微量凱氏定氮法

微量凱氏定氮法目的掌握應(yīng)用微量凱氏定氮法測(cè)定樣品總氮量7蛋白質(zhì)的原理和方法學(xué)會(huì)使用凱氏定氮儀原理凱氏（Kjeldahl）定氮法常用于測(cè)定天然有機(jī)物（如蛋白質(zhì)，核酸及氮基酸等）的含氮量。含氮有機(jī)物與濃硫酸共熱時(shí)，其中的碳、氫被分別氧化成co2和h2o,氮?jiǎng)t轉(zhuǎn)變?yōu)榘保⑦M(jìn)一步與硫酸作用生成硫酸銨，是為“消化”。該反應(yīng)進(jìn)行得比較緩慢，通常需要加入硫酸鉀/硫酸鈉以提高反應(yīng)的沸點(diǎn)，并加入硫酸銅作為催化劑促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行。以甘氨酸為例，其消化過(guò)程可表示如下：CHCOOH+3HSOT2COt+3SOt+4HO+NHt

| 2 2 4 2 2 2 3NH22NH3+H2SO4T（NH4）2SO4濃堿可使消化液中的硫酸銨分解，游離出氨，可借助水蒸汽將產(chǎn)生的氨蒸餾到一定量及一定濃度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后，氨與溶液中的氫離子結(jié)合，生成銨離子，使溶液中的氫離子濃度降低；然后用標(biāo)準(zhǔn)無(wú)機(jī)酸滴定，直至恢復(fù)溶液中原來(lái)的氫離子濃度為止，最后根據(jù)所用標(biāo)準(zhǔn)酸的當(dāng)量數(shù)（相當(dāng)于待測(cè)物中氨的當(dāng)量數(shù)）即可計(jì)算出待測(cè)樣品中的氮含量。（NH4）2SO4+2NaOH—Na2SO4+2NH4OHNH4OH—H2O+NH3tNH3+H3BO,—NH4H2BO3NH4H2BO3+HCL一NH4CL+H3BO3滴定時(shí)用甲烯藍(lán)和甲基紅混合指示劑，其指示范圍為pH5.2?5.6，將NH4H2BO3的藍(lán)/綠色滴至原來(lái)H3BO3的藍(lán)紫色即為終點(diǎn)。本法適用范圍0.2?1.0mg氮，相對(duì)誤差應(yīng)小于2%。材料、試劑與器具材料魚肉、血清等含蛋白質(zhì)樣品試劑濃硫酸（化學(xué)純）30%氫氧化鈉（分析純）溶液硫酸鉀-硫酸銅混合物：硫酸鉀與硫酸銅以3:1（W/W）配比混合研磨成粉末混合指示劑：0.1%甲烯藍(lán)乙醇溶液50ml與0.1%甲基紅乙醇溶液200ml混合配成（貯于棕色瓶備用，這種指示劑酸性時(shí)為紫色，堿性時(shí)為綠色，變色范圍窄且靈敏）0.0500MHCl6.硼酸-指示劑混合液：2%硼酸溶液100ml，滴加混合指示劑貯備液，搖勻后溶液呈現(xiàn)紫紅色即可（約加1ml左右混合指示劑）。器具凱氏燒瓶消化架吸量管（1ml,2ml）量筒（10ml）凱氏定氮蒸餾裝置微量滴定管（3ml,5ml,可讀至0.02ml）錐形瓶（50?100ml）容量瓶（50ml）操作步驟㈠消化稱取適量魚肉樣品加入50ml凱氏燒瓶（注意勿沾于瓶口或瓶頸上）。加入硫酸鉀-硫酸銅混合物約0.2克，濃硫酸3ml，小瓷片兩粒，搖勻。將燒瓶約60度角固定在鐵架上，每個(gè)瓶口放一小漏斗，在通風(fēng)廚內(nèi)的電爐上消化。在消化開(kāi)始時(shí)，應(yīng)控制火力，不要使沸液沖到瓶頸。待瓶?jī)?nèi)水汽蒸完，硫酸開(kāi)始分解并放出SO2白煙后，適當(dāng)加強(qiáng)火力，繼續(xù)消化，直至消化液呈透明藍(lán)綠色為止。消化完畢，待燒瓶?jī)?nèi)容物冷卻后，加蒸餾水10ml（注意慢加，邊加邊搖）。冷卻后將瓶?jī)?nèi)容物轉(zhuǎn)入50ml容量瓶，并用蒸餾水洗燒瓶數(shù)次，溶液一并倒入容量瓶，最后定容至刻度搖勻，做上記號(hào)備用。㈡蒸餡1、儀器的洗滌：儀器應(yīng)先經(jīng)一般洗滌，再經(jīng)水蒸氣洗滌。蒸餾器有幾種，應(yīng)用前需熟悉其使用方法。使用方法如下：圖1-1 凱氏微量定氮蒸餾裝置開(kāi)放自來(lái)水龍頭，使水E進(jìn)入6，從K管流出（水不宜開(kāi)得過(guò)大以免水從G管溢出）。開(kāi)放P3,使水進(jìn)入A室，漏斗D中加蒸餾水約10ml入B室。用拇指將管口按緊，同時(shí)開(kāi)放P1,則B室中的水先從Y型管口沖出，隨后A室中水經(jīng)K管流出，一般情況下如此重復(fù)洗滌兩次即可。若蒸餾器內(nèi)有氨存在，則應(yīng)加入蒸餾水后，不加樣品蒸餾一次方可使用（可用pH試紙檢查）。A為蒸氣發(fā)生室，P3為其開(kāi)關(guān)，P1為出水開(kāi)關(guān)，B為蒸餾室，與出氣管M相接，M管插入盛有定量硼酸液的錐形瓶，B室內(nèi)有Y型管，一端與A室相通，另一端經(jīng)P4與漏斗D相連，可經(jīng)此將樣品及試劑加入B室，F(xiàn)為冷凝管，E為進(jìn)水管，水經(jīng)F、G、K而流出，蒸餾時(shí)依次在B室加入消化好的樣品及NaOH,二者反應(yīng)產(chǎn)生氨，經(jīng)M管進(jìn)入錐形瓶由硼酸吸收。2、 空白蒸餾：蒸餾器洗凈后，開(kāi)放水龍頭P3，使水進(jìn)入A室，水放至A室球部2/3即可。取1個(gè)50ml錐形瓶，準(zhǔn)確加入10ml硼酸-指示劑混合液，用表面皿復(fù)蓋備用。加樣：用移液管吸取1ml蒸餾水，細(xì)心地由漏斗D傾入蒸餾室。將盛有硼酸-指示劑的錐形瓶置于M管下，使管口恰好接觸硼酸溶液。用量筒從漏斗D加入30%氫氧化鈉8ml，隨即將P4夾緊，并往漏斗加入少量蒸餾水封閉（水封）。蒸餾：用酒精燈加熱（注意防風(fēng)以維持火力恒定），待硼酸-指示劑變綠時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)；3?5min后將錐形瓶放低，使導(dǎo)管離開(kāi)液面再蒸餾2min，最后用蒸餾水沖洗導(dǎo)管外壁。蒸餾完畢后取下錐形瓶，撤火，隨即將蒸餾器洗凈。3、 樣品蒸餾：用移液管分別吸取兩份1ml樣品消化液，按上述操作步驟進(jìn)行蒸餾（注意在加樣后應(yīng)用適量蒸餾水清洗漏斗）。㈢滴定：用0.0500N標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液滴定蒸餾吸收液至淡紫色或灰色，記錄所用鹽酸的量。㈣計(jì)算出口殆曰（A-B）X0.0100X14樣品的總氮含量（克氮％）= X100Cx1000若測(cè)定的樣品含氮量部分只是蛋白性，（如血清）則：樣品的總蛋白含量（克蛋白％）=（■-B）xm。100x1446.25x100Cx1000式中：A為滴定樣品用去的鹽酸平均毫升數(shù)；B為滴定空白用去的鹽酸平均毫升數(shù)；C為稱量樣品的克數(shù)；0.0100為鹽酸的當(dāng)量濃度（應(yīng)為本實(shí)驗(yàn)使用鹽酸的實(shí)際濃度）；14為氮的原子量；6.25為常數(shù)。若樣品中除有蛋白外，尚有其他含氮物質(zhì)，則樣品蛋白質(zhì)含量的測(cè)定要更復(fù)雜一些。首先需向樣品中加入適量的三氯乙酸（使蛋白質(zhì)變性沉淀），然后測(cè)定未加三氯乙酸的樣品總氮及加入三氯乙酸后的樣品上清液中的非蛋白氮，再進(jìn)一步算出蛋白質(zhì)的含量。蛋白氮=總氮一非蛋白氮蛋白質(zhì)含量（克/%）=蛋白氮X6.25㈤注意事項(xiàng)1、凱氏法的優(yōu)點(diǎn)是適用范圍廣，可用于動(dòng)植物的各種組織，器官及食品等成組復(fù)雜樣品的測(cè)定，只要細(xì)心操作都能得到精確的結(jié)果。其缺點(diǎn)是操作比較復(fù)雜，含有大量堿性氨基酸的蛋白質(zhì)測(cè)定結(jié)果偏高。2、 普通實(shí)驗(yàn)室中的空氣中常含有少量的氨，會(huì)影響結(jié)果，所以操作應(yīng)在