第章色譜分離技術

在色譜法中，表面積較大的固體或附著在固體上且不運動的液體，靜止不動的一相（稱為固定相

；自上而下運動的一相（一般是氣體或液體）稱為流動相。二、色譜分離系統(tǒng)的組成目前一頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點根據(jù)分離時一次進樣量的多少，色譜分離的規(guī)?？煞譃樯V分析規(guī)模(小于10mg)、半制備(10~50mg)、制備規(guī)模(0.1~10g)和工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模(>10g)。色譜分離的規(guī)模小，但產(chǎn)值高。三、色譜分離技術的分類目前二頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點超臨界流體色譜—流動相是在接近它的臨界溫度和壓力下工作的液體三、色譜法的分類根據(jù)流動相的相態(tài)不同:氣相色譜—以氣體作流動相液相色譜—以液體作流動相目前三頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點—固定相涂敷在玻璃或金屬板上—薄層色譜三、色譜法的分類根據(jù)固定相的附著方式分類

—液體固定相涂在紙上—紙色譜(平板色譜)—固定相裝在圓柱管中—柱色譜目前四頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點三、色譜法的分類吸附色譜法分配色譜法離子交換色譜法凝膠色譜法親和色譜法按分離機理不同，可分為：目前五頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點三、色譜法的分類根據(jù)操作壓力的不同分類：低壓色譜：操作壓力<0.5MPa中壓色譜：操作壓力0.5～4.0MPa高壓色譜：操作壓力4.0～40MPa目前六頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點三、色譜法的分類根據(jù)操作方法不同，色譜法可分為：前沿分析法（迎頭法）置換展開法（頂替法）洗脫展開法（洗脫分析法）目前七頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點

色譜法的缺點是處理量小、操作周期長、不能連續(xù)操作。四、色譜法的特點(1)分離效果高(2)應用范圍廣(3)選擇性強(4)設備簡單目前八頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點吸附色譜法吸附色譜法(adsorptionchromatography，AC)是靠溶質與吸附劑之間的分子吸附力的差異而分離的方法。吸附色譜的固定相為固體吸附劑，如有較強極性硅膠、中等極性氧化鋁、非極性炭及特殊作用的分子篩等。目前九頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點吸附色譜是靠溶質與吸附劑之間的分子吸附力的差異而分離的方法。吸附力主要是范德華力，有時也可能形成氫鍵或化學鍵。吸附法的關鍵是選擇吸附劑和展開劑。1.基本原理目前十頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點吸附色譜分離過程示意圖目前十一頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點

下列三個化合物用硅膠吸附色譜分離，以石油醚-乙酸乙酯（95：5）洗脫，判斷三者流出色譜柱先后順序。

ABC由先到后：C→B→A

舉例：目前十二頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點平衡系數(shù)（分配系數(shù)、吸附系數(shù)、選擇性系數(shù)）K=cs/cm

cs—固定相中的濃度；cm—流動相中的濃度影響K的因素：被分離物質本身的性質、固定相和流動相的性質、色譜柱的操作溫度。K差異越大，色譜分離效果越理想。目前十三頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點阻滯因數(shù)（比移值）斑點到原點的距離Rf值=————————溶劑前沿到原點距離目前十四頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點阻滯因數(shù)①0≤Rf≤1Rf越大，溶質隨流動相移動快，被洗脫速率也就越快。②當Rf=1，此種溶質不溶于固定相，隨流動相以同樣的速率移動。③當Rf=0，此種溶質不溶于流動相，而被吸附在固定相上。目前十五頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點選用吸附色譜法分離化合物時，必須首先了解被分離化合物的性質，然后選擇合適的吸附劑和展開劑。被分離化合物、吸附劑和展開劑三者關系配合恰當才能得到較好的分離效果。2.吸附劑與展開劑目前十六頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點薄層色譜法選擇的主要吸附劑為氧化鋁、硅膠和聚酰胺。色譜用的吸附劑要求一定的形狀與粒度范圍，不同吸附劑用于分離不同類型的化合物。吸附劑還必須具有一定的活度，活度太高或過低都不能使混合物各組分得到有效的分離。（1）薄層色譜的吸附劑與展開劑目前十七頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點展開劑在吸附色譜中，組分的展開過程涉及吸附劑、被分離化合物和溶劑三種之間的相互競爭。其基本原則主要有兩個：①展開劑對被分離組分有一定的解吸能力，但又不能太大。②展開劑應該對被分離的物質有一定的溶解度。目前十八頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點展開劑常用溶劑極性次序為：己烷<環(huán)己烷<四氯化碳<甲苯<苯<氯仿<乙醚<乙酸乙酯<丙酮<正丙醇<乙醇<甲醇<水<冰醋酸目前十九頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點一般地說，所選的吸附劑應有最大的比表面積和足夠的吸附能力，它對欲分離的不同物質應該有不同的解吸能力；與洗脫劑、溶劑及樣品組分不會發(fā)生化學反應；還要求所選的吸附劑顆粒均勻，在操作過程中不會破裂。（2）柱色譜的吸附劑與洗脫劑吸附劑的選擇目前二十頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點洗脫劑的選擇原則上要求所選的洗脫劑純度合格，與樣品和吸附劑不起化學反應，對樣品的溶解度大，粘度小，容易流動，容易與洗脫的組分分開。目前二十一頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點洗脫劑的選擇常用的洗脫劑有飽和的碳氫化合物、醇、酚、酮、醚、鹵代烷、有機酸等。選擇吸附劑時，可根據(jù)樣品的溶解度、吸附劑的種類、溶劑極性等方面考慮，極性大的洗脫能力大，因此可先用極性小的作洗脫劑，使組分容易被吸附，然后換用極性大的溶劑作洗脫劑，使組分容易從吸附柱中洗出。目前二十二頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點3.影響吸附分離的因素①和功能基極性有關。極性增加的順序：烷烴、不飽和烴、醚、酯、酮、醛、醇、酚和羧酸，同一類化合物極性基團越多，極性越大。②小分子的化合物比大分子的化合物極性大。③和某些細微結構有關，如氫鍵、異構體等。目前二十三頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點二、吸附色譜分離操作及其設備1.薄層吸附色譜分離操作及設備（1）薄層色譜板的制備（2）點樣（3）展開（4）顯色目前二十四頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點①干法鋪板(軟板制備)多用于氧化鋁薄層板的制備。在一塊邊緣整齊的玻璃板上，鋪上適量的氧化鋁，取一合適物品頂住玻璃板右端。兩手緊握鋪板玻璃棒的邊緣，按箭頭方向輕輕拉過，一塊邊緣整齊、薄厚均勻的氧化鋁薄層即成。(1)薄層色譜板的制備目前二十五頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點干法制板目前二十六頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點可用于硅膠、聚酰胺、氧化鋁等薄層板的制備，但最常用的是硅膠硬板。為使制成的硅膠板堅硬，要加入黏合劑，用硫酸鈣為粘合劑鋪成的板稱為硅膠G板，用羧甲基纖維素鈉作黏合劑鋪成的板為硅膠-CMC板。(2)濕法鋪板(硬板制備)聚酰胺膜多為外購商品。目前二十七頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點2)點樣

用一根玻璃毛細管或點樣器，吸取樣品溶液，在距薄層一端約2cm的起始線上點樣，每點間距約2cm，樣品點直徑一般小于0.5cm。注意點樣量要適中，太少時，某些成分不能被檢出；太多時容易產(chǎn)生拖尾現(xiàn)象，即每個斑點都拉得很長，互相重疊，不能分開。目前二十八頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點3）展開展開操作需要在密閉的容器中進行。配好展開劑，將展開劑（一般2～10mL）倒入層析缸。放置一定時間，待層析缸被展開劑飽和后，再迅速將薄層板放入，密閉，展開即開始，這樣可防止邊緣效應產(chǎn)生。另外，注意在薄板放入層析缸時，切勿使溶劑浸沒樣品點。當溶劑移動到接近薄層上端邊緣時，取出薄板，劃出溶劑前沿。目前二十九頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點展開方式可分三類：(1)上行展開法和下行展開法最常用的展開法是上行展開，就是使展開劑從下往上爬行展開；下行展開是使展開劑由上向下流動。由于受重力作用，下行展開移動較快。(2)單次展開法和多次展開法(3)單向展開法和雙向展開法

目前三十頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點薄層板玻璃板上涂吸附劑層SiO2Al2O3上行法薄層板層析缸展開劑層析缸展開劑濾紙條下行法薄層板薄層色譜法(Thin

Layer

Chromatography)目前三十一頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點4)顯色顯色也稱定位，即用某種方法使經(jīng)色譜展開后的混合物斑點呈現(xiàn)顏色，以便觀察其位置(1)紫外線照射法(4)生物顯跡法(2)噴霧顯色法(3)碘蒸汽顯色法目前三十二頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點2.吸附柱色譜分離操作及設備洗脫液樣品填充物分部收集玻璃柱目前三十三頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點色譜柱通常用玻璃柱。工業(yè)上大型色譜柱可以用金屬制造。柱的入口端應該有進料分步器，使進入柱內的流動相分布均勻。有時也可在色譜柱頂端加一層多孔的尼龍圓片或保持一段緩沖液層。柱的底部可以用玻璃棉，也可以用砂芯玻璃板或玻璃細孔板支持固定相，最簡單的也可以用鋪有濾布的橡皮塞。(1)色譜柱的選擇目前三十四頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點目前三十五頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點設計柱長時需考慮下列幾點：(3)柱越長，長度和內徑比越大，就越難得到均勻的填裝。大多數(shù)色譜柱的長度25cm左右。(1)柱的最小長度取決于所要達到的分離程度(2)較大的柱直徑需要較長的色譜柱。目前三十六頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點①干法裝柱在柱下端加少許棉花或玻璃棉，再輕輕地撒上一層5mm厚的干凈砂粒，或放置大小合適的玻璃砂芯。打開下口，然后將吸附劑經(jīng)漏斗緩緩加入柱中，同時輕輕敲動色譜柱，使吸附劑松緊一致，最后，將色譜柱用最初洗脫劑小心沿壁加入，至剛好覆蓋吸附劑頂端平面，關緊下口活塞。(2)裝柱目前三十七頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點②濕法裝柱先在吸附劑中加入合適量的色譜最初用洗脫劑調成稀糊狀，再把放好棉花、沙子或合適大小的玻璃砂芯的色譜柱下口打開，然后徐徐將制好的糊漿灌入柱子。注意整個操作要慢，不要將氣泡壓入吸附劑中，而且要始終保持吸附劑上有溶劑，最后讓吸附劑自然下沉。當洗脫劑剛好覆蓋吸附劑平面時，關緊下口活塞。目前三十八頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點(3)上樣①濕法上樣把被分離的物質溶在少量色譜最初用的洗脫劑中，小心加在吸附劑上層，注意保持吸附劑上表面仍為一水平面，打開下口，待溶液面正好與吸附劑上表面一致時，在上面撒一層細砂，關緊柱活塞。目前三十九頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點②干法上樣可選用一種對其溶解度大而且沸點低的溶劑，取盡可能少的溶劑將其溶解。在溶液中加入少量吸附劑，拌勻，揮干溶劑，研磨使之成松散均勻的粉末，輕輕撒在色譜柱吸附劑上面，再撒一層細砂。目前四十頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點(4)洗脫在裝好吸附劑的色譜柱中緩緩加入洗脫劑，進行剃度洗脫，各組分先后被洗出。若用50g吸附劑，一般每份洗脫液量常為50mL?，F(xiàn)多采用薄層色譜或紙色譜定性檢查各流分中的化學成分組成。含單一色點的部分用合適的溶劑析晶；仍為混合物的部分進一步尋找分離方法再進行分離。目前四十一頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點注意：整個操作過程必須注意不使吸附柱表面的溶液流干。應控制洗脫液的流速。應盡量在短時間內完成一個柱層析的分離。目前四十二頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點洗脫操作的方式可分為：前沿分析法（迎頭法）：將混合物溶液連續(xù)通過色譜柱，只有吸附力量最弱的組分最先自柱中流出，其他各組分不能達到分離。置換展開法（頂替法）：利用一種吸附力比各被組分都強的溶劑作為洗脫劑，替代結合在固定相上的各組分。處理量大，且各組分分層清楚。洗脫展開法（洗脫分析法）：先將混合物盡量濃縮，引入色譜柱上部，然后用溶劑洗脫，使各組分分離完全。應用最廣。目前四十三頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點三、吸附色譜法的應用主要用于具有不同官能團或具有相同官能團但數(shù)目不同的極性化合物及異構體等生物小分子物質的分離分析。目前四十四頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點離子交換色譜法離子交換色譜法(ionexchangechromatography，IEC)是利用離子交換樹脂為固定相，以適宜的溶劑作為移動相，使溶質按它們的離子交換親和力的不同而得到分離的方法。目前四十五頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點一、基本原理離子交換色譜是指帶電物質因電荷力作用而在固定相與流動相之間分配得以相互分離的技術。蛋白質等兩性電解質。當pH<pI時，蛋白質帶凈正電荷；當pH>pI時，蛋白質帶凈負電荷。由于各種蛋白質等生物大分子的等電點不同，可以通過改變溶液的pH和離子強度來影響它們與離子交換樹脂的吸附作用，從而將它們相互分離開來。目前四十六頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點離子交換的基本過程：(1)初始穩(wěn)定狀態(tài)(2)離子交換過程(3)洗脫過程(4)介質的再生過程目前四十七頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點abcde離子交換的基本過程：目前四十八頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點

離子交換樹脂是一種不溶于酸、堿和有機溶劑的固體高分子聚合物。它具有網(wǎng)狀立體結構并含有活性基團，能與溶劑中其他帶電粒子進行離子交換或吸著。二、離子交換樹脂1.定義目前四十九頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點交換樹脂表面目前五十頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點二、離子交換樹脂的分類

1.按樹脂骨架的主要成分(1)聚苯乙烯型樹脂由苯乙烯(母體)和二乙烯苯(交聯(lián)劑)的共聚物作為骨架，再引入活性基團(2)丙烯酸樹脂由丙烯酸酯類和甲基丙烯酸酯類及其它烯屬單體共聚制成的樹脂。(3)多乙烯多胺-環(huán)氧氯苯烷樹脂由多乙烯胺與環(huán)氧氯苯烷的共聚物作為骨架。(4)酚-醛型樹脂主要由水楊酸、苯酚和甲醛縮聚而成，水楊酸和甲醛形成線狀結構，苯酚作為交聯(lián)劑。目前五十一頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點2.按樹脂骨架的物理結構(1)凝膠型樹脂(2)大網(wǎng)格樹脂(3)均孔樹脂目前五十二頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點1)陽離子交換樹脂活性基團為酸性，對陽離子具有交換能力。3.按活性基團分類(1)強酸性陽離子交換樹脂(2)弱酸性陽離子交換樹脂目前五十三頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點2)陰離子交換樹脂活性基團為堿性，對陰離子具有交換能力。3.按活性基團分類(1)強堿性陰離子交換樹脂(2)弱堿性陰離子交換樹脂目前五十四頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點1977年，我國原石油化工部頒布了離子交換樹脂的命名法，規(guī)定離子交換樹脂的型號由三位阿拉伯數(shù)字組成：第一位數(shù)字代表產(chǎn)品的分類；第二位數(shù)字代表骨架；第三位數(shù)字微順序號。分類代號和骨架代號都分成7種，分別以0～6表示。

二、離子交換樹脂的命名目前五十五頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點代號分類名稱骨架名稱0強酸性苯乙烯系1弱酸性丙烯酸系2強堿性酚醛系3弱堿性環(huán)氧系4螯合性乙烯吡啶系5兩性脲醛系6氧化還原性氯乙烯系目前五十六頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點1.交聯(lián)度交聯(lián)度表示離子交換樹脂中交聯(lián)劑的含量，例如：聚苯乙烯型樹脂是由二乙烯苯將鏈狀分子聯(lián)成立體網(wǎng)狀結構的，而乙烯苯稱為交聯(lián)劑。樹脂中交聯(lián)劑的質量分數(shù)稱為交聯(lián)度。聚苯乙烯型交換樹脂含有8%的二乙烯苯，則此樹脂的交聯(lián)度為8%。一般樹脂的交聯(lián)度為8%～12%。

三、離子交換樹脂的理化性能目前五十七頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點2.交換容量：

交換容量是指每克干燥離子交換樹脂或每毫升完全溶脹的離子交換樹脂所能吸收的一價離子的毫摩爾數(shù)，以mmol/g表示，是表征樹脂離子交換能力的主要參數(shù)。交換容量的大小，取決于網(wǎng)狀結構中活性基團的數(shù)目，含有活性基團越多，交換容量也越大。但交換容量太大，活性基團太多，樹脂不穩(wěn)定。目前五十八頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點粒度是樹脂顆粒在溶漲后的大小，色譜用50～100目樹脂，一般提取純化用20～60目(0.25~0.84mm)樹脂則可。粒度小的樹脂因表面大，效率高；粒度過小，堆積密度大，容易產(chǎn)生阻塞；粒度過大又會導致強度下降、裝填量小、內擴散時間延長，不利于有機大分子的交換。所以，粒度大小應根據(jù)具體需要選擇。一般樹脂為球形，這樣可減少流體阻力。3.粒度和形狀目前五十九頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點強酸（或強堿）性離子交換劑的滴定曲線開始是水平的，到某一點突然升高（或降低），表明在該點交換劑上的離子交換基團已被堿（或酸）完全飽和；弱酸（或弱堿）性離子交換劑的滴定曲線逐漸上升（或下降），無水平部分。利用滴定曲線的轉折點，可估算離子交換劑的交換容量，而由轉折點的數(shù)目，可推算不同離子交換基團的數(shù)目。

4.滴定曲線目前六十頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點5.穩(wěn)定性樹脂應有較好的化學穩(wěn)定性，不容易分解破壞，不與酸、堿起作用。一般地說，陽離子交換樹脂比陰離子交換樹脂穩(wěn)定性好。交聯(lián)度小的穩(wěn)定性好。樹脂一般可反復使用上千次，穩(wěn)定性僅成為此要的考慮因素。但含苯酚的硫酸型樹脂及胺型樹脂不易與強強堿長時間接觸。目前六十一頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點6．膨脹性(膨脹度)干樹脂浸在水溶液或有機溶劑中時，活性離子因熱運動可在樹脂空隙的一定距離內運動，同時由于存在著滲透壓使外部水分滲入內部促使樹脂空隙擴大而體積膨脹。測定膨脹前后樹脂的體積比，可得出膨脹度。在設計離子交換罐時，樹脂的裝填系數(shù)應以工藝過程中膨脹度最大時的樹脂體積為上限參數(shù)，以免裝量過度或設備利用率降低。目前六十二頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點二、離子交換樹脂的性質和種類三、離子交換樹脂的選擇依據(jù)離子交換交換色譜常用較細的樹脂(50~100目)。但一般樹脂的粒度較大，因此需要將樹脂粉碎、過篩后使用，過篩分干法和濕法兩種。干法較簡單，但實際使用時粒度仍不均勻。利用水力浮選法，將樹脂分級比較方便。改變水的流速就可得到不同粒度的樹脂。目前六十三頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點三、離子交換樹脂的選擇依據(jù)樹脂的骨架結構。目的分子的大小介質上帶電功能基團功能基團的強弱目前六十四頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點四、流動相的選擇依據(jù)離子交換色譜的流動相必須是有一定離子強度的并且對pH有一定緩沖能力的溶液。使用緩沖液可穩(wěn)定流動相的pH，使之在層析過程中不致發(fā)生明顯變化，同時還可以穩(wěn)定目的分子上的電荷量，保證層析結果的重現(xiàn)性。要使目的分子帶有電荷并以適當?shù)膹姸冉Y合到離子交換介質上，需要選擇一合適的吸附pH。對于陰離子交換介質，吸附pH至少應高于目的分子等電點一個pH單位。目前六十五頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點四、流動相的選擇依據(jù)吸附階段應選擇允許目的分子與介質結構達到最高的離子強度。而洗脫時要選擇可使目的分子與介質解吸的最低離子強度。這就定出了洗脫液離子強度的剃度起止范圍。在介質再生之前往往還需用第三種離子強度更高的緩沖液流洗柱床以徹底消除可能殘留的牢固吸附雜質。在大部分情況下，吸附階段溶液鹽濃度至少應在10mmol/L以上。目前六十六頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點五、操作方法1.離子交換劑的處理2.裝柱及上樣裝柱主要是防止出現(xiàn)氣泡和分層，裝填要均勻。防止產(chǎn)生氣泡和分層的方法是裝柱時柱內先保持一定高度的起始洗脫液(一般為柱高的1/3)，加入樹脂時使樹脂借水的浮力慢慢自然沉降。裝柱完畢后，用水或緩沖液平衡到所需的條件，如特定的pH、離子強度等。目前六十七頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點上樣加壓法是采用打氣入柱的方式進行加壓，可用一個裝有樣品的分液漏斗與柱用橡皮塞連接，分液漏斗上端串有壓力劑并經(jīng)緩沖瓶與打氣管相連，當達到所需壓力時就將打氣管夾緊。減壓法是在柱的排出口增設抽氣裝置，工業(yè)上多采用此法。目前六十八頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點3.洗脫分離不同的物質選用不同的洗脫劑。原則是用一種更活潑的離子把交換在樹脂上的物質再交換出來。常用的洗脫劑為酸類、堿類或鹽類溶液，改變整個系統(tǒng)的酸堿度和離子強度，以使交換物質的交換性能發(fā)生變化，己交換上的物質就逐漸被洗脫下來。為了提高分辨率，常采用剃度洗脫法。目前六十九頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點4凝膠色譜法凝膠色譜是基于分子大小不同而進行分離的一種分離技術，又稱之凝膠過濾、凝膠滲透過濾、分子篩過濾、阻滯擴散層析或排阻層析。它具有一系列的優(yōu)點：操作方便、不會使物質變性、適用于不穩(wěn)定的化合物、凝膠不用再生、可反復使用。缺點：分離速度較慢。目前七十頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點一、基本原理小分子物質除了可在凝膠顆粒間隙中擴散外，還可以進入凝膠顆粒的微孔中，即進入凝膠相內，在向下移動的過程中，從一個凝膠內擴散到顆粒間隙后再進入另一凝膠顆粒，如此不斷地進入和擴散，小分子物質的下移速度落后于大分子物質，從而使樣品中分子大的先流出色譜柱，中等分子的后流出，分子最小的最后流出，這種現(xiàn)象叫分子篩效應。目前七十一頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點目前七十二頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點凝膠過濾層析過程示意圖小分子大分子凝膠基質凝膠珠目前七十三頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點二、凝膠過濾介質理想的凝膠過濾介質具有高物理強度及化學穩(wěn)定性，能夠耐受高溫高壓和強酸強堿，具有高化學惰性，內孔徑分布范圍窄，珠粒顆粒大小均一度高。目前，常用的有葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等。目前七十四頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點1.葡聚糖凝膠葡聚糖凝膠是應用最廣泛的一類凝膠，國外商品名為Sephadex。它由葡聚糖Dextran交聯(lián)而得。交聯(lián)劑在原料總質量中所占的百分數(shù)叫交聯(lián)度。交聯(lián)度越大，網(wǎng)狀結構越緊密，吸水量越小，吸水量越小，吸水后體積膨脹越少；反之，交聯(lián)度越小，網(wǎng)狀結構越疏松，吸收量越多，吸水后體積膨脹越大。目前七十五頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點2.瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠來源于一種海藻多糖瓊脂，是一種天然凝膠，不是共價交聯(lián)，是以氫鍵交聯(lián)的。它與葡聚糖不同，孔隙度是以改變瓊脂糖濃度而達到的。瓊脂糖凝膠的化學穩(wěn)定性不如葡聚糖凝膠。用瓊脂糖凝膠進行分離操作的適宜工作條件是在pH為4.5～9，溫度0～40℃。瓊脂糖凝膠對硼酸鹽有吸附作用，不能用硼酸緩沖液。目前七十六頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點3.聚丙烯酰胺凝膠是一種人工合成凝膠，是以丙烯酰胺為單位，由甲叉雙丙烯酰胺交聯(lián)成的。其穩(wěn)定性比葡聚糖凝膠好。洗脫時不會有凝膠物質被洗脫下來。在pH2~11范圍穩(wěn)定。缺點是不耐酸，遇酸時酰胺鍵會水解成羧基，使凝膠帶有一定的離子交換基團。目前七十七頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點4.疏水性凝膠常用的疏水凝膠為聚甲基丙烯酸酯凝膠或以二乙烯苯為交聯(lián)劑的聚苯乙烯(如StyrogelBio-Beads-S)凝膠?！癝tyrogel”商品有11種型號，具有大網(wǎng)孔結構，可用于分離分子量1600到40，000，000的生物大分子，適用于有機多聚物，分子量測定和脂溶性天然物的分級，凝膠機械強度好。目前七十八頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點5.多孔玻璃珠多孔玻璃珠的化學和物理穩(wěn)定性號，機械強度高，不但抵御酶及微生物的作用，還能夠耐受高溫滅菌和較強烈的反應條件。缺點是親水性不強，對蛋白質尤其是堿性蛋白質有非特性性吸附，而且可供連接的化學活性基團也少。目前七十九頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點6.其他載體由聚丙稀酰胺和瓊脂糖混合組成的載體已投入應用。它的特點是載體既有羥基又有酰胺基，并且都能單獨與配基使用。但這類載體不能接觸強堿，為了避免酰胺水解，使用溫度不能超過40℃。目前八十頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點三、凝膠過濾介質的選擇1.分離范圍2.分辨率3.穩(wěn)定性目前八十一頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點四、操作方法1.凝膠的預處理市售凝膠必須經(jīng)過充分溶漲后才能使用，如果溶漲不充分，則裝柱后凝膠繼續(xù)溶漲，造成填充層不均勻，影響分離效果。在燒杯中將干燥凝膠加水或緩沖液，攪拌、靜置、傾去上層混懸液、除去過細的粒子。如此反復多次，直至上層澄清為止。目前八十二頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點2.層析柱的選擇層析柱的體積和高徑比與層析分離效果的關系相當密切。層析柱的直徑大小不影響分離度，樣品用量大，可加大柱的直徑。分離度取決于柱高，為分離不同組分，凝膠柱床必須有適宜的高度，分離度與柱高的平方根相關，但由于軟凝膠柱過高擠壓變形阻塞。目前八十三頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點3.凝膠柱的裝填空柱中應留1/5的水或溶劑。所用凝膠必須是經(jīng)過充分溶漲的。開始進膠后應當打開柱端閥門并保持一定流速，太快的流速往往造成凝膠板結，對分離不利。進膠過程必須連續(xù)、均勻，不要中斷，并在不斷攪拌下使膠均勻沉降。為此，層析柱要始終保持垂直。凝膠懸液濃度也需控制，過稀和過濃都會產(chǎn)生不利影響。目前八十四頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點4.樣品處理和加樣分離蛋白質樣品的體積為凝膠床的1-4％（一般約0.5-2ml），進行分族分離時樣品液可為凝膠床的10％，在蛋白質溶液除鹽時，樣品可達凝膠床的20-30％。分級分離樣品體積要小，使樣品層盡可能窄，洗脫出的峰形較好。目前八十五頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點4.樣品處理和加樣加樣時盡量減少樣品的稀釋及凝膠床面的攪動。(1)直接將樣品加到層析床表面(2)利用兩種液體相對密度不同而分層目前八十六頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點5.洗脫與收集為了防止柱床體積的變化，造成流速降低及重復性下降，整個洗脫過程中始終保持一定的操作壓，并不超限是很必要的。流速不宜太快且要穩(wěn)定。洗脫液的成分也不應改變，以防凝膠顆粒的脹縮引起柱床體積變化或流速改變。目前八十七頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點6.凝膠的保存(1)干法(2)濕法(3)半縮法目前八十八頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點5親和色譜親和色譜(affinitychromatography，AFC)利用固定相配基與生物大分子之間的特殊生物親和力的不同實現(xiàn)分離的。親和色譜廣泛用于酶、抗體、核酸、激素等生物大分子以及細胞、細胞器、病毒等物質的分離與純化。特別是對分離含量極少而又不穩(wěn)定的活性物質最有效，經(jīng)一步親和色譜即可純化幾百至幾千倍。目前八十九頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點①選擇性高、特異性極強②操作條件溫和③回收率高親和色譜的局限性①普遍性、通用性不夠②費用高親和色譜的特點目前九十頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點1基本原理親和色譜是應用生物高分子物質能與相應專一配基分子可逆結合的原理，將配基通過共價鍵牢固地結合于固相載體上制得親和吸附系統(tǒng)。生物分子上具有特定構象的結構域與配體的相應區(qū)域結合，具有高度的特異性和親和力。目前九十一頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點親和層析過程目前九十二頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點2親和吸附劑的制備1.載體的選擇①載體必須具有較好的理化穩(wěn)定性和生物惰性，非專業(yè)吸附小。②具有大量可供活化和配基結合的化學基團，以供與配基共價連接之用。③載體必須具有高度的水不溶性和親水性。④載體必須有稀松的網(wǎng)狀結構使大分子能自由進入⑤載體要有良好的機械性能，顆粒均勻。目前九十三頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點1.載體的選擇常用的親和色譜載體主要有多孔玻璃載體、聚丙稀酰胺載體、纖維素載體、葡聚糖凝膠載體、瓊脂糖凝膠和交聯(lián)瓊脂糖凝膠載體等。目前九十四頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點2.配基的選擇根據(jù)配基應用和性質，可將其分為兩類：特殊配基和通用配基。親和層析中常用的特殊配基有某一抗原的抗體、某一酶的專用抑制劑、某一激素的受體等。通用配基可適用于一類物質的分離提純，如用NADH作脫氫酶類親和層析的通用配基。目前九十五頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點2.配基的選擇首先，應當僅僅識別被純化的目的物(配體)。其次，配體與配基應該有足夠大的親和力。再次，配基與相應目的物之間的結合應具有可逆性。第四，配體具有足夠的穩(wěn)定性，能夠耐受反應條件以及清洗合再生等條件。最后，配基的分子大小必須合適。目前九十六頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點3.載體的活化與偶聯(lián)載體由于其相對的惰性，往往不能直接與配基連接，偶聯(lián)前一般需先活化，載體表面經(jīng)過活化后產(chǎn)生的活性基團可以在簡單的化學條件下與配基上的氨基、羧基、羥基和醛基等功能基團發(fā)生共價結合反應，這一過程稱為配基的鍵合。載體表明的基團必須具有通用性合高效性，可以與上述配基上的常見基團發(fā)生簡單、快速的反應。目前九十七頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點3.載體的活化和配基的連接1.溴化腈活化法2.環(huán)氧基活化法3.硅膠的活化目前九十八頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點3影響吸附劑親和力的因素

1.配基濃度對于親和力低的系統(tǒng)，為了取得較好的配體分離效果，必須提高載體上配基的有效濃度。2.空間障礙在制備有些吸附劑時需要在載體與配基之間插入一段適當長度的多烴鏈“手臂”，以增加與載體相連的配基的活動度并減輕載體的立體障礙。目前九十九頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點3影響親和作用的因素

3.配基與載體的結合位點在多肽或蛋白質等大分子作配基時，必須使它以最少的鍵與載體連接。4.載體孔徑載體孔隙是配體向配基接近的運動通道，所以載體的孔徑大小對吸附劑的親和能力有決定性影響。目前一百頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點4親和色譜操作條件的選擇1.吸附條件的選擇①吸附反應條件

最好是自然狀態(tài)下配體與目的分子之間反應的最佳條件。②流速控制

不能太快③吸附時間的控制

延長時間可促進吸附④進樣量的大小

減少進樣量，可提高吸附效果。目前一百零一頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點4親和色譜操作條件的選擇2.清洗條件的選擇洗滌緩沖液的強度應介于目的分子吸附條件與目的分子洗脫條件之間目前一百零二頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點4親和色譜操作條件的選擇3.洗脫條件的選擇在實際操作過程中，應該在洗脫強度和耐受程度之間做好平衡。目前一百零三頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點5操作方法1.樣品制備一般地說，雜質的非特異性吸附量與其濃度、性質、載體材料、配基固定化方法以及流動相的離子強度、pH和溫度等因素有關。親和色譜樣品預處理的主要程序：①顆粒、細胞碎片、膜片段等的去除；②樣品的濃縮及除去蛋白酶或抑制劑。目前一百零四頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點5操作方法2.配基與目的物結合條件的選擇配基與目的物的特異性結合需要最適的pH、緩沖液鹽濃度和離子強度。pH不僅能調節(jié)配基的電荷基團，也能調節(jié)目的物的電荷基團。中等鹽濃度的緩沖液能穩(wěn)定溶液中蛋白質并防止由于離子交換所引起的非特異性相互作用。目前一百零五頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點5操作方法3.柱操作柱的大小取決于吸附劑的容量和所需純化的蛋白質的量。一般地說，高的容量可以用于粗的短柱，大多數(shù)情況下，可以采用一次性的塑料小柱和1～5mL凝膠。目前一百零六頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點5操作方法4.流速的控制提高流速可提高分離速度，但柱效降低。因此，吸附操作要在適當?shù)牧鲃酉逻M行，既要保證高速度，又要保證高效率。為了使純化蛋白能夠得到好的洗脫峰、最小的稀釋度和最大的回收率，最好使用低流速。目前一百零七頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點5操作方法5.清洗清洗過度會使目標產(chǎn)物的損失增多，而清洗不充分則使洗脫回收的目標產(chǎn)物純度降低。具體操作是樣品吸附在上柱之后，必須用幾倍體積的起始緩沖液對柱清洗以除去不結合的所有物質。目前一百零八頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點5操作方法6.洗脫特異性洗脫利用含有與親和配基或目標產(chǎn)物具有親和結合作用的小分子化合物溶液作為洗脫劑，通過與親和配基或目標產(chǎn)物的競爭性結合，洗脫目標產(chǎn)物。非特異性洗脫通過調節(jié)洗脫液的pH、離子強度、離子種類或溫度等理化性質降低目標產(chǎn)物的親和吸附作用，是較多采用的洗脫方法。目前一百零九頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點5操作方法7.柱的再生具體操作是用幾倍體積的起始緩沖液進行再平衡，一般足以使親和柱再生，但一些未知的雜質往往仍結合在柱上，必須用苛刻的條件才能除去。根據(jù)載體材料的不同、配基的性質以及它與載體連接方式的不同可酌情處理。目前一百一十頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點高效液相色譜法(highpressureLiquidchromatography，HPLC)是利用物質在兩相之間吸附或分配的微小差異達到分離的目的。當兩相作相對移動時，被測物質在兩相之間做反復多次的分配，這樣使原來微小的差異產(chǎn)生了很大的分離效果，達到分離、分析和測定一些理化常數(shù)的目的。6高效液相色譜法目前一百一十一頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點HPLC與經(jīng)典LC區(qū)別經(jīng)典液相色譜高效液相色譜常壓或減壓填料顆粒大柱效低分析速度慢色譜柱只用一次不能在線檢測高壓，40～50Mpa填料顆粒小，2～50μm柱效高，40000～60000塊/m分析速度快色譜柱可重復多次使用能在線檢測目前一百一十二頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點與氣相色譜比較高效液相色譜以溶劑作流動相，流動相參與分離作用，分離能力強；適用范圍廣，氣相色譜分離分析的化合物只占化合物的30％，而高效色譜對高沸點、熱不穩(wěn)定、大分子量、離子型化合物等都有效，適合于生命物質的分析；分析過程中一般不破壞物質，因而可以方便地制備色譜純物質。HPLC與GC差別目前一百一十三頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點5/7/2023HPLC有以下特點：高壓——壓力一般100~300kg/cm2。高速——流速為1~10ml/min。高靈敏度——紫外檢測器靈敏度可達10-10g/L。同時消耗樣品少。高效——可達5000塔板每米。在一根柱中同時分離成份可達100種適用范圍廣——可以分離不可揮發(fā)而具有一定溶解性的物質或受熱不穩(wěn)定的物質目前一百一十四頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點一、HPLC的分類和基本原理色譜法的分離原理是：溶于流動相(mobilephase)中的各組分經(jīng)過固定相時，由于與固定相(stationaryphase)發(fā)生作用(吸附、分配、離子吸引、排阻、親和)的大小、強弱不同，在固定相中滯留時間不同，從而先后從固定相中流出。又稱為色層法、層析法。目前一百一十五頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點高效液相色譜法按固定相的名稱可分為液－液色譜和液－固色譜，按分離機制的不同分為：液固吸附色譜法液液分配色譜法（正相與反相）離子交換色譜法離子對色譜法分子排阻色譜法一、HPLC的分類和基本原理目前一百一十六頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點二、設備配置

高壓輸液系統(tǒng)(輸液泵)、進樣系統(tǒng)(進樣器)、分離系統(tǒng)(色譜柱)和檢測系統(tǒng)(檢測器)。此外還配有輔助裝置：如梯度淋洗，自動進樣及數(shù)據(jù)處理等。當注入欲分離的樣品時，高壓泵將貯液器中流動相經(jīng)過進樣器，將樣品帶入色譜柱進行分離，然后依先后順序進入檢測器，記錄儀將檢測器送出的信號記錄下來，得到液相色譜圖。目前一百一十七頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點液相色譜儀器

（highperformanceliquidchromatograph）液相色譜儀（1）目前一百一十八頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點液相色譜儀（2）目前一百一十九頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點液相色譜儀（3）目前一百二十頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點液相色譜儀（4）目前一百二十一頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點流程及主要部件

（processandmainassemblyofHPLC）目前一百二十二頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點梯度洗脫的實質是通過不斷地變化流動相的強度，來調整混合樣品中各組分的k值，使所有譜帶都以最佳平均k值通過色譜柱。它在液相色譜中所起的作用相當于氣相色譜中的程序升溫，所不同的是，在梯度洗脫中溶質k值的變化是通過溶質的極性、pH值和離子強度來實現(xiàn)的，而不是借改變溫度（溫度程序）來達到。目前一百二十三頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點三、固定相1.固定相的特性①較細的顆粒。一般為5～10μm。②粒度均勻一致。③機械強度好，具有良好的耐高壓剛性。④如果為多孔性顆粒，則孔徑分布也要均勻。⑤化學和熱穩(wěn)定性好，耐酸堿，不容易產(chǎn)生不可逆吸附。

目前一百二十四頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點三、固定相HPLC固定相骨架顆粒材料可分為無機和有機兩類，無機類中應用最多的是硅膠，其他如多孔玻璃、羥基磷灰石、石墨炭黑等。有機類主要為有機高分子合成材料，最為常見的是交聯(lián)聚苯乙烯，其他常用的還有高交聯(lián)瓊脂糖、交聯(lián)聚乙烯醇、交聯(lián)聚乙烯吡啶和交聯(lián)聚乙醇等。目前一百二十五頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點2.固定相的分類1）液-固吸附分離固定相種類：硅膠、氧化鋁和多孔聚合物；結構類型：全多孔高效吸附劑、全多孔低效吸附劑和表面多孔吸附劑。(1)硅膠分為薄殼玻璃珠、無定形全多孔硅膠及堆積硅珠等類型。(2)氧化鋁分為球形和無定形兩種，粒度5～10μm。對不飽和的碳氫化合物和含鹵素化合物的分離效果較好。在硅膠上吸附太強的化合物可試用氧化鋁。(3)多孔聚合物以聚苯乙烯膠體為代表，在pH1～14中穩(wěn)定。特點是選擇性好、峰形好，但硬度不高。目前一百二十六頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點(薄殼型微珠擔體)30～40μm的玻璃微球，表面附著一層厚度為1～2μm的多孔硅膠。表面積小，柱容量底。目前一百二十七頁\總數(shù)一百三十五頁\編于十二點2)液-液分配色譜固定相(1)正、反相色譜流動相極性小于固定相的分配色譜法稱為正相色譜法。以含水的硅膠為固定相，烷烴為流動相的色譜法是正相液-液分