高中生物選修1專題2微生物的培養(yǎng)與應用

高中生物選修1專題2微生物的培養(yǎng)與應用第1頁/共47頁微生物的基礎知識微生物病毒真菌原生動物原核生物

結構簡單,個體多數(shù)十分微小(光學顯微鏡或電子顯微鏡才能看到)，繁殖迅速第2頁/共47頁課題1.微生物的實驗室培養(yǎng)三.純化大腸桿菌四.菌種保存一.培養(yǎng)基二.無菌技術第3頁/共47頁課題1.微生物的實驗室培養(yǎng)一.培養(yǎng)基1.概念:人們按照對微生物的營養(yǎng)物質的不同需求,配制供微生物生長繁殖的營養(yǎng)基質。第4頁/共47頁課題1.微生物的實驗室培養(yǎng)一.培養(yǎng)基2.成分：

一般都含有水、碳源、和氮源、無機鹽、等營養(yǎng)物質，另外還需要滿足微生物生長對pH、特殊營養(yǎng)物質,以及氧氣的要求。第5頁/共47頁課題1.微生物的實驗室培養(yǎng)一.培養(yǎng)基3.分類：a根據(jù)物理性質分固體培養(yǎng)基——用于微生物的分離計數(shù)液體培養(yǎng)基——常用于工業(yè)生產(chǎn)第6頁/共47頁課題1.微生物的實驗室培養(yǎng)一.培養(yǎng)基3.分類：b根據(jù)化學成分分合成培養(yǎng)基——成分明確天然培養(yǎng)基——成分不明確c根據(jù)用途分選擇培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基第7頁/共47頁選擇培養(yǎng)基加入青霉素的培養(yǎng)基

分離酵母菌、霉菌等真菌加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基

分離金黃色葡萄球菌不加氮源的無氮培養(yǎng)基

分離固氮菌不加含碳有機物的無碳培養(yǎng)基

分離自養(yǎng)型微生物加入青霉素等抗生素的培養(yǎng)基

分離導入了目的基因的受體細胞第8頁/共47頁課題1.微生物的實驗室培養(yǎng)二.無菌技術利用較為溫和的化學或物理方法,殺死物體中的部份微生物(不包括芽孢和孢子)1.消毒以強烈的化學或物理方法消滅體內外所有微生物,包括芽孢和孢子。2.滅菌第9頁/共47頁芽孢

有些細菌在一定的條件下，細胞里面形成一個橢圓形的休眠體，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，對干旱、低溫、高溫等惡劣的環(huán)境有很強的抵抗力。芽孢又小又輕，可以隨風飄散。當環(huán)境適宜的時候，芽孢又可以萌發(fā)，形成一個細菌.第10頁/共47頁a.煮沸消毒法:100℃煮沸5-6minb.巴氏消毒法:70-75℃下煮30min或80℃下煮15minc.化學藥劑消毒法:用75%酒精、新潔爾滅等進行皮膚消毒;氯氣消毒水源d.紫外線消毒……常用消毒的方法：第11頁/共47頁干熱滅菌：160-170℃下加熱1-2h。高壓蒸氣滅菌：100kPa、121℃下維持15-30min.灼燒滅菌常用滅菌的方法：第12頁/共47頁課題1.微生物的實驗室培養(yǎng)三.純化大腸桿菌一).培養(yǎng)基配制與滅菌二).接種、培養(yǎng)—純化大腸桿菌三).結果分析與評價第13頁/共47頁課題1.微生物的實驗室培養(yǎng)二.純化大腸桿菌2)稱量(按比例)3)溶化1)計算4)滅菌:將包好培養(yǎng)基和培養(yǎng)皿進行高壓蒸汽滅菌5)待冷卻到50OC時倒平板一).培養(yǎng)基配制與滅菌第14頁/共47頁倒平板操作的討論用手觸摸錐形瓶，溫度下降到剛剛不燙手時即可開始倒平板。

通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地揮發(fā)，又可以防止凝結在皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基,造成污染空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個平板培養(yǎng)微生物。第15頁/共47頁課題1.微生物的實驗室培養(yǎng)二).純化大腸桿菌1.原理在適宜環(huán)境下，單個細菌能迅速生長增殖形成一個細胞群體－－菌落第16頁/共47頁課題1.微生物的實驗室培養(yǎng)二).純化大腸桿菌2.方法:平板劃線法、稀釋涂布平板法1.原理在適宜環(huán)境下，單個細菌能迅速生長增殖形成一個細胞群體－－菌落第17頁/共47頁課題1.微生物的實驗室培養(yǎng)4.平板劃線法

通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面。注意事項二).純化大腸桿菌第18頁/共47頁課題1.微生物的實驗室培養(yǎng)注意事項:

a.在操作的第一步、劃線之前以及劃線操作結束時都要灼燒接種環(huán)？避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物殺死上次劃線結束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時，接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端。及時殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細菌污染環(huán)境和感染操作者第19頁/共47頁課題1.微生物的實驗室培養(yǎng)注意事項:b.在灼燒接種環(huán)之后,要等其冷卻后再進行劃線以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。c.在作第二次以及其后的劃線操作時，總是從上一次劃線的末端開始劃線能使細菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少,最終能得到由單個細菌繁殖而來的菌落。第20頁/共47頁5.稀釋涂布平板法

將菌液進行一系列的梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基的表面進行培養(yǎng)。二).純化大腸桿菌第21頁/共47頁系列稀釋操作101102103104105106第22頁/共47頁涂布平板操作(1)將涂布器浸在盛有70％的酒精的燒杯中。(2)取少量菌液(不超0.1mL),滴加到培養(yǎng)基表面。(3)將沾有酒精的涂布器在火焰上引燃，火熄后冷卻8～10s。(4)用涂布器將菌液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面。第23頁/共47頁課題1.微生物的實驗室培養(yǎng)6.培養(yǎng)觀察

將接種后的培養(yǎng)基和一個未接種的培養(yǎng)基放入37度恒溫箱中培養(yǎng)

12h和24h后，分別觀察記錄二).純化大腸桿菌第24頁/共47頁

1.未接種的培養(yǎng)基表面是否有菌落生長？如果有菌落生長，說明了什么？無菌落生長，說明培養(yǎng)基的制備是成功的，否則，說明培養(yǎng)基有雜菌，需要重新制備。

2.在接種大腸桿菌的培養(yǎng)基上，能否觀察到獨立的菌落？它們的大小、形狀、顏色相似？

如果接種成功的話，在培養(yǎng)基的表面可觀察到大小、形狀、顏色相似的菌落。三).結果分析與評價第25頁/共47頁

3.培養(yǎng)12h和24h后，觀察到的實驗結果相同嗎？如果不同，請分析產(chǎn)生差異的原因？

培養(yǎng)12h與24h后的大腸桿菌菌落的大小會有明顯不同。隨著時間的延長、菌落的不斷生長，使菌落不斷增大。

4.如果在培養(yǎng)基上觀察到不同形態(tài)的菌落，請分析其可能的原因。

無菌操作未達到要求：可能是培養(yǎng)基滅菌不徹底；可能是接種時發(fā)生了污染；也可能是在培養(yǎng)的過程中受到了污染。三).結果分析與評價第26頁/共47頁

1.試管低溫臨時保存

將菌種接種到試管的固體斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)成菌落后，置于4OC的冰箱中保存（每隔3～6個月要重新接種培養(yǎng)后再保存）。

2.甘油管長期保存

在3mL的甘油瓶中加入1mL的甘油，高壓滅菌。將1mL培養(yǎng)的菌液轉移到甘油瓶中，充分混合后，置于－20OC的冷凍箱中保存。四.菌種保存第27頁/共47頁課題2.土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)一.基礎知識原理1.分離--篩選菌株篩選原理:人為提供有利于目的菌株生長的條件，同時抑制或阻止其他微生物生長。篩選方法:選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)控制培養(yǎng)基的PH控制培養(yǎng)的溫度(氧濃度等)第28頁/共47頁課題2.土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)一.基礎知識原理2.計數(shù)篩選方法:用顯微鏡直接計數(shù)間接計數(shù)—統(tǒng)計平板的菌落數(shù)間接計數(shù)法（活菌計數(shù)法）:原理:在稀釋度足夠高時，微生物在固體培養(yǎng)基上所形成的一個菌落是由一個單細胞繁殖而成的，即一個菌落代表原先的一個細菌方法:稀釋涂布平板法計算公式:（C÷V）xM第29頁/共47頁注意事項①為了保證結果準確，一般選擇菌落數(shù)在30——300的平板上進行計數(shù)。②為使結果接近真實值可將同一稀釋度加到三個或三個以上的平皿中，經(jīng)涂布，培養(yǎng)計算出菌落平均數(shù)。③統(tǒng)計的菌落往往比活菌的實際數(shù)目低。第30頁/共47頁課題2.土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)一.基礎知識原理3.設計對照實驗目的排除無關變量對實驗結果的影響，提高實驗結果的可靠性第31頁/共47頁課題2.土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)二.實驗設計與操作1.土壤取樣2.制備培養(yǎng)基3.接種、培養(yǎng)、觀察4.細菌的計數(shù)第32頁/共47頁課題2.土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)二.實驗設計與操作1.土壤取樣2.制備培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基—對照選擇培養(yǎng)基--尿素為唯一氮源第33頁/共47頁課題2.土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)二.實驗設計與操作3.接種、培養(yǎng)、觀察稀釋涂布平板接種稀釋液的倍數(shù)的范圍:真菌:102～104細菌:104～106

放線菌:103～105每一個濃度做3個或3個以上平板,求平均值重復實驗--增強說服力和準確性第34頁/共47頁課題2.土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)二.實驗設計與操作3.接種、培養(yǎng)、觀察時間溫度細菌1-2d30～37OC放線菌霉菌5-7d25～28OC3-4d25～28OC第35頁/共47頁課題2.土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)二.實驗設計與操作1.土壤取樣2.制備培養(yǎng)基3.接種、培養(yǎng)、觀察4.細菌的計數(shù)每隔24h統(tǒng)計一次菌落數(shù)目。當菌落數(shù)目穩(wěn)定時，選取菌落數(shù)在30-300的平板進行計數(shù)。每同一濃度至少對3個平板進行重復計數(shù),求平均值再根據(jù)對應稀釋的計算出樣品中的細菌數(shù)第36頁/共47頁計數(shù)每克土壤中菌株數(shù)＝(C/V)XM平板的平均菌落數(shù)X稀釋液的稀釋倍數(shù)涂布時所用稀釋液體積第37頁/共47頁課題2.土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)三.課題延伸原理細菌分解尿素時產(chǎn)生氨，氨使培養(yǎng)基的堿性增強。因此，可通過檢測培養(yǎng)基PH變化來鑒定該種細菌能否分解尿素方法在選擇培養(yǎng)基中加酚紅指示劑,培養(yǎng)細菌，觀察指示劑是否變紅。－－對分離的菌種作進一步的鑒定第38頁/共47頁課題３.分解纖維素的微生物的分離一.基礎知識－－原理1.纖維素與纖維素酶纖維素：一種由葡萄糖首尾相連而成的高分子化合物，廣泛地存在于植物的根、莖、葉等器官中。纖維素酶：由微生物分泌的一種復合酶，包括C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶，由于它們的協(xié)同作用，最終將纖維素分解成葡萄糖。纖維素C1酶Cx酶纖維二糖葡萄糖苷酶葡萄糖第39頁/共47頁課題３.分解纖維素的微生物的分離一.基礎知識－－原理2.剛果紅染色法篩選纖維素分解菌的原理第40頁/共47頁二.實驗設計土壤取樣選擇培養(yǎng)梯度稀釋將樣品涂布到鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基上挑選產(chǎn)生透明圈的菌落1.實驗流程課題３.分解纖維素的微生物的分離第41頁/共47頁選擇培養(yǎng)

將土樣加入裝有30ml選擇培養(yǎng)基的錐形瓶中，將錐形瓶固定在搖床上，在一定溫度下震蕩培養(yǎng)1～2天，直至培養(yǎng)液變渾濁。也可重復選擇培養(yǎng)第42頁/共47頁剛果紅染色法思考：這兩種方法各有哪些優(yōu)點與不足

方法一缺點是操作煩瑣，加入剛果紅溶液會使菌落之間發(fā)生混雜；優(yōu)點是這樣顯示出的顏色反應基本上是纖維素分解菌的作用方法二優(yōu)點是操作簡便，不存在菌落混雜問題缺點一是由于培養(yǎng)基中還含有淀粉類物質，可使產(chǎn)生淀粉酶的菌落也出現(xiàn)透明圈(模糊)；缺點二有些微生物具有降解色素的能力，它們在長時間培養(yǎng)過程中會形成明顯的透明圈第43頁/共47頁課題延伸－－對分離的菌種作進一步的鑒定進行發(fā)酵產(chǎn)生纖維素酶，再