點外植體細胞在完整植株中隨著細胞的分化過程而逐漸停止分裂，開始執(zhí)行它們各自不同的功能。外植體細胞一般處于靜止狀態(tài)，稱為靜止細胞。目前十一頁\總數(shù)三十九頁\編于十七點1、特點①細胞的氣體交換迅速增加。②多聚核糖體不斷增加：截止M期前，每個細胞中的RNA含量增加到300％；③蛋白質(zhì)發(fā)生周期性的積累：每個分裂細胞的總增加量約為200％；④

酶活力也發(fā)生一定的變化：DNA聚合酶活力增加、與代謝有關(guān)的酶類，如己糖激酶和一些脫氫酶的活力也增加。⑤細胞的大小基本沒有變化。目前十二頁\總數(shù)三十九頁\編于十七點2、誘導期的長短內(nèi)部：植物的種類、生理狀況外部：光照、外源激素因素決定。最常用的有2，4－D、NAA、IAA和細胞分裂素等。組織的機械損傷也作為一種刺激因素誘導細胞開始分裂，愈傷組織往往出現(xiàn)在傷口處。有些天然提取物對愈傷組織的誘導和維持十分有益，常用的有椰子汁（10％），0.5％的酵母提取物，5％～10％的番茄汁。Yeoman和Mitchell(1970)指出了核仁是生長物質(zhì)的作用部位。改善目前十三頁\總數(shù)三十九頁\編于十七點（二）分裂期（Celldivision）外植體(explant)中已分化的活細胞在外源激素的作用下，外植體外層細胞出現(xiàn)了分裂，由于外層細胞的迅速分裂使得這些細胞的體積縮小，逐漸回復到分生組織狀態(tài)，因此也稱為回復變化。目前十四頁\總數(shù)三十九頁\編于十七點1、分裂期細胞的特征①外層細胞進行分裂，而中間的細胞不分裂。細胞的數(shù)目迅速增加。胡蘿卜組織培養(yǎng)7d后，細胞數(shù)可增加10倍。②

每個細胞平均鮮重下降。③

細胞體積小，內(nèi)無液泡。④核和核仁增大到最大。⑤RNA含量減少，而DNA含量保持不變。⑥隨著細胞不斷分裂和組織生長，組織的總干重、蛋白質(zhì)和核酸含量大大增加，新細胞壁的合成極快。目前十五頁\總數(shù)三十九頁\編于十七點細胞分裂快，結(jié)構(gòu)疏散，缺少有組織的結(jié)構(gòu)，顏色淺而透明。2、愈傷組織的特征目前十六頁\總數(shù)三十九頁\編于十七點（三）分化期（Differentiation）停止分裂的細胞發(fā)生生理代謝變化而形成由不同形態(tài)和功能的細胞組成的愈傷組織。目前十七頁\總數(shù)三十九頁\編于十七點分化結(jié)構(gòu)的形成過程加速，超過了回復變化。外層細胞的分裂逐漸減慢，甚至停止，為次生生長所代替，大量次生結(jié)構(gòu)出現(xiàn)。在這時期中細胞的伸展和分裂處于平衡，故細胞的平均大小往往沒有變化。1、分化期特點目前十八頁\總數(shù)三十九頁\編于十七點胡蘿卜愈傷組織2、愈傷組織的特點生長旺盛的愈傷組織一般呈乳黃色或白色，有光澤；也有淺綠色或綠色；老化的愈傷組織多轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色甚至褐色。Friable松脆易碎的Hard/lignifiedcallus

目前十九頁\總數(shù)三十九頁\編于十七點Callusmayhaveayellow,white,greenorred(anthocyanin花青苷)appearance.目前二十頁\總數(shù)三十九頁\編于十七點第二節(jié)愈傷組織發(fā)生的形態(tài)學和細胞學

煙草愈傷組織在8周培養(yǎng)期間形態(tài)的變化（自桂耀林）目前二十一頁\總數(shù)三十九頁\編于十七點1、色澤：一般為淡黃色、綠色或白色，亦可為紅色。影響因素：葡萄糖的水平，可溶性淀粉的存在，缺氮、溫度、光及外源激素等營養(yǎng)物質(zhì)和環(huán)境因素。黑暗中培養(yǎng)的煙草愈傷組織魔芋愈傷組織菠蘿的愈傷組織一、形態(tài)學目前二十二頁\總數(shù)三十九頁\編于十七點Callusexudingstickypoly-saccharides

2、質(zhì)地疏松致密Rhizogeniccallus

Friable松脆易碎的Hard/lignifiedcallus

Callustypes轉(zhuǎn)換2,4-D（備注）有機態(tài)的還原態(tài)氮銨態(tài)氮細胞懸浮系目前二十三頁\總數(shù)三十九頁\編于十七點二、細胞學

圖3-4圖解示致密愈傷組織和疏松愈傷組織(A)致密愈傷組織(B)疏松愈傷組織

1.巨大的細胞2.管狀細胞3.大的胞間隙愈傷組織并非完全由薄壁細胞組成。不同類型的愈傷組織在細胞組成上有明顯不同。在長期培養(yǎng)過程中，愈傷組織細胞會發(fā)生染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)的變化及基因突變：染色體出現(xiàn)多倍體和非整倍體組培快繁的障礙

育種提供基礎目前二十四頁\總數(shù)三十九頁\編于十七點第三節(jié)愈傷組織培養(yǎng)中的形態(tài)發(fā)生及體細胞胚胎發(fā)生（一）細胞的分化（維管組織）（二）器官的分化一、愈傷組織培養(yǎng)中的形態(tài)發(fā)生二、體細胞胚胎發(fā)生目前二十五頁\總數(shù)三十九頁\編于十七點（一）細胞的分化1、在培養(yǎng)中，已觀察到的細胞類型薄壁細胞分生細胞管胞色素細胞石細胞纖維細胞等，其中以維管組織（特別是木質(zhì)部）的分化最為常見。目前二十六頁\總數(shù)三十九頁\編于十七點2、影響維管組織分化的主要因素激素生長素：起到主要的作用，低濃度刺激木質(zhì)部分化。激動素：可以增加愈傷組織中管胞形成的比例；激動素和生長素協(xié)同增效作用BAP，2-iP和ZT也有一定的作用，但沒有證據(jù)證明他們的普遍性。蔗糖在丁香的組織培養(yǎng)中，當生長素濃度不改變而變化蔗糖濃度時，在蔗糖濃度為1.5～2.5％的范圍時，愈傷組織內(nèi)僅形成木質(zhì)部；超過4％時則幾乎完全為韌皮部；在2.5～3.5％時，既形成木質(zhì)部也形成韌皮部。物理因素：研究較少。光、溫度對木質(zhì)部的形成有一定的影響。目前二十七頁\總數(shù)三十九頁\編于十七點（二）器官分化1、通過器官發(fā)生途徑產(chǎn)生再生植株的基本方式有3種（konar等，1972）芽根植株：普遍愈傷組織根芽植株：根有抑制芽產(chǎn)生的影響根和芽植株目前二十八頁\總數(shù)三十九頁\編于十七點2、影響因素激素2.4-D與KT：比例較高時，有利于莖的形成，反之，有利于根的形成。赤霉素（GA3）：抑制煙草、紫雪花（Plumbagoindica）秋海棠（Begonia）及水稻的器官分化。GA3的完全抑制作用只發(fā)生在黑暗條件下。乙烯：對芽的分化有一定作用，作用方向與植物種類和處理的時間有關(guān)。物理因素光強、光質(zhì)和光周期：一般光強為1000～15001x，光周期12～16h，近紫外和藍紫光促進芽的發(fā)生，而紅光顯著促進長根。溫度：25℃左右的培養(yǎng)溫度適于器官發(fā)生，但接近于植物原產(chǎn)地的生長溫度對培養(yǎng)物更有利。

目前二十九頁\總數(shù)三十九頁\編于十七點（1）胚狀體：高等植物的體細胞在一定條件下所誘導形成的胚，稱為體細胞胚，即所謂的胚狀體。二、體細胞胚胎的形成1.體細胞胚胎發(fā)生的幾個概念（2）胚狀體形成的5個階段：

原胚期、球形胚期、心形胚期、魚雷形胚和子葉期。目前三十頁\總數(shù)三十九頁\編于十七點（3）由胚狀體形成完整植株，與不定芽和根發(fā)生相比，有以下三個特征：

第一、具有兩極性，即在發(fā)育的早期階段，從其方向相反的兩端

分化芽端與根端，而不定芽或不定根都為單向極性;

第二、胚狀體的維管組織與外植體的維管組織無解剖結(jié)構(gòu)上的聯(lián)

系，而不定芽或不定根往往與愈傷組織的維管組織相聯(lián)系；

第三、胚狀體的維管組織的分布是獨立的“Y’形，而不定芽的維管

組織無此現(xiàn)象。目前三十一頁\總數(shù)三十九頁\編于十七點2、愈傷組織中胚狀體特征①二極性

在組織培養(yǎng)的器官發(fā)生過程中，愈傷組織是一團無極性分化的細胞團，器官分化中芽或根分化只是具單極性，而胚狀體在分化初期就具胚根和胚芽兩極，具明顯的形態(tài)特征上的極性（Polarity）類似于合子發(fā)育中的種子結(jié)構(gòu)。②生理隔離（physiologicalisolation）：指體細胞胚與母體組織或外植體的維管束系統(tǒng)無直接聯(lián)系，胚狀體與周圍組織間形成縫隙，處于較獨立的狀態(tài)，盡管細胞組織間仍有胞間連絲存在，這是體細胞胚獲得營養(yǎng)，激素及能量來源的通道，其后這些細胞趨于解體。③遺傳穩(wěn)定胚狀體起源于單細胞或細胞團，在其產(chǎn)生和發(fā)育過程中，一旦形成即通過了分化過程，結(jié)構(gòu)即穩(wěn)定無需較長時間的脫分化與再分化過程，細胞變異的頻率較低，成苗率較高，遺傳穩(wěn)定性好。④重演受精卵形態(tài)發(fā)生的特征誘導階段所形成的原胚或原胚團，要轉(zhuǎn)入無激素的培養(yǎng)基中，使它進一步分化發(fā)育，經(jīng)歷球形胚，心形胚，魚雷形及子葉形體胚的發(fā)育階段。目前三十二頁\總數(shù)三十九頁\編于十七點3.愈傷組織中胚狀體發(fā)生的部位可來自于外植體或愈傷組織表面的單細胞：較為常見可以發(fā)生在愈傷組織的內(nèi)部。目前三十三頁\總數(shù)三十九頁\編于十七點4.體細胞胚胎發(fā)生的方式（1）由外植體直接分化成胚，中間不經(jīng)過愈傷組織階段如石龍芮再生植株莖表面長出不定胚，槐樹種子的子葉在組織培養(yǎng)過程中，可在切口處產(chǎn)生愈傷組織的同時，在子葉組織中分化出體細胞胚等。（2）外植體先愈傷化，然后由愈傷組織表面分化形成體細胞胚。目前三十四頁\總數(shù)三十九頁\編于十七點5.影響體細胞胚胎發(fā)生的主要因素（1）外植體不同植物的基因型不同，在培養(yǎng)條件下形成體細胞胚的反應各異。如柑橘類，胡蘿卜及矮牽牛等容易誘導體細胞胚，但煙草卻難以發(fā)生體細胞胚。柑橘類中的甜橙易于胚胎發(fā)生，而寬皮橘較難，各種植物種子的子葉一般易于發(fā)生胚狀體。（2）生長調(diào)節(jié)物質(zhì)：主要是生長素在離體條件下胡蘿卜體細胞胚的發(fā)育是一個包括兩個步驟的過程，每個步驟需要一種不同的培養(yǎng)基。愈傷組織的建立和增殖所需的是一種含有生長素的培養(yǎng)基，通常所用的生長素是2,4-D，濃度范圍0.5～1mg/L.=====胚性細胞團----繼代培養(yǎng)不能形成胚。再轉(zhuǎn)入生長素含量極低或沒有的培養(yǎng)基上====胚目前三十五頁\總數(shù)三十九頁\編于十七點（3）氮源

無機態(tài)的NH4+有利于胚胎發(fā)生。有機態(tài)的氮：椰乳，酵母提取液、水解酪蛋白，其使用的濃度多在400mg/L左右。（4）其他因子據(jù)Brown等（1976）報道，在野生胡蘿卜中，高濃度的鉀（20mmol/L）是胚胎發(fā)生所必需的。在培養(yǎng)基中溶解氧的含量應低于一個臨界值（1.5mg/L）,否則將有利于生根，而不利于成胚。另外，培養(yǎng)過程中的環(huán)境條件如光照，溫度，對外植體的預處理如輻射，低溫及離的等都會影響胚狀體的發(fā)生。目前三十六頁\總數(shù)三十九頁\編于十七點