常用樣品分析方法-可溶性糖、淀粉、酚類和葉綠素含量的測定

常用樣品分析方一一可溶性糖、淀粉、酚類和葉綠素含量測定一、可溶性糖和淀粉含量的測定方法可溶性糖和淀粉含量的測定方法為硫酸---蒽酮比色法。測定原理為：淀粉是由葡萄糖殘基組成的一類多糖物質，在酸性條件下加熱可使其水解成單糖葡萄糖，然后在濃硫酸的作用下，單糖葡萄糖可以脫水生成糠醛或羥甲基糠醛類化合物，然后利用蒽酮試劑與糠醛化合物反應生成藍綠色糠醛衍生物，在一定范圍內(nèi)，顏色的深淺與糖的含量成正比，即可比色進行定量測定。測定步驟如下：標準曲線的制作1.1100ug/ml葡萄糖標準液的配制將分析純葡萄糖在80°C下烘干，用0.0001g分析天平精確稱取1g葡萄糖，轉入50ml燒杯中，然后加入少量蒸餾水攪拌溶解，接著將溶解液轉入100ml容量瓶，然后再往燒杯中加入少量蒸餾水潤洗，最后將潤洗液轉入上述100ml容量瓶，重復上述潤洗操作三次（注意溶解液和三次潤洗液的體積總和控制在80ml以內(nèi)，以免超過容量瓶量程），然后定容至容量瓶刻度線，塞上塞子，上下顛倒5次以，得到10mg/ml的葡萄糖溶液。用移液槍吸取1ml葡萄糖標準液轉入100ml容量瓶，定容至刻度線，所得溶液即為100ug/ml的葡萄糖標準溶液。1.2蒽酮乙酸乙酯試劑的配制用0.0001g分析天平精確稱取分析純蒽酮1g溶于50ml乙酸乙酯試劑中，貯藏于棕色瓶中，置于黑暗中保存。1.3標準曲線制作編號0123456789101112100ug/ml葡萄糖溶液(ml)00.20.40.60.81.01.2蒸餾水ml21.81.61.41.21.00.8稀釋液葡萄糖濃度(ug/ml)0102030405060注：12為一個重復，以此類推。取13支20ml試管并分別編號為0-12，按照上表加好相應體積的葡萄糖溶液與蒸餾水并混勻后，再依次向每支試管中分別加入0.5ml蒽酮乙酸乙酯試劑和5ml濃硫酸，加入濃硫酸時要緩慢以免反應過快液體飛濺，然后小心震蕩，將試管放入沸水浴(100°C)1min，取出后自然冷卻至室溫，以編號為0的試管為空白對照，于620nm波長處測定吸光值，然后以葡萄糖濃度為橫坐標，吸光值(OD值)為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線，并擬合出方程(R2=0.99)。本研究所有指標測量所用分光光度計均為島津UV2600(SHIMADZUUV2600)。樣品可溶性糖及淀粉含量測定a.可溶性糖的提?。河?.0001g分析天平準確稱取20mg干燥待測樣品粉末于10ml離心管中，加入80%乙醇5ml，然后于80C水浴鍋中提取30min后取出，冷卻至室溫后放入離心機中(2000r，10min)，然后吸取上清液至另一干凈的10ml離心管中，并加蒸餾水容至10ml，此溶液即為可溶性糖提取液。淀粉的提?。合騛中10ml離心管的殘渣中加入1ml蒸餾水，搖勻后置于沸水中15min進行糊化，取出冷卻至室溫，再加入3ml9.2mol/L高氯酸（約取78ml高氯酸，加蒸餾水定容至100ml），攪拌均勻，提取15min后吸出提取液加蒸餾水定容至10ml，此溶液即為淀粉提取液。顯色反應：分別吸取上述a,b步驟中樣品提取液0.5ml于20ml具塞玻璃試管中，再加入蒸餾水1.5ml蒽酮乙酸乙酯試劑0.5ml、濃硫酸5ml，塞上塞子后充分搖勻，將試管放入沸水浴1min?？瞻讓φ沼?ml蒸餾水和0.5ml蒽酮試劑反應液，再緩緩加入5ml濃硫酸，然后一起置于沸水浴1min。取出自然冷卻到室溫，然后于620nm波長下測定吸光值樣品可溶性糖及淀粉含量的計算可溶性糖含量（%）二依據(jù)標準曲線計算所得可溶性糖含量（岫X稀釋倍數(shù)+儂。。x100%樣品重星（mg）（步驟2a所測吸光值可用于計算樣品中可溶性糖含量）淀粉含量（ug）=還原糖（ug）x0.9（步驟2b所測吸光值可用于計算由淀粉還原而來的可溶性糖含量）樣品中淀粉含量百分比（％）=「’心35藍二、總酚含量的測定福林酚法測定植物葉片中總酚含量。此方法的化學原理是：多酚與FoLin-CiocaLteu試劑發(fā)生特異性反應，反應產(chǎn)物對特定波長的有最大吸收，且吸光值與多酚的量在一定濃度范圍內(nèi)成線性關系。先以標準酚類物質建立標準曲線，再測定待測樣品吸光值，據(jù)此可求出待測樣品中多酚的含量。測定步驟如下：1、標準曲線的制作1mg/ml單寧酸標準液的配制用0.0001g分析天平準確稱取0.1g單寧酸（Sigma公司，美國）放入燒杯中并加入約30ml純水，充分攪拌使單寧酸溶解，然后把溶液轉移到100ml容量瓶，再將燒杯用純水潤洗三次（潤洗液體積總和注意不要高于50ml以免超出容量瓶量程），并把全部潤洗液轉入上述容量瓶中，定容，塞上塞子并上下顛倒五次搖勻，所得溶液即1mg/ml的單寧酸標準液，備用。7.5%碳酸鈉溶液的配制用0.0001g分析天平準確稱取7.5g碳酸鈉粉末放入燒杯中，并加入30ml左右的蒸餾水，然后用玻璃棒充分攪拌使其溶解，將溶解液轉入100ml容量瓶內(nèi)，然后再用蒸餾水將燒杯潤洗三次（注意控制三次潤洗液體積總和在50ml以內(nèi)，以免超出容量瓶量程），并將全部潤洗液轉入上述100ml容量瓶，充分震蕩后定容，塞上塞子并上下顛倒五次使其均勻，備用。1.3標準曲線制作編號1234567單寧酸標準液（ml）00.010.020.030.040.050.06蒸餾水（ml）21.991.981.971.961.951.94稀釋液單寧酸濃度051015202530（ug/ml）取7支具塞玻璃試管分別編號1-7,按照上表依次加入對應體積的單寧酸標準液和蒸餾水，搖勻后立即往每支試管中加入0.5ml福林酚試劑和1.5ml7.5%碳酸鈉溶液。塞上塞子搖勻后放置于80°C水浴鍋中水浴十分鐘，以編號為0的試管為空白對照，在750nm波長下測定吸光值，并以單寧酸濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制單寧酸標準曲線，并擬合出方程（R2=0.99）。2樣品總酚含量的測定2.1植物葉片中總酚的提取將植物葉片放置于40C烘箱中三天至恒重，然后置于-20C冰箱中冷凍保存。測定總酚前再于40C下烘干半天，然后在研缽中研磨成粉末。用0.0001g分析天平準確稱取8-10mg樣品粉末放于2mlEppendorf管中，加入1.5ml80%的丙酮，然后將Eppendorf管平放在紙盒內(nèi)，黑暗提取6小時后，3500r/min離心10分鐘，將上清液轉入另一個2mlEppendorf管，保存于4C冰箱。殘余物再次加入1ml80%丙酮，黑暗提取6小時，3500r/min離心10min后合并兩次的上清液，即為提取液（該提取液包含總酚類及其他一些在750nm波長下能夠顯色的物質）。2.2PVPP空白的制作取上述提取液1ml于已經(jīng)加入35mgPVPP(polyvinylpolypyrrolidone)(Sigma公司，美國)的2mlEppendorf管中作PVPP空白(PVPP在酸性或者中性條件下才有效結合為酚類為不溶)，在4°C冰箱中保存過夜。2.3顯色反應取兩支試管，分別加入0.5ml非PVPP提取液和PVPP空白液，再分別加入1.5ml蒸餾水，然后立刻加入0.5ml的Folin-Ciocalteau試劑(鼎國，中國)和1.5ml7.5%碳酸鈉溶液，在80C水浴鍋中顯色10分鐘，取出，冷卻至室溫，以蒸餾水為空白，用UV2600分光光度計(SHIMADZU,Japan)在750nm處測定顯色液的吸光值。用非PVPP提取液的吸光度值減去PVPP空白吸光值既為樣品中總酚含量的吸光值。然后將吸光值代入單寧酸標準曲線，求出樣品中總酚的含量。三、葉綠素含量的測定色素提取液的制備：取新鮮植株葉片3-5片，洗凈擦干后去除主葉脈，剪碎，然后用0.0001g分析天平準確稱取0.1g新鮮葉片放入10mL離心管中，再加入10ml80%丙酮放置于不透光的盒子里黑暗提取36-48h至色素全部被提出，葉片組織呈白色。然后低速離心1min，小心抽取上清液即為色素提取液，待測。測定吸光度：先將比色皿用蒸餾水潤洗兩次，然后倒入少量色素提取液潤洗一次，再將適量色素提取液小心倒入比色皿中，倒入的提取液高度至少為比色皿高度的2/3，然后用擦鏡紙將比色皿外壁及底部擦干凈，放入UV2600分光光度計中。將分光光度計波長設置為645nm和663nm兩個波長，用80%丙酮做空白對照進行調零，然后分別測定色素提取液在上述兩個波長下的吸光度。葉綠素含量計算：將提取液在645nm和663nm波長處測得的吸光值帶入下列公式中，即可算得葉綠素a和葉