重組人B淋巴細(xì)胞刺激因子工程菌高密度發(fā)酵

RecombinantHumanBLymphocyteStimulatorXueXiao-Chang,BaoChun-Jie,HanWei,QinXin,ZhangCun,CaoZhu-Rong,LiWei-Na,ZhaoYu-Hong,ZhangYingqiBiotechnologyCenterofFourthMilitaryMedicalUniversity,Xian710032Abstract:InordertoreachthegoalofhighcelldensityfermentationandhighlevelexpressionofrecombinanthumanBlymphocytestimulator(E.coliDH5/pKKH-BLyS).Pilottestoftubecultureandflaskshakingcultureweredonetogetoptimizedcultureconditions,includingpHvalueforculture,inducerconcentrationofIPTG,inductiontimeandduration,rangeofdissolvedoxygenandthemanneroffeeding.Then,weperformedathree-timerepeatedfermentationundertheestablishedconditions.Thefinalcelldensitywasabout25A600andmorethan50gofwetbacteriaperlitercouldbeobtained.Theaverageexpressionlevelofrecombinantproteinwasabout40%oftotalbacterialproteins.Theresultsshowthattheestablishedfermentationprocedureisstable,ofshortcycleandwithhighexpression,whichlaysthebasisforfurtherpurificationandlarge-scaleproductionofBLyS.KeyWords:BLymphocyteStimulator,RecombinantEscherichiacoli,Highcelldensityfermentation重組人B淋巴細(xì)胞刺激因子工程菌高密度發(fā)酵薛曉暢包春杰韓葦秦鑫張存曹筑榮李維娜趙玉紅張英起(第四軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系生物技術(shù)中心,西安710032)摘要：為實現(xiàn)重組人B淋巴細(xì)胞刺激因子工程菌E.coliDH5/pKKH-BLyS的高密度、高表達發(fā)酵,首先進行了培養(yǎng)條件的摸索,確定了該工程菌的最佳培養(yǎng)pH值、誘導(dǎo)劑IPTG的濃度、誘導(dǎo)的最佳時間段、溶氧范圍以及補料的流加方式等,根據(jù)優(yōu)化條件，用5L自控發(fā)酵罐進行三批重復(fù)發(fā)酵,最終菌體密度均達到25A600以上，菌體獲得量均可達濕重30g以上，目的蛋白質(zhì)的表達量占菌體總蛋白的40%左右，保持并超過了該重組蛋白在試管和搖瓶中的表達量。此發(fā)酵工藝具有周期短、產(chǎn)量高、重復(fù)性穩(wěn)定性好等特點，為下游的純化和進一步的大規(guī)模生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：B淋巴細(xì)胞刺激因子;重組大腸桿菌;高密度發(fā)酵中圖分類號:Q516;TQ92文獻標(biāo)識碼:A文章編號：B淋巴細(xì)胞刺激因子（BLymphocyteStimulator,BLyS）是1999年由瑞士和美國科學(xué)家發(fā)現(xiàn)的腫瘤壞死因子（TumorNecrosisFactor,TNF）家族的一個新成員[1]。該分子含有285個氨基酸，屬于II型跨膜蛋白。BLyS主要由T細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等髓系來源的細(xì)胞分泌。BLyS以膜結(jié)合及可溶性兩種方式存在于機體中，兩者均具有生物學(xué)活性。研究表明BLyS在B細(xì)胞的存活和功能調(diào)節(jié)方面發(fā)揮著重要作用，它可以延長B細(xì)胞存活時間、促進其增殖，從而導(dǎo)致B細(xì)胞增生和自身免疫狼瘡樣變化的出現(xiàn)。BLyS的過度表達是發(fā)生自身免疫性疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等的重要因素之一[2-4]。BLyS已經(jīng)成為治療自身免疫性疾病的有效靶點，我們構(gòu)建了人BLyS疫苗表達重組載體，動物實驗表明該重組疫苗對于多發(fā)性硬化和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎動物模型均具有良好的保護作用[5]。但研究結(jié)果僅局限于實驗室規(guī)模。欲真正實現(xiàn)其價值，必須借助于高密度發(fā)酵技術(shù)，將生產(chǎn)提高到工業(yè)生產(chǎn)的規(guī)模。本文對重組人BLyS工程菌E.coliDH5/pKKH-BLyS表達和生長的特有規(guī)律進行了初步研究，并建立了一個適用于工業(yè)化的高密度、高表達生產(chǎn)工藝。1材料和方法1.1材料1.1.1宿主菌和質(zhì)粒宿主大腸桿菌E.coliDH5[supE44△lacU169(Ф80lacZ△M15)hsdR17recA1endA1gyrA96thi-1relA1]購自Invitrogen公司；原核非融合表達載體pKKH由浙江大學(xué)王憲鋒博士贈送，重組質(zhì)粒pKKH-BLyS由第四軍醫(yī)大學(xué)生物技術(shù)中心構(gòu)建，基因的表達受Trc啟動子控制，IPTG能誘導(dǎo)目的基因的表達，氨芐青霉素抗性。1.1.2培養(yǎng)基務(wù)LB砍培養(yǎng)基用于搭試管種子培劇養(yǎng)歲，枝2YT監(jiān)培養(yǎng)基用于群三角搖瓶培銷養(yǎng)詳，容半合成培養(yǎng)毫基用于牛5貌L吐發(fā)酵罐中分替批補料培養(yǎng)使。宗LB建培養(yǎng)基中含筑有坦(g/寇L)勤：侍蛋白胨足10添，蓋酵母粉壯5巧，務(wù)NaCl漂翁10沫；有半合成培養(yǎng)攪基中含有慮(g/L)郊：偶磷酸鹽適量縣(KH畝2定PO妖4季∶要K斃2草HPO令4艘∶倆Na酬2嗚HPO艘4約·12H勞2疊O=2愚∶勸4伙∶狐7),(變NH4)租2之SO技4沖1.8錫，體NH并4壓Cl0.醬3涼，臟蛋白胨息4.5舍，途酵母粉仍2.25芹，航甘油適量和磁微量元素洽(MgSO癥4達·7H虎2安O0.3畝)言；儲補料基質(zhì)中舅含有栗(g/L)近：祥甘油適量還，區(qū)酵母粉賣5艦，譽蛋白胨柿10測，耀MgSO徑4協(xié)·7H付2杠O0.6抹?？赜眉?mol首/棵LNaO仔H儲溶液旨，宣將溶液的尿pH許值全部調(diào)為痕7.0刃。哀培養(yǎng)基和補顯料在漸121旨℃伶高壓滅菌昏20mi角n幟，撫各種培養(yǎng)基撥中都加入氨摟芐青霉素豈。不1.1.熱3魯斯儀器繁Biost冠at-CT消5變型峰5L哲自動發(fā)酵罐套，德國沫BBro挨wn任公司；良J2-SH亮型冷凍高速膛離心機為屑美國印Bechm屢an荒公司產(chǎn)品逢；妻微量蛋白電就泳儀為搞Bio恩-霞Rad倚公司產(chǎn)品哨；聲Ult級rasca些nXL報灰度掃描儀拐為跑LKB豈產(chǎn)品。脅1.2謙方法匙1.2.腔1熟坑試管表達漠取算-70鍵℃保存甘油電菌種坡，嶺劃線接種于罪含氨芐極(100渡酬μg/ml凈)斧的削LB吩平板肝，算37桐℃培養(yǎng)過夜盯，它挑爽取首單當(dāng)克隆菌落泳于貞5翁mlL袍B場試管中封，丸37透℃赴，膝200r戒/min俱振搖培養(yǎng)至胸A婚600御0.6清～疾0.8攤，脈加入造IPTG網(wǎng)誘導(dǎo)表達球，將表達量告最高的克隆夕作為發(fā)酵用存種子，分裝垃冷凍保存，拆每批發(fā)酵取蝦出一管，以蹲保證菌種的釀穩(wěn)定性。未忙誘導(dǎo)菌液可焦作為活化種型子保存于總4掠℃。胃1.2.殼2缺傍搖瓶培養(yǎng)祝2%枕活化種子接騎種于含綁150m董l敬熱2YT蠶的饞500m因l爬搖瓶中卸，廉37伏℃底，慘200r剩/min由振搖培養(yǎng)至乞?qū)?shù)中期含，奴加采入鴉IPTG奸誘導(dǎo)或作為辭5L殘發(fā)酵罐的菌爬種。替1.2.鍵3仗累5L曠自控發(fā)酵罐咳中分批補料體培養(yǎng)聯(lián)取三角瓶種示子液按稀3駛%仿接種入發(fā)酵照罐?？刂茀⒀頂?shù)為溶氧及允轉(zhuǎn)速煮：啊溶氧控制在概30劫%努～升5彩0%兇，肝達到最大轉(zhuǎn)息速沿800r嶼/min缸后頌,橡自動通入純辨氧。溫度控這制為蠻37早℃。擇pH半值設(shè)定為紹7.0瞞，狼當(dāng)pH低于零該值時，通售過偵流加綢30%棉的塌氨水游來朽保持恒定。毒補料流加拉方案為掘發(fā)酵過程中鴨0濫～浸6h椅不加補料誼，瘋6毒～辮8蠟h疑補料流速設(shè)秤定為世50ml歲/h蠻,8柴～汪10霸h下補料流速設(shè)勻定為肢100m欄l/h級。拒1.2.偷4沒游重組辦BLyS烘表達量測定愿按常規(guī)佩SDS影-送PAGE講檢測茅，姨灰度掃描儀潮分析重組蛋君白占菌體總淋蛋白的百分輪含量。怕1.2.林5牛望菌體濃度測桐量笨采用稱重法浮和濃度法司，泄A畢600肆傻nm殺吸收值與細(xì)登胞干重呈線請性。一個單含位的笨A幣600容約為干菌非0.4趁g/L競。緣1.2.叔6急洽菌體總蛋白圈測定倘Bradf潔ord饑法測菌體總端蛋白政，支總平均值為石0.嫂525g橫/g(喬蛋白拉/聲干菌體圈)影[6]騾。牢2腿結(jié)果究2.1私試管培養(yǎng)昨及條件優(yōu)化錦2.1.檢1進績試管培養(yǎng)中慣誘導(dǎo)表達時前間的優(yōu)化帝試管培養(yǎng)至車對數(shù)中期恐(A矩600景=0.滿6)燙,前加入耽0.早1叫mmol啞/L譜把IPTG距誘導(dǎo)重組蛋純白的表達睡，候每閣0.5h乏取樣一次辨，飾SDS神-擋PAGE煉分析表達情待況。結(jié)果表導(dǎo)明誘導(dǎo)論1抵h丑后外源蛋白禿即開始表達隊，該表達水平在禽3h內(nèi)內(nèi)迅速提高恭，4妙約h泳達到高峰獻，用5三h銀后開始下降奴，昏菌體密度也集有所降低。蔬由此確定發(fā)變酵結(jié)束時間臘可以在誘導(dǎo)紫后玉4艇～追5h支，雷控制在菌體怠密度開始下氧降前。拖素播沉擠陰腦點丈泰12挺34圓5從6耀Fig.1直工程菌發(fā)裂酵的菌體生構(gòu)長曲線和目乏的蛋白表達豐水平。葉1:未誘政導(dǎo)菌體總蛋辣白;2:督誘導(dǎo)1小獎時菌體總蛋感白;3:手誘導(dǎo)2小野時菌體總蛋訴白;4:洽誘導(dǎo)3小晶時菌體總蛋思白;5:遼誘導(dǎo)4小餐時菌體總蛋趣白;6:錫誘導(dǎo)5小稍時菌體總蛋睛白.燈2.1.竿2支卡IPTG割濃度對重組碰蛋白表達水憶平的影響腔試管培養(yǎng)至規(guī)A快600菊=0.6晶時季，幣加入后IPTG肌至受0.01陳、酸0.0戀2、滿0.0葡5、算0.1羅、刷0.菜2、刪0.陸5、下1.0該、2.0銳mmol/首L認(rèn)終濃度辣，禍誘導(dǎo)表達擴4h辨，舟最終菌體密棗度為蚊1.造5棋A揭600伐，明取樣用弟SDS罩-副PAGE盜檢測。結(jié)果鍛可見懷0.01坑mmol/洗LIPT渡G緒即有誘導(dǎo)外膚源蛋白表達棉的能力量，在0.0乒1~2m牽mol/L康時，每IPTG賊誘導(dǎo)叨濃度薦對目的蛋白風(fēng)質(zhì)的叮表達水平嗚沒有顯著性粗影響。滾本文發(fā)酵中句采用弱0.5姜mmol蕩/臨LIPT害G自誘導(dǎo)菌體濃崖度為伏2荷5休千A繪600氧左右的菌體逃表達估，挨取得了良好夾的結(jié)果。宇1承終2裳霧3怖小4葡裝56臟家筋7糠擴8在料9蝴Fig.短2椒牛不同濃度排IPTG誘籃導(dǎo)劑對于鋸TT-BL臂yS極蛋白質(zhì)表達攀水平的影響獻摘1攜:未誘導(dǎo)左菌體總蛋白吸;2-9徹:說0.01、駐0.02、匪0.05、畢0.1、0浸.2、0.次5、1匯和度2mmo滑l/LI伯PTG耕誘導(dǎo)后菌體鏟總蛋白.辣2.2妄三角瓶培值養(yǎng)中誘導(dǎo)時麻機吩對細(xì)菌生長饒和蛋白表達腹的影響咬利用特制的仗通氣良好的別三角瓶進行劍培養(yǎng)繪，茄在細(xì)菌生長踏的對數(shù)早、胞中、晚期滲(壤分別培養(yǎng)剪4h槍、毯6h桿、耕8h)宣加入芹0.罵1黃mmol瞧/L否IPTG葛進行表達咸4h灰，幸結(jié)果表明在命中期誘導(dǎo)不甩僅最終菌體報密度較高壘，肝重組蛋白的團產(chǎn)量也博較其它各期考更高。如在稍早期誘導(dǎo)，遍雖然表達量糊比較高，但擠是由于誘導(dǎo)姐劑的抑制效俯果收菌量明判顯下降；在聯(lián)晚期進行誘剪導(dǎo)堪，韻盡管誘導(dǎo)時肌菌體密度更度高住，榨但誘導(dǎo)后細(xì)虛菌生長很快口進入衰亡期巡，叨并有自溶傾巷向談，察因而表達外攔源基因的能心力也隨之下戚降。胃2.3挪歉5L慢發(fā)酵罐中描工程菌說的高密度、再高表達培養(yǎng)秧圖搞3宵顯示牛DH5讓/p尚KKH-B海LyS戲高密度高表直達培養(yǎng)發(fā)酵地的在線控制心圖。整個發(fā)誼酵過程中物pH洽控制在店7.0禽左右丟，堡溫度特37撲℃侮，賀溶解氧握35%零左右斬，蜂轉(zhuǎn)速于夢8跨h驚左右達到昆800r通/min膨并開始利用錄純氧。發(fā)酵培開始的濃0餅～放6h無，主培養(yǎng)基中含反有一定的營續(xù)養(yǎng)物質(zhì)速，拐故不加補料疾，左6h羽后抹pH稅逐漸升高墻，緊說明培養(yǎng)基桃中碳源已耗叔盡店，菠細(xì)菌生長分幻解氮源回，侍結(jié)果代謝產(chǎn)辦生以NH進4凈+怪而使裂pH海升高綢，權(quán)此時是補料睬的最佳時期掏，妻同時加入妙0.5肅mmol率/L會萬IPTG績，絡(luò)誘導(dǎo)表達啄BLyS蟲后細(xì)菌的生貌長開始逐漸泡減緩四，斥于誘導(dǎo)后完4宣h億終止發(fā)酵持(訓(xùn)圖啟3)佳，稠最終菌體密懲度為御25繩A妥600欠，音歲SDS太-棍PAGE(干圖造4)炎后激光灰度福掃描得重組她蛋白的表達劃量顧約殖為俊4螺0紹%中（最高可以許達到47%錯）番。付Fig.3琴樓pKKH-買TT-BL塌yS/DH掛5母工程菌日補料分批培隙養(yǎng)的蘆菌體娛生長曲線和宜TT-BL免yS的表達曲線弊慣攏土動1挽23雷4悶5經(jīng)6械7鍛塵設(shè)量托熊歌進紛搜A臥護既無費B伯Fig.4塌TT-B傅LyS表達鮮水平的SD房S-PAG鳴E及灰度掃默描鑒定竿A：1:瘋蛋白質(zhì)分子隊量Mark造er;2章,4,6:央未誘導(dǎo)菌兆體總蛋白;臘3,5,酸7:誘導(dǎo)墨后蛋白表達奶情況捕.袍B:目的散蛋白質(zhì)SD稅S-PAG詞E分析的灰巡度掃描結(jié)果擴.瓣3穿討論帆基因工程菌要的發(fā)酵不同灘于傳統(tǒng)發(fā)酵餡工藝桐，端前者帶有外艇源克隆基因家的重組表達倡載體治，聯(lián)發(fā)酵生產(chǎn)的昂目的是要獲貿(mào)得大量的外借源基因產(chǎn)物桃，至盡可能減少沫宿主細(xì)胞本弊身蛋白的污燥染。重組大詢腸桿菌高密剝度培養(yǎng)受表則達系統(tǒng)、培或養(yǎng)基、培養(yǎng)臺方式、發(fā)酵蝕條件控制等蝦多種因素的金影響泛[7,8]查，傍對菌體高密吼度培養(yǎng)的同贈時實現(xiàn)高表健達的研究報節(jié)道不多。在艱實際操作中捷，憐需要對各種寄因素進行優(yōu)恨化叼，滿建立最佳的將發(fā)酵工藝福。在服本研究中使，辭我們對單因馬素逐個優(yōu)化握，業(yè)最終達到對邊整個工藝的蔑優(yōu)化免。助我們采用建都立的中試發(fā)槐酵工藝蓮，尖三批攏重復(fù)試驗結(jié)咳果，鞏最終菌體密豐度均您超過壯A姜喂600n吸m呈25澆，狐菌體獲得量窄均達濕質(zhì)量我濃度拖50g農(nóng)/L極以上蹲，洗目的蛋白表館達量均響高于40%駝，比試管和籍搖瓶的表達暈水平略有提券高千，戀取得了較佳廁的結(jié)果。試方管和搖瓶培擴養(yǎng)條件的摸樓索對發(fā)酵的蚊成功很關(guān)鍵艇，奔其中諒,石碳源的選擇湊至關(guān)重要擔(dān)，解對于大腸桿欠菌座，鑒高濃度的葡銷萄糖將造成錘乙酸鹽的堆倍積色，叼降低工程菌情產(chǎn)量和表達但量垃。知因此掛,耍選用甘油作鄭為碳源較好鐘。由于各種瞧工程菌都有勇其自身的生攜長和表達規(guī)喪律，積發(fā)酵卻的份另一個重要陵因素就是外題源蛋白最佳擴的誘導(dǎo)時機朱。頑誘導(dǎo)后深，寸攜帶質(zhì)粒的荷細(xì)胞生長速亭率顯著降低晃，織而不帶質(zhì)粒蠢的細(xì)胞則不在受影響慰。詳因此嬌，棟提前誘導(dǎo)使粒菌體和目的倍蛋白的產(chǎn)量蓬降低劍，領(lǐng)同時也增加歸了染菌的機穗會謎。肥而誘導(dǎo)較晚白雖可以獲產(chǎn)陵量高的菌體海量員，磁但攔細(xì)菌已經(jīng)開氏始老化，其博生長和表達窩外芽源蛋白的毒能力會下降帥，同時表達榜外源蛋白消野耗的大量能鈴量會促使細(xì)堪菌的生長進勻入衰亡期，掙很容易導(dǎo)致陜?nèi)芫?。本文抗通過對誘導(dǎo)裂時機的優(yōu)化耽，使得整個害發(fā)酵過程在壇10h內(nèi)漢完成，既實何現(xiàn)了重組蛋漫白的高表達島、高產(chǎn)率，裹同時也降低蝕了成本。決補料的流加給方式直接影杜響著發(fā)酵的哪效果蕩。秤分批補料培歐養(yǎng)的特點是撈，兇在培養(yǎng)過程藍中不斷補充投培養(yǎng)基嗽，墾使菌體在較葉長時間里保塔持穩(wěn)定的生給長速率露，結(jié)從而達到高頁密度生長毒。堅但是在補料伸流加過程中退，蹈既不能加入睬得過快語，燦也不能加入露得過慢集。熟過慢則無法關(guān)滿足逐漸增含加的菌體生菜長需要魚，忍同時也使培紅養(yǎng)過程中產(chǎn)效生的抑制性榜副產(chǎn)物大量徹積累添；歡而過快則使牢攜帶目的蛋懸白的質(zhì)粒沒贈有充裕的時進間復(fù)制窄，圾降低目的蛋慧白的表達量撫；嗽而且快速的報細(xì)菌生長還執(zhí)易引發(fā)質(zhì)粒竊的不穩(wěn)定性躬。謹(jǐn)有報道表明鑰，替大腸桿菌通鑒過分批補料鬧發(fā)酵悠，味每升培養(yǎng)液墾最高可得到蓄50g寇干菌種溫，姓A株600n屑m木可達邀125咳左右把。排在我們實驗驗中以，嚇嚴(yán)格控制補滲料流加的速環(huán)度藍，刪在有效提高伴菌體產(chǎn)量的唐同時提高目誦的蛋白表達繡量悠。刃高密度發(fā)酵救技術(shù)能夠減飲少培養(yǎng)體積書,范縮短生長周決期圾,師減少設(shè)備投撞資并強化下肅游分離提取位,毒為工業(yè)化生故產(chǎn)降低成本憂。本文對重扒組旗DH5脹/格pKKH-婚BLyS鴨的高密度、凳高表達發(fā)酵此研究將可能旱對其它類型漠重組蛋白的毅發(fā)酵生產(chǎn)具御有一定的借趣鑒作用。坐Refer飄ences賞:薯Moore聲P量哪A,Be雞lvede溪reO,盤Orr皆A,跟etal士.嗓BLyS:找memb森erof韻the掙tumor殘necr喊osis陰facto愉rfam奸ilya伴ndB勇lymph等ocyte冊stim條ulato頃r倒[J]令.蝦屬Scien窯ce氏,利1999稈,宣285(5飾425)裂:浸260-匆26馬3.注Hunti售ngton浮N葡涼D扇,彎Tomio桐kaR刻,膀Clava峰rino執(zhí)C澡,英etal星.繼ABAF迎Fant校agoni逗stsu張ppres殖sese仁xperi敏menta侍laut凡oimmu糊neen慘cepha爺lomye幣litis根byt粉arget撐ingc拘ell-m藍ediat煌edan產(chǎn)dhum扔oral基immun豆eres板ponse幟s胸[J].受I艘ntIm富munol礦,200筋6,18碑(10):嶺1473疤-1485繁.伯Zhang紙J,R糞oschk偽eV,臟Baker躁K符杜P,拌etal叨.Cut浴ting柱edge:池aro符lefo刺rBl好ympho跪cyte素stimu眼lator脅ins怕ystem煙iclu梁puse勸rythe寒matos碼us郵[J]點.英絮JImm發(fā)unol尋,虹2001券,垃166(1狀):嘗般6-10.帶Cheem碎aG林企S,Ro婦