動物分子生物學(xué)課件：第5章 DNA的損傷與修復(fù)

第五章DNA的損傷與修復(fù)ThedamageandrepairofDNADNA雙螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生的任何改變。

主要分為兩種：單個堿基的改變雙螺旋結(jié)構(gòu)的異常扭曲DNA損傷的概念：DNA存儲著生物體賴以生存和繁衍的遺傳信息，維護(hù)DNA分子的完整性對細(xì)胞至關(guān)緊要；修復(fù)DNA損傷的能力是生物能保持遺傳穩(wěn)定性所在；DNA分子的變化并不是全部都能被修復(fù)成原樣的，因此生物才會有變異、有進(jìn)化。DNA損傷修復(fù)的重要性5.1DNA損傷的原因5.1.1DNA分子自發(fā)性損傷1.DNA復(fù)制中的錯誤堿基配對的錯誤概率約為10-1_10-2；在DNA聚合酶的校對作用下，錯配概率降到10-5_10-6；再經(jīng)過DNA結(jié)合蛋白和其他因素作用下，錯配率仍在10-10。（1）堿基的異構(gòu)互變DNA每種堿基有幾種形式，稱互變異構(gòu)體，異構(gòu)體中原子的位置及原子之間的鍵有所不同。堿基各自的異構(gòu)體間可以自發(fā)發(fā)生變化（烯醇式與酮基間互變）;A=CT=G上述配對發(fā)生在DNA復(fù)制時，會造成子代DNA序列與親代DNA不同的錯誤損傷。同型異構(gòu)體轉(zhuǎn)換=O-OH同型異構(gòu)體轉(zhuǎn)換-NH2-NH異構(gòu)互變造成復(fù)制損傷（2）堿基的脫氨基作用堿基的環(huán)外氨基自發(fā)脫落，C變?yōu)閁，A變?yōu)榇吸S嘌呤（H），G變?yōu)辄S嘌呤（X）。

復(fù)制時，U與A配對、H和X都與C配對會導(dǎo)致子代DNA序列的錯誤。堿基脫氨基導(dǎo)致的復(fù)制錯誤（3）脫嘌呤與脫嘧啶(堿基丟失)自發(fā)水解使嘌呤和嘧啶從DNA鏈的核糖磷酸骨架上脫落。哺乳類動物細(xì)胞，在30oC下，20h內(nèi)DNA鏈自發(fā)脫落嘌呤約1000個，嘧啶約500個。（4）活性氧引起的堿基修飾與鏈斷裂細(xì)胞呼吸的副產(chǎn)物O2-，H2O2造成DNA損傷，產(chǎn)生一些堿基修飾物（胸腺嘧啶乙二醇、羥甲基尿嘧啶等），還可引起DNA單鏈斷裂等損傷，這些損失的積累可導(dǎo)致老化。2.物理因素引起的DNA損傷（1）紫外線（UV）引起的DNA損傷DNA受到大劑量紫外線（260nm）照射時，同一條鏈上相鄰的嘧啶以共價鍵連成二聚體；TT,CC,CT之間都可形成二聚體。復(fù)制時，此處產(chǎn)生空耗過程，DNA不能復(fù)制，細(xì)胞不能分裂，導(dǎo)致凋亡。紫外線引起的DNA損傷－－最易形成胸腺嘧啶二聚體（TT）（2）電輻射引起的DNA損傷堿基變化細(xì)胞中的水經(jīng)輻射解離后產(chǎn)生大量OH-自由基，使DNA鏈上的堿基氧化修飾、形成過氧化物的、導(dǎo)致堿基環(huán)的破壞和脫落等。脫氧核糖變化脫氧核糖上的每個碳原子和羥基上的氫都能與OH-反應(yīng)，導(dǎo)致脫氧核糖分解，最后會引起DNA鏈斷裂。DNA鏈斷裂脫氧核糖破壞或磷酸二酯鍵斷開而導(dǎo)致DNA鏈斷裂。一條鏈斷裂稱單鏈斷裂（singlestrandbroken）；DNA雙鏈在同一處或相近處斷裂稱為雙鏈斷裂（doublestrandbroken

）膠聯(lián)（binding）同一條DNA鏈上或兩條DNA鏈上的堿基間以共價鍵結(jié)合；DNA與蛋白質(zhì)之間也以共價鍵相連；組蛋白、染色質(zhì)中的非組蛋白、調(diào)控蛋白、與復(fù)制和轉(zhuǎn)錄有關(guān)的酶都會與DNA以共價鍵連接。膠聯(lián)是細(xì)胞受電離輻射后在顯微鏡下看到的染色體畸變的分子基礎(chǔ)，會影響細(xì)胞的功能和DNA復(fù)制。輻射引起DNA分子結(jié)構(gòu)的多種變化（2）烷化劑對DNA的損傷（1）堿基類似物、修飾劑對DNA的損傷（3）嵌合劑對DNA的損傷3.化學(xué)因素引起的DNA損傷(1)堿基類似物對DNA的損傷某些化學(xué)物質(zhì)和正常的堿基在結(jié)構(gòu)上類似，有時會替代正常堿基而摻入DNA分子，一旦這些堿基類似物進(jìn)人DNA后，由于它們的配對能力不同于正常堿基，便引起DNA復(fù)制過程中其對應(yīng)位置上插入不正確堿基。

堿基類似物5-溴尿嘧啶（5-Bu）

它的分子結(jié)構(gòu)與胸腺嘧啶（T）很相似，在某些情況下它能代替T，并且能與鳥嘌呤（G）互補配對，結(jié)果使AT轉(zhuǎn)變成GC。

T5Bu5BuC

5-Bu

復(fù)制復(fù)制

AAGG

5-Bu有兩種異構(gòu)體：酮式和烯醇式，酮式與A配對，烯醇式與G配對。

除BU外，還有5-溴脫氧尿苷、5-氟尿嘧啶、5-氯尿嘧啶及它們的脫氧核苷。

另一種被廣泛應(yīng)用的堿基類似物是2-氨基嘌呤（2-AP），是一種腺嘌呤A類似物，可和胸腺嘧啶T配對?？稍俸桶奏配對，產(chǎn)生A-T、G-C的轉(zhuǎn)換，或2-AP以和胞嘧啶C配對形式進(jìn)入DNA后再和胸腺嘧啶T配對后產(chǎn)生G-C、A-T的轉(zhuǎn)換。(2)烷化劑引起的DNA損傷（特異性錯配）

某些誘變劑不摻入DNA，而通過改變堿基的結(jié)構(gòu)從而引起特異性錯配，如烷化劑（是一類親電子的化合物，具有一個或多個活性烷基）。它們的誘變作用是使DNA中的堿基烷化?；钚酝榛环€(wěn)定，能轉(zhuǎn)移到其他分子的電子密度較高的位置上，并置換其中的氫原子，使其成為不穩(wěn)定的物質(zhì)。烷化劑的種類很多，常見的有甲磺酸乙酯（EMS）、亞硝基胍（NG）和芥子氣（Mustard）等。

EMS能使鳥嘌呤的N位置上有乙基，成為7一乙基鳥嘌呤。與胸腺嘧啶配對，故能使G-C轉(zhuǎn)換成A-T。烷化劑的另一作用是脫嘌呤。例如烷基在鳥嘌呤N位上活化糖苷鍵引起斷裂，使嘌呤從DNA鏈上脫掉，產(chǎn)生缺口。復(fù)制時，與缺口對應(yīng)的位點上可能配上任一堿基，從而引起轉(zhuǎn)換或顛換；而且去嘌呤后的DNA容易發(fā)生斷裂，引起缺失或其他突變。

(3)嵌合劑的致突變作用嵌合染料是另一類重要的DNA修飾劑。包括丫啶橙（acridineorange）、原黃素（proflavin）、叮黃素（acriflavine）等染料。

這些試劑為平面分子，其分子大小與堿基對大小差不多，可以嵌入到DNA雙鏈堿基對之間，在嵌入位置上引起單個堿基對的插入或缺失突變。嵌合染料也能嵌入單鏈DNA的堿基之間，這些突變都會引起閱讀框的改變，造成移碼突變?，F(xiàn)代生活環(huán)境使人可能接觸各種各樣藥品、化妝品、食物防腐劑、殺蟲劑、工業(yè)用試劑、污染物等，其中很多化合物已被證明具有致癌性質(zhì)。研究表明在175種已知的致癌劑中，有157種是誘變劑。這些物質(zhì)是通過誘導(dǎo)體細(xì)胞突變而致癌的。例如食物防腐劑AF-2。食物熏蒸劑二溴乙烯、抗血吸蟲藥物、多種染發(fā)添加劑以及工業(yè)化合物氯乙烯等都具致癌性。因而要靠科學(xué)治理環(huán)境，保護(hù)環(huán)境就是保護(hù)人類自身。

5.1.2DNA損傷的后果導(dǎo)致DNA分子結(jié)構(gòu)變化（遺傳突變）生物體在表型上發(fā)生變化（表型突變）1.突變類型(1)點突變（pointmutation）DNA單一堿基的變異轉(zhuǎn)換（transition）：嘌呤與嘌呤、嘧啶與嘧啶之間替換顛換（transvertion）：嘌呤與嘧啶之間的替代野生型等位基因：將自然界中普遍出現(xiàn)或指定實驗用的某一品系的性狀作為“野生型”或“正常”的性狀，與這種性狀相關(guān)的等位基因稱為野生型等位基因。突變型等位基因：任何不同于野生型等位基因的相同座位的基因稱為突變型等位基因。正向突變：從野生型等位基因變?yōu)橥蛔冃偷任换??；貜?fù)突變：從突變型等位基因變?yōu)橐吧偷任换?。突變的多方向性和?fù)等位基因

一個基因內(nèi)有很多突變位點，所以，一個基因的突變也有多方向性，從而導(dǎo)致一個基因可以有兩個以上的等位形式——復(fù)等位基因。(2)缺失（deletion）/插入（insertion）DNA鏈上一個或一段核苷酸的消失或加入。堿基替換/插入缺失的遺傳效應(yīng)錯義突變（missensemutation）是指堿基替代后mRNA中編碼某種氨基酸的密碼子變成編碼另一種氨基酸的密碼子，從而使多肽鏈的氨基酸種類和序列發(fā)生改變。

單堿基對的置換后形成新的密碼子，編碼另一種氨基酸，最終產(chǎn)生另一種蛋白質(zhì)，有可能影響、改變或丟失原有蛋白質(zhì)產(chǎn)物的功能，或獲得新的功能。

錯義突變的例子——鐮狀細(xì)胞貧血癥編碼血紅蛋白β肽鏈上一個決定谷氨酸的密碼子GAA變成了GUA，使得β肽鏈上的谷氨酸變成了纈氨酸，引起了血紅蛋白的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生了根本的改變。沉默突變（silentmutation）：堿基對發(fā)生替換后，mRNA中密碼子發(fā)生改變，但編碼蛋白質(zhì)中相應(yīng)位點的氨基酸不發(fā)生改變，因此該類突變并不產(chǎn)生突變效應(yīng)，又稱同義突變。無義突變（nonsensemutation）是由DNA的堿基突變使mRNA中編碼氨基酸的密碼變成終止密碼UAA、UAG或UGA。

在相應(yīng)位點會導(dǎo)致翻譯提前終止，產(chǎn)生一條沒有功能的縮短的多肽片段，通常對蛋白質(zhì)的功能有嚴(yán)重的影響。

如GGA（甘氨酸）UGA（無義終止密）移碼突變(frameshiftmutation)

DNA分子中，編碼區(qū)堿基缺失或增加非3的倍數(shù)，造成之后的一系列密碼子發(fā)生移位的現(xiàn)象。效應(yīng)：

導(dǎo)致遺傳密碼發(fā)生改變。產(chǎn)生無功能的蛋白。(3)倒位(inversion)或轉(zhuǎn)位（translocation）DNA重組使其中一段核苷酸倒置，或從一處遷移到另一處。(4)雙鏈斷裂2.突變后果（1）致死性:

突變發(fā)生在對生命至關(guān)重要的基因上，可導(dǎo)致個體或細(xì)胞的死亡。致死突變：嚴(yán)重影響生物體生活力，導(dǎo)致個體死亡的突變?？煞譃轱@性致死突變（雜合態(tài)即可致死）和隱性致死突變（純合態(tài)才致死）。（2）基因功能的改變突變是某些疾病的發(fā)病基礎(chǔ)，包括遺傳病、腫瘤及有遺傳傾向的病。有些已知其遺傳缺陷所在。但大多數(shù)尚在研究中。

例:UVB所致的基因突變由于修復(fù)系統(tǒng)的缺陷或偶發(fā)的錯誤修復(fù)，會導(dǎo)致某些基因突變，如p53突變會使角質(zhì)形成細(xì)胞的細(xì)胞周期調(diào)控出現(xiàn)異常，進(jìn)一步發(fā)生克隆性增生和永生化生長而導(dǎo)致皮膚癌的發(fā)生。

著色性干皮?。▁erodermapigmentosis，XP）是一種切除修復(fù)有缺陷的遺傳性疾病。在研究其發(fā)病機(jī)制時，發(fā)現(xiàn)一些相關(guān)的基因，如XPA、XPB、XPC等。這些基因的表達(dá)產(chǎn)物起辨認(rèn)和切除損傷DNA的作用。

XP病人是由于XP基因有缺陷，不能修復(fù)紫外線照射引起的DNA損傷，因此易發(fā)生皮膚癌。管理基因(caretakergenes):執(zhí)行DNA的損傷修復(fù)，維持基因組的完整性。如著色性干皮病的修復(fù)基因XPA→XPF。看門基因(gatekeepergenes):控制細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化和凋亡。如p53基因等。皮膚癌的發(fā)生與看門基因突變關(guān)系密切。突變影響生物的代謝過程，導(dǎo)致一個特定生化功能的改變或喪失，如微生物的營養(yǎng)缺陷型。突變導(dǎo)致生物體外觀上可見的形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變。例如果蠅的紅眼→白眼突變：（3）突變導(dǎo)致基因型改變:這種突變只有基因型的改變，而沒有可察覺的表型改變?？刂埔恍┐我誀畹幕蚣词拱l(fā)生突變，也不會影響生物的正常生理活動，仍能保持其正常的生活力和繁殖力，為自然選擇保留下來。多態(tài)性(polymorphism)：是用來描述個體之間的基因型差別現(xiàn)象。利用DNA多態(tài)性分析技術(shù)，可識別個體及種、株間差異。

5.2DNA突變修復(fù)機(jī)制1.直接修復(fù)（1）通過DNA聚合酶校正修復(fù)原核生物：DNApolI

真核生物：β、δ、ε

（2）光復(fù)活反應(yīng)（photoreactivation）——（主要對胸腺嘧啶二聚體而言）修復(fù)機(jī)制：在可見光（300~600nm）活化之下，由光復(fù)活酶（photoreactivatingenzyme，

PR）催化胸腺嘧啶二聚體分解為單體。

光復(fù)活酶修復(fù)過去認(rèn)為，光復(fù)活酶存在于細(xì)菌和低等真核生物體內(nèi)。研究發(fā)現(xiàn)在鳥類中也有存在。B．M．Sutherland（1974）報道，在人類白細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)光復(fù)活酶，隨后在人類的成纖維細(xì)胞和淋巴細(xì)胞中也有發(fā)現(xiàn)。說明這種酶在生物界分布廣泛，這一修復(fù)機(jī)制在哺乳動物中也起重要作用。

2.切除修復(fù)（1）一般切除修復(fù)嘧啶二聚體的另一種修復(fù)方式，又叫暗修復(fù)（darkrepair）

參與的酶：修復(fù)內(nèi)切酶、外切酶、DNApol

II

和連接酶

修復(fù)內(nèi)切酶識別胸腺嘧啶二聚體，并在二聚體前的糖－磷酸骨架上作一切口；

PolII

在3’－OH末端聚合一條新的DNA鏈，并在外切酶的作用下置換掉大約20個核苷酸的DNA片段；DNA連接酶封合新合成的DNA片段和原有DNA鏈間的切割。修復(fù)過程：“切除修復(fù)”切補切封（2）特殊切除修復(fù)AP核酸內(nèi)切酶修復(fù)途徑參與的酶：AP核酸內(nèi)切酶、DNA外切酶、DNApol

I和連接酶過程：AP核酸內(nèi)切酶識別AP位點，切除包括AP位點的小片段DNA；DNApol

I和連接酶完成新鏈的合成和連接。AP位點：DNA鏈上脫嘌呤或脫嘧啶的位點AP核酸內(nèi)切酶修復(fù)途徑尿嘧啶-糖基化酶系統(tǒng)現(xiàn)象：C自發(fā)脫氨基氧化而生成U，導(dǎo)致U和A在復(fù)制中配對后出錯

參與的酶：糖基化酶、AP內(nèi)切核酸酶DNA聚合酶II、DNA連接酶尿嘧啶－糖基酶系統(tǒng)尿嘧啶-糖基酶（1）錯配修復(fù)系統(tǒng)（mismatchrepairsystem,MRS）現(xiàn)象：復(fù)制過程中新鏈摻入錯配堿基，錯配修復(fù)系統(tǒng)的識別標(biāo)記是GA*TC中A的甲基化；沿著新生DNA鏈，有一個甲基化梯度，靠近復(fù)制叉程度最小，親本鏈甲基化程度高且均一參與的酶：錯配矯正酶DNA聚合酶III

DNA連接酶3.復(fù)制后修復(fù)修復(fù)機(jī)制：錯配修復(fù)系統(tǒng)修復(fù)機(jī)制：錯配修復(fù)系統(tǒng)DNA的半甲基化（2）重組修復(fù)（recombinationrepair

)是指由基因的同源重組介導(dǎo)的一種修復(fù)過程。重組修復(fù)是對尚未修復(fù)的損傷DNA先復(fù)制再修復(fù)。

（3）SOS修復(fù)（應(yīng)急反應(yīng)）一種旁路系統(tǒng)，允許新生DNA鏈越過胸腺嘧啶二聚體而生長；保真度降低；是“易錯修復(fù)”是指DNA受到嚴(yán)重?fù)p傷或復(fù)制系統(tǒng)受到抑制時，細(xì)胞為求生存而出現(xiàn)的一種應(yīng)急措施。參與的酶：recA酶、LexA酶

SOS反應(yīng)的起始：誘導(dǎo)信號:嚴(yán)重的DNA損傷產(chǎn)生大量單鏈缺口起始因子:重組蛋白RecA的水解酶活性被激活RecA的激活導(dǎo)致阻遏蛋白LexA自我催化引起自身的裂解，同時使許多與修復(fù)相關(guān)的基因被激活LexA是一種小分子蛋白（22KDa），具有蛋白酶活性，是很多操縱子的阻遏物（調(diào)控基因產(chǎn)物）。RecA的激活使LexA的阻遏功能失去活性，并且同時誘導(dǎo)了它所結(jié)合的操縱子基因的表達(dá)。和SOS反應(yīng)有關(guān)的基因，包括RecA，lexA,UvrA,UvrB,umuC和himA。RecA也觸發(fā)細(xì)胞中其它靶物質(zhì)的剪切，包括各種原噬菌體的阻遏蛋白。圖SOS修復(fù)5.3限制與修飾（restrictionandmodification）50年代初發(fā)現(xiàn)細(xì)菌能將外來DNA片段在某些專一位點上切斷，從而保證其不為外來噬菌體所感染，而其自身的染色體DNA由于被一種特殊的酶所修飾而得以保護(hù)，這種現(xiàn)象叫做限制－修飾。實驗：從3種不同菌株繁殖出來的噬菌體后代，接種到同樣菌株，接種率達(dá)100％；如接種到不同菌株上，情況便不同；λ、k在B株上接種效率只有10-4，λ、B在k株上也只有10-4；

如將生存下來的噬菌體接種到第一輪同樣的菌株中，如λ、k

→λ、B→B,則接種效率為100％。restrictionandmodification推論：含有一種限制修復(fù)系統(tǒng)，限制酶能夠?qū)⑼鈦鞤NA切斷；修飾酶（甲基化酶）通過將自身腺嘌呤甲基化，或?qū)奏ぜ谆瘜ψ陨鞤NA進(jìn)行修飾，因此不會將自身DNA降解掉；當(dāng)外來噬菌體進(jìn)入大腸桿菌后，絕大部分被限制酶所降解，極少數(shù)被甲基化酶所修飾而幸存下來；修飾后的噬菌體再進(jìn)入大腸桿菌，不會被降解。細(xì)菌為對付外來DNA和保護(hù)自己DNA而演化來的。1968年Smith等人從流感嗜血桿菌株中分離出兩個類內(nèi)切酶，HindII和HindIII，為基因工程技術(shù)的誕生奠定了基礎(chǔ)。I類限制性內(nèi)切酶1）是異源多聚體，包含三個亞基R、M和S，其功能分別為限制性內(nèi)切酶、甲基化酶和DNA特異位點識別。2）與DNA結(jié)合依賴M亞基與輔助因子S-腺苷甲硫氨酸（SAM）的相互作用。3）與DNA分子結(jié)合后，根據(jù)該位點的甲基化狀態(tài)發(fā)揮相應(yīng)的酶活性，或修飾或切割。切割位點與識別位點相隔1-5kb，切割位點的序列特異性不嚴(yán)格。4）種類較少，研究較多的有大腸桿菌的Ec