大腸桿菌的檢測

大腸桿菌的檢測：大腸菌群測定的操作細(xì)則大腸菌群系指一群能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。該菌主要來于人畜糞便，故以此作為糞便污染指標(biāo)來評價食品的衛(wèi)生質(zhì)量,推斷食品中有否污染腸道致病菌的可能。食品中大腸菌群數(shù)系以100mL(g)檢樣內(nèi)大腸菌群最可能數(shù)(MPN)表示。1設(shè)備和材料1.1溫箱：36±1°C。1.2冰箱:0?4°C。1.3恒溫水?。?4.5±0.5°C。1.4天平。1.5顯微鏡。1.6均質(zhì)器或乳缽。1.7平皿:直徑為90mm。1.8試管。1.9吸管。1.10廣口瓶或三角燒瓶:容量為500mL。1.11玻璃珠:直徑約5mm。1.12載玻片。1.13酒精燈。1.14試管架。2培養(yǎng)基和試劑2.1乳糖膽鹽發(fā)酵管:按GB4789.28中4.9規(guī)定。2.2伊紅美藍(lán)瓊脂平板:按GB4789.28中4.25規(guī)定。2.3乳糖發(fā)酵管:按GB4789.28中4.10規(guī)定。EC肉湯:按GB4789.28中4.11規(guī)定。2.5磷酸鹽緩沖稀釋液:按GB4789.28中3.22規(guī)定。2.6生理鹽水。2.7革蘭氏染色液:按GB4789.28中2.2規(guī)定。3.1檢樣稀釋3.1.1以無菌操作將檢樣25mL(或g)放于有225mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的滅菌玻璃瓶內(nèi)(瓶內(nèi)予置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠)或滅菌乳缽內(nèi)，經(jīng)充分振搖或研磨做成1:10的均勻稀釋液。固體檢樣最好用均質(zhì)器，以8000-10000r/min的速度處理1min,做成1:10的均勻稀釋液。3.1.2用1mL滅菌吸管吸取1:10稀釋液1mL,注入含有9mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的試管內(nèi),振搖試管混勻，做成1:100的稀釋液。3.1.3另取1mL滅菌吸管，按上條操作依次做10倍遞增稀釋液，每遞增稀釋一次,換用1支1mL滅菌吸管。3.1.4根據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)z樣污染情況的估計(jì)，選擇三個稀釋度,每個稀釋度，接種3管。3.2乳糖發(fā)酵試驗(yàn)將待檢樣品接種于乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)，接種量在1mL以上者，用雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管,1mL及1mL以下者，用單料乳糖膽鹽發(fā)酵管。每一稀釋度接種3管,置36±1C溫箱內(nèi)，培養(yǎng)24±2h,如所有乳糖膽鹽發(fā)酵管都不產(chǎn)氣，則可報(bào)告為大腸菌群陰性，如有產(chǎn)氣者，則按下列程序進(jìn)行。3.3分離培養(yǎng)將產(chǎn)氣的發(fā)酵管分別轉(zhuǎn)種在伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，置36±1C溫箱內(nèi)，培養(yǎng)18-24h,然后取出，觀察菌落形態(tài)，并做革蘭氏染色和證實(shí)試驗(yàn)。3.4證實(shí)試驗(yàn)在上述平板上,挑取可疑大腸菌群菌落1-2個進(jìn)行革蘭氏染色，同時接種乳糖發(fā)酵管，置36±1C溫箱內(nèi)培養(yǎng)24±2h,觀察產(chǎn)氣情況。凡乳糖管產(chǎn)氣、革蘭氏染色為陰性的無芽胞桿菌,即可報(bào)告為大腸菌群陽性。報(bào)告根據(jù)證實(shí)為大腸菌群陽性的管數(shù)，查MPN檢索表，報(bào)告每100mL(g)大腸菌群的MPN值。4糞大腸菌群（faecalcoliform）4.1用接種環(huán)將所有產(chǎn)氣的乳糖膽鹽發(fā)酵管培養(yǎng)物（見3.2條）轉(zhuǎn)種于EC肉湯管內(nèi)，置44.5±0.2°C水浴箱內(nèi)（水浴箱內(nèi)的水面應(yīng)高于EC肉湯液面），培養(yǎng)24±2h,經(jīng)培養(yǎng)后，如所有EC肉湯管均不產(chǎn)氣，則可報(bào)告為陰性;如有產(chǎn)氣者,則將所有產(chǎn)氣的EC肉湯管分別轉(zhuǎn)種于伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，置培養(yǎng)18-24h,凡平板上有典型菌落者，則證實(shí)為糞大腸菌群陽性。4.2結(jié)果報(bào)告根據(jù)證實(shí)為糞大腸菌群的陽性管數(shù)，查MPN檢索表，報(bào)告每100mL（g）糞大腸菌群的MPN值乳酸菌的檢測：一概述乳酸菌是指一群能分解葡萄糖或乳糖產(chǎn)生乳酸，需氧和兼性厭氧，多數(shù)無動力，過氧化氫酶陰性，革蘭氏陽性的無芽胞桿菌和球菌。這類細(xì)菌在自然界分布廣泛，可棲居在人和各種動物的口腔、腸道等器官內(nèi)，在土壤、食品、飼料、水及一些臨床標(biāo)本中都有乳酸菌的存在。乳酸菌在工業(yè)、農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥等與人類生活密切相關(guān)的領(lǐng)域應(yīng)用價值很高，相當(dāng)多的乳酸菌對人、畜的健康起著有益的作用，但個別菌種能對人畜致病，乳酸菌主要包括23個屬的細(xì)菌。二樣本米集檢樣主要為含乳酸菌活菌的飲料和微生態(tài)制劑，樣本應(yīng)放入冰箱保存，心快檢驗(yàn)。三檢驗(yàn)方法（中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)乳酸菌飲料中乳酸菌的微生物學(xué)檢驗(yàn)GB/T16347-1996）乳酸菌菌總數(shù)的測定：乳酸菌菌落總數(shù)是指標(biāo)樣在一定條件下培養(yǎng)后，所得1ml檢樣中所含乳酸菌菌落的總數(shù)。（一）檢驗(yàn)程序乳酸菌菌落總數(shù)檢驗(yàn)程序如下：（二）培養(yǎng)基和試劑改良TJA培養(yǎng)基（改良番茄汁瓊脂培養(yǎng)基）；改良MC培養(yǎng)基（modifiedChalmers培養(yǎng)基）；0.1%亞甲藍(lán)牛乳培養(yǎng)基；6.5%氯化鈉肉湯參照；pH9.6葡萄糖肉湯；40%膽汁肉湯；淀粉水解培養(yǎng)基；精氨酸水解培養(yǎng)基；乳酸桿菌糖發(fā)酵管；七葉苷培養(yǎng)基；革蘭氏染色液；3%過氧化氫溶液；蛋白胨水、靛基質(zhì)試劑；明膠培養(yǎng)基；硝酸鹽培養(yǎng)基、硝酸鹽試劑；生理鹽水：定量分裝于三角瓶和試管內(nèi)滅菌。（三）操作步驟以無菌操作將經(jīng)過充分搖勻的檢樣25ml（或259）放入含有225ml滅菌生理鹽水的來菌廣口瓶內(nèi)做成1：10的均勻稀釋液。用1ml滅菌吸管吸取1:10稀釋液1m，沿管壁徐徐注入含有9ml滅菌生理鹽水的試管內(nèi)（注意吸管尖端不要觸及管內(nèi)稀釋液）。另取1ml滅菌吸管，按上述操作順序，作10倍增稀釋液，如此每遞增一次，即換用1支1ml滅菌吸管。選擇2?3個以上適宜稀釋度，分別在作10倍遞增稀釋的同時，即以吸取該稀釋度的吸管移1ml稀釋液于滅菌平皿內(nèi)，每個稀釋度作兩個平皿。稀釋液移入平皿后，應(yīng)及時將冷至50C的乳酸菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)基（改良TJA或改良MC）注入平皿約15ml，并轉(zhuǎn)動平皿使混合均勻。同時將乳酸菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)基傾入加有1ml稀釋液檢樣用的滅菌生理鹽水的滅菌平皿內(nèi)作空白對照，以上整個操作自培養(yǎng)物加入培養(yǎng)皿開始至接種結(jié)束須在20min內(nèi)完成。待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平板，置36°C±1°C溫箱內(nèi)培養(yǎng)72h±3h取出，觀察乳酸菌菌特征，選取菌落數(shù)在30?300之間的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。計(jì)算后，隨機(jī)挑取5個菌落數(shù)進(jìn)行革蘭氏染色，顯微鏡檢查并做過氧氫酶試驗(yàn)。革蘭氏陽性，過氧化氫酶陰性，無芽胞的球菌或桿菌可定為乳酸菌。根據(jù)證實(shí)為乳酸菌菌落計(jì)算出皿內(nèi)的乳酸菌數(shù)，然后乘其稀釋倍數(shù)即得每亳升樣品中乳酸菌數(shù)。例如，檢樣10-4的稀釋液在改良TJA瓊脂平板上，生成的可疑菌落為35個，取5個鑒定，證實(shí)的乳酸菌的4個，則1ml檢樣中乳酸菌數(shù)為：35x4/5x104=2.8x105乳酸菌在改良TJA和改良MC培養(yǎng)基上菌落生長形態(tài)特征。（四）乳酸菌的鑒定對上述分離到的乳酸菌需進(jìn)