第二節(jié)-蛋白質(zhì)的共價結(jié)構(gòu)

第二節(jié)-蛋白質(zhì)的共價結(jié)構(gòu)第一頁，共79頁。Protein——

來自希臘字母，意思是“頭等重要的，原始的”蛋白質(zhì)——

來源于對蛋清（清蛋白）的研究

分布廣：所有器官、組織都含有蛋白質(zhì)；細(xì)胞的各個部分都含有蛋白質(zhì)。含量高：蛋白質(zhì)是細(xì)胞內(nèi)最豐富的有機(jī)分子，占人體干重的45％，某些組織含量更高，例如脾、肺及橫紋肌等高達(dá)80％。一、蛋白質(zhì)通論第二頁，共79頁。

1833年

Payen和Persoz分離出淀粉酶。1864年

Hoppe-Seyler從血液分離出血紅蛋白，并將其制成結(jié)晶。19世紀(jì)末

Fischer證明蛋白質(zhì)是由氨基酸組成的，并將氨基酸合成了多種短肽。1938年

德國化學(xué)家GerardusJ.Mulder引用“Protein”

一詞來描述蛋白質(zhì)。

大事記：第三頁，共79頁。1951年P(guān)auling采用X（射）線晶體衍射發(fā)現(xiàn)了蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)——α-螺旋(α-helix)。1953年FrederickSanger完成胰島素一級序列測定。1962年JohnKendrew和MaxPerutz確定了血紅蛋白的四級結(jié)構(gòu)。20世紀(jì)90年代以后后基因組計劃。第四頁，共79頁。（一）什么是蛋白質(zhì)?蛋白質(zhì)(protein)是由許多氨基酸(aminoacids)通過肽鍵(peptidebond)相連形成的高分子含氮化合物。第五頁，共79頁。

有些蛋白質(zhì)還含有少量的P、Fe、Cu、Mn、Zn、Se、I等。

C50~55%H6~7%O19~24%N13~19%S0~4%主要元素組成（二）蛋白質(zhì)的化學(xué)組成和分類1、化學(xué)組成：第六頁，共79頁。

各種蛋白質(zhì)的含氮量很接近，平均為16％。

由于體內(nèi)的含氮物質(zhì)以蛋白質(zhì)為主，因此，只要測定生物樣品中的含氮量，就可以根據(jù)以下公式推算出蛋白質(zhì)的大致含量：100克樣品中蛋白質(zhì)的含量(g%)=每克樣品含氮克數(shù)×6.25×1001/16%蛋白質(zhì)元素組成的特點凱氏定氮法：第七頁，共79頁。2、蛋白質(zhì)的分類*根據(jù)蛋白質(zhì)組成成分單純蛋白質(zhì)：如：血清清蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)=蛋白質(zhì)部分+非蛋白質(zhì)部分

如：糖蛋白、脂蛋白、磷蛋白、金屬蛋白等*根據(jù)蛋白質(zhì)形狀纖維狀蛋白質(zhì)：多為結(jié)構(gòu)蛋白，難溶于水，

如絲心蛋白等球狀蛋白質(zhì)：多數(shù)具有生理活性，多數(shù)可溶

如血紅蛋白、免疫球蛋白等膜蛋白第八頁，共79頁。簡

單

蛋

白清蛋白和球蛋白albuminandglobulin

廣泛存在于動物組織谷蛋白和醇溶谷蛋白glutelinandprolamin

植物蛋白，不溶于水，易溶于稀酸/堿精蛋白和組蛋白堿性蛋白存在于細(xì)胞核硬蛋白

第九頁，共79頁。結(jié)

合

蛋

白色蛋白：簡單蛋白+色素物質(zhì)糖蛋白：簡單蛋白+糖類物質(zhì)脂蛋白：簡單蛋白+脂類結(jié)合核蛋白：簡單蛋白+核酸第十頁，共79頁。3、蛋白質(zhì)的形狀纖維狀蛋白質(zhì)球狀蛋白質(zhì)膜結(jié)合蛋白質(zhì)CollagenMyoglobinBacteriorhodopsin第十一頁，共79頁。4、蛋白質(zhì)的大小蛋白質(zhì)與多肽并無嚴(yán)格的界線，通常是將分子量在6000道爾頓以上的多肽稱為蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)分子量變化范圍很大,從大約6000到道爾頓甚至更大。第十二頁，共79頁。1）酶的生物催化作用（二）蛋白質(zhì)具有重要的生物學(xué)功能第十三頁，共79頁。2）調(diào)控作用參與基因調(diào)控：組蛋白、非組蛋白等參與代謝調(diào)控：如激素或生長因子等第十四頁，共79頁。3）運動與支持機(jī)體的結(jié)構(gòu)蛋白：頭發(fā)、骨骼、牙齒、肌肉等第十五頁，共79頁。4）參與運輸貯存的作用血紅蛋白——運輸氧銅藍(lán)蛋白——運輸銅鐵蛋白——貯存鐵第十六頁，共79頁。5）免疫保護(hù)作用抗原抗體反應(yīng)凝血機(jī)制第十七頁，共79頁。6）參與細(xì)胞間信息傳遞信號傳導(dǎo)中的受體、信息分子等7）氧化供能第十八頁，共79頁。(三)蛋白質(zhì)的構(gòu)象與蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)組織層次

每一種天然蛋白質(zhì)都有自己特有的空間結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)特有的這種天然空間結(jié)構(gòu)，稱為構(gòu)象。一級結(jié)構(gòu)：氨基酸順序二級結(jié)構(gòu)：α螺旋、β折疊、β轉(zhuǎn)角,

無規(guī)卷曲三級結(jié)構(gòu)：α螺旋、β折疊、β轉(zhuǎn)角松散肽段借次級鍵形成球狀四級結(jié)構(gòu)：多亞基聚集第十九頁，共79頁。第二十頁，共79頁。二、肽（一）肽(peptide)的定義肽是由氨基酸通過肽鍵縮合而形成的化合物。第二十一頁，共79頁。肽鍵(peptidebond)：是由一個氨基酸的-羧基與另一個氨基酸的-氨基脫水縮合而形成的化學(xué)鍵，本質(zhì)為酰胺鍵。氨基酸殘基(residue):肽鏈中的氨基酸分子因為脫水縮合而基團(tuán)不全，被稱為氨基酸殘基。（二）肽鍵的結(jié)構(gòu)第二十二頁，共79頁。+-HOH甘氨酰甘氨酸肽鍵第二十三頁，共79頁。蛋白質(zhì)氨基酸殘基數(shù)的估計

組成蛋白質(zhì)的氨基酸的平均分子量為128，

每個氨基酸殘基的平均分子量為110；對于簡單蛋白質(zhì)，用110除它的相對分子量即可約略估計出其氨基酸殘基數(shù)目。第二十四頁，共79頁。計算題：一種蛋白質(zhì)按其重量含有1.65%亮氨酸和2.48%異亮氨酸，計算該蛋白質(zhì)最低分子量。（注：兩種氨基酸的分子量都是131Da）。第二十五頁，共79頁。

肽鍵

肽鍵的特點是氮原子上的孤對電子與羰基具有明顯的共軛作用。組成肽鍵的原子處于同一平面——酰胺平面。肽鍵中的C-N鍵具有部分雙鍵性質(zhì)，不能自由旋轉(zhuǎn)。在大多數(shù)情況下，以反式結(jié)構(gòu)存在。第二十六頁，共79頁。

根據(jù)形成肽的氨基酸數(shù)目，一般氨基酸數(shù)目在12個以內(nèi)時，稱為二肽、三肽、四肽等；13個至20個時稱為寡肽（oligopeptide）；20個以上稱為多肽（polypeptide）。當(dāng)分子量大到一定程度時，就稱為蛋白質(zhì)。寡肽和多肽的區(qū)分完全是人為規(guī)定的，其間的界限并不嚴(yán)格。（三）肽的命名第二十七頁，共79頁。

一條肽鏈?zhǔn)怯蟹较蛐缘?，肽鏈的一端具有游離的α－氨基，稱其為N端；另一端具有游離的α－羧基，稱其為C端。有少數(shù)小分子量的肽，其首尾也縮合成肽鍵，成為環(huán)肽。

對于生物體內(nèi)的具有特定結(jié)構(gòu)和功能的小分子量肽，還有特別名稱，如腦啡肽、內(nèi)啡肽、催產(chǎn)素、加壓素等。

第二十八頁，共79頁。N末端：多肽鏈中有自由氨基的一端C末端：多肽鏈中有自由羧基的一端多肽鏈有方向性：Ala-Tyr-Asp-GlyNCN端C端第二十九頁，共79頁。N末端C末端牛核糖核酸酶第三十頁，共79頁。（四）.肽的理化性質(zhì)：

1.旋光性一般短肽的旋光度等于其各個氨基酸的旋光度的總和。

2.酸堿性質(zhì)偶極離子形式存在。

pH0―14范圍內(nèi)，肽鍵中的亞氨基不解離酸堿性質(zhì)主要取決于：Ｎ：α－ＮＨ２

Ｃ：α－COOH

側(cè)鏈Ｒ上可解離的基團(tuán)。肽末端α-羧基pKa值比游離AA中的大。肽末端α-氨基pKa值比游離AA中的小。

第三十一頁，共79頁。3.肽的化學(xué)反應(yīng)肽的α—羧基，α—氨基和側(cè)鏈R基上的活性基團(tuán)都能發(fā)生與游離氨基酸相似的反應(yīng)。肽的化學(xué)反應(yīng)和氨基酸的一致，N端的氨基酸殘基可以與茚三酮反應(yīng)。雙縮脲反應(yīng)是肽和蛋白質(zhì)特有的，氨基酸沒有此反應(yīng)。

第三十二頁，共79頁。（五）幾種生物活性肽1.谷胱甘肽(glutathione,GSH)活性肽(activepeptide)：生物體內(nèi)存在大量的多肽和寡肽有很強(qiáng)的生物活性，稱活性肽。第三十三頁，共79頁。GSH過氧化物酶H2O22GSH2H2OGSSG

GSH還原酶NADPH+H+NADP+GSH有抗氧化劑的作用，可還原細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的過氧化氫。第三十四頁，共79頁。谷胱甘肽的生理功用：

解毒作用；參與氧化還原反應(yīng)；保護(hù)巰基酶的活性；抗氧化劑作用，維持紅細(xì)胞膜的穩(wěn)定。

第三十五頁，共79頁。

體內(nèi)許多激素屬寡肽或多肽2.多肽類激素及神經(jīng)肽第三十六頁，共79頁。

主要存在于指數(shù)神經(jīng)系統(tǒng)，包括腦啡肽、內(nèi)啡肽、強(qiáng)啡肽等和P-物質(zhì)。具有嗎啡樣的鎮(zhèn)痛作用。

神經(jīng)肽(neuropeptide)3、抗菌肽—細(xì)菌的防御武器抑制細(xì)菌或其他微生物生長或繁殖的物質(zhì)；由特定微生物產(chǎn)生，最常見的是青霉素，它是由半胱氨酸和纈氨酸結(jié)合成的二肽衍生物。主要破壞細(xì)菌細(xì)胞壁糖肽的合成，引起溶菌。第三十七頁，共79頁。三、蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定

Protein的一級結(jié)構(gòu)（primarystructure)

定義：

是指構(gòu)成蛋白質(zhì)的各種氨基酸的種類、數(shù)量、連接方式和排列順序，由遺傳信息（遺傳密碼）所決定。涉及的化學(xué)鍵是肽鍵和少量的二硫鍵。研究意義：

1、從分子水平上研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，為蛋白質(zhì)的人工合成奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。

2、診斷遺傳病、合成基因探針等高新技術(shù)的研究具有重要意義。第三十八頁，共79頁。蛋白質(zhì)氨基酸順序的測定是蛋白質(zhì)化學(xué)研究的基礎(chǔ)。自從1953年F.Sanger測定了胰島素的一級結(jié)構(gòu)以來，現(xiàn)在已經(jīng)有上千種不同蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)被測定。

第三十九頁，共79頁。（一）蛋白質(zhì)測序的要求1，樣品必需純（>97%以上）；2，知道蛋白質(zhì)的分子量；3，知道蛋白質(zhì)由幾個亞基組成；4，測定蛋白質(zhì)的氨基酸組成；并根據(jù)分子量計算每種氨基酸的個數(shù)。5，測定水解液中的氨量，計算酰胺的含量。第四十頁，共79頁。（二）測定步驟1、多肽鏈的拆分。由多條多肽鏈組成的蛋白質(zhì)分子，必須先進(jìn)行拆分。蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定第四十一頁，共79頁。1、多肽鏈的拆分。幾條多肽鏈借助非共價鍵連接在一起，稱為寡聚蛋白質(zhì)，如血紅蛋白為四聚體，烯醇化酶為二聚體；可用8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍處理，即可分開多肽鏈(亞基).蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定第四十二頁，共79頁。2、測定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目。通過測定末端氨基酸殘基的摩爾數(shù)與蛋白質(zhì)分子量之間的關(guān)系，即可確定多肽鏈的數(shù)目。蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定第四十三頁，共79頁。幾條多肽鏈通過二硫鍵交聯(lián)在一起?？稍诳捎?mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍存在下，用過量的-巰基乙醇處理，使二硫鍵還原為巰基，然后用烷基化試劑保護(hù)生成的巰基，以防止它重新被氧化。蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定3、二硫鍵的斷裂第四十四頁，共79頁。4、測定每條多肽鏈的氨基酸組成，并計算出氨基酸成分的分子比；蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定氨基酸自動分析儀和肽鏈氨基酸順序自動測定儀，對蛋白質(zhì)多肽氨基酸排列順序的測定提供了極大的方便。第四十五頁，共79頁。1、N末端分析二硝基氟苯法（DNFB法）：用DNFB（Sanger試劑）與肽鏈N末端的氨基反應(yīng)，生成DNP－多肽或DNP－蛋白質(zhì)。然后水解肽鏈，分離得到DNP－氨基酸，紙層析、薄層層析或HPLC分離鑒定。丹磺酰氯法（DNS法）：與DNFB法類似，由于丹磺酰氯有強(qiáng)烈熒光，靈敏度比DNFB法高100倍。（三）N-末端和C-末端氨基酸殘基的測定第四十六頁，共79頁。苯異硫氰酸酯法（Edman降解法）：肽鏈與PITC（Edman試劑）反應(yīng)生成PTC－多肽或PTC－蛋白質(zhì)，在酸性有機(jī)溶劑中加熱時，N末端的PTC－氨基酸發(fā)生環(huán)化，生成苯乙內(nèi)酰硫脲的衍生物（PTH－氨基酸）并從肽鏈上脫落下來，除去N末端氨基酸后剩下的肽鏈仍然是完整的。分離PTH－氨基酸并鑒定。氨肽酶法：根據(jù)游離氨基酸出現(xiàn)的時間順序分析N末端氨基酸。值得注意是不同的N末端氨基酸水解的速度不同，有時難以分析。

第四十七頁，共79頁。2、C末端分析（1）肼解法：蛋白質(zhì)或多肽與無水肼加熱發(fā)生肼解。反應(yīng)中除C末端氨基酸以游離形式存在外，其它氨基酸都轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的氨基酸酰肼。反應(yīng)中生成的氨基酸酰肼可與苯甲醛作用變成水不溶性的二苯基衍生物而沉淀。上清液中游離的C末端氨基酸借助DNFB法或DNS法鑒定。第四十八頁，共79頁。肼解法反應(yīng)式第四十九頁，共79頁。（2）還原法：肽鏈C末端的氨基酸可用硼氫化鋰還原成相應(yīng)的α－氨基醇，肽鏈水解后層析鑒定。

第五十頁，共79頁。（3）羧肽酶法：目前常用的有4種羧肽酶：A、B、C和Y。羧肽酶A能釋放除Pro、Arg和Lys之外的任何一種C末端氨基酸；羧肽酶B只能水解以堿性氨基酸Arg和Lys為C末端的氨基酸；羧肽酶C和Y可以釋放任何一種C末端氨基酸。-Val-Ser-Gly……第五十一頁，共79頁。還原法斷裂二硫橋巰基保護(hù)反應(yīng)（四）二硫橋的斷裂第五十二頁，共79頁。氧化法斷裂二硫橋過甲酸第五十三頁，共79頁。（五）氨基酸組成的分析酸水解分析除色氨酸外的其它氨基酸，堿水解分析色氨酸。氨基酸的分析：離子交換柱層析分離，茚三酮染色，比色定量。第五十四頁，共79頁。氨基酸分析儀示意圖長柱用于分離酸性和中性氨基酸短柱用于分離堿性氨基酸和氨柱中填料為細(xì)粒聚苯乙烯磺酸型陽離子交換樹脂第五十五頁，共79頁。氨基酸的離子交換柱層析圖譜洗脫曲線第五十六頁，共79頁。（六）多肽鏈的部分裂解酶裂解法：胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶（糜蛋白酶）、嗜熱菌蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶等，它們各自有自己的水解專一性。蛋白酶分為內(nèi)肽酶和外肽酶（羧肽酶、氨肽酶）?；瘜W(xué)裂解法：溴化氰（只裂解由Met的羧基形成的肽鍵，選擇性）、羥胺（裂解Asn-Gly之間的肽鍵，也能部分裂解Asn-Leu及Asn-Ala之間的肽鍵，專一性）。第五十七頁，共79頁。蛋白酶的專一性第五十八頁，共79頁。溴化氰裂解法溴化氰只裂解由Met的羧基形成的肽鍵第五十九頁，共79頁?！镫亩蔚姆蛛x純化

A.電泳法:ＳＤＳ－ＰＡＧＥ根據(jù)分子量大小分離

B.離子交換層析法:根據(jù)肽段的電荷特性分離。C.液相HPLC法:根據(jù)肽段的極性分離。D.凝膠過濾：分子篩。

第六十頁，共79頁。（七）氨基酸序列測定1、質(zhì)譜法：兩臺質(zhì)譜儀聯(lián)用，第一臺質(zhì)譜儀通過電噴射電離使肽段帶上電荷，將不同大小的肽段分離。第二臺質(zhì)譜儀分析肽段的序列。在第二臺質(zhì)譜儀上，小肽段在碰撞池中與氮氣分子或氬氣分子碰撞，碎裂成依次少一個氨基酸殘基的碎片，分析這些碎片的質(zhì)量差，可得出序列。特點：靈敏度高、所需樣品少、測定速度快。第六十一頁，共79頁。串聯(lián)質(zhì)譜儀第六十二頁，共79頁。串聯(lián)質(zhì)譜測序工作原理分離肽段測序第六十三頁，共79頁。2、Edman降解法：由N端向C端逐步降解。先將被測肽段的羧基端固定到不溶性的樹脂上，便于分離切下的氨基酸和剩余的肽段。3、酶降解法：用外肽酶逐個切下氨基酸分析。只能分析很少的幾個氨基酸。4、根據(jù)核苷酸序列的推定法：找到該蛋白質(zhì)的基因，從基因的編碼序列按三聯(lián)密碼推出氨基酸序列。第六十四頁，共79頁。

同源蛋白質(zhì)：來自不同生物體、

執(zhí)行同一/相似功能的蛋白質(zhì)

同種蛋白質(zhì)：來自相同生物體、

執(zhí)行同一功能的蛋白質(zhì)

1、同源蛋白質(zhì)三、蛋白質(zhì)的AA序列與生物功能（一）同源蛋白質(zhì)的物種差異與生物進(jìn)化第六十五頁，共79頁。

一百多個AA殘基

MW約12.5×103

28個不變殘基

2、細(xì)胞色素C與系統(tǒng)樹第六十六頁，共79頁。invariantresidues(yellow)conservativesubstitutions(blue)nonconservativeorvariableresidues(unshaded)Conservationandvariationofcytochromecsequences第六十七頁，共79頁。對不同種屬的細(xì)胞色素c的研究同樣指出具有同種功能的蛋白質(zhì)在結(jié)構(gòu)上的相似性。對100個種屬的細(xì)胞色素c的一級結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)親緣關(guān)系越近，其結(jié)構(gòu)越相似。細(xì)胞色素c的氨基酸順序分析資料已經(jīng)用來核對各個物種之間的分類學(xué)關(guān)系，以及繪制進(jìn)化樹。根據(jù)進(jìn)化樹不僅可以研究從單細(xì)胞到多細(xì)胞的生物進(jìn)化過程，還可以粗略估計各種生物的分化時間。第六十八頁，共79頁。第六十九頁，共79頁。1、氧合血紅蛋白（二）同源蛋白質(zhì)具有共同的進(jìn)化起源第七十頁，共79頁。該酶類活性中心的Ser殘基起關(guān)鍵作用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、彈性蛋白酶、凝血酶和纖溶酶有序列同源性對底物偏愛不同2、絲氨酸蛋白酶類第七十一頁，共79頁。（三）血液凝固與AA序列的局部斷裂