免疫增殖性疾病的免疫學(xué)檢驗(yàn)

第九單元

免疫增殖性疾病的免疫學(xué)檢驗(yàn)第一頁(yè)，共三十五頁(yè)。概述免疫增殖病通常是指以漿細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞異常增生為特征的疾病，其表現(xiàn)往往有免疫功能異常及免疫球蛋白質(zhì)和量的變化。與免疫學(xué)檢驗(yàn)最為密切的是B淋巴細(xì)胞異常增殖或其他導(dǎo)致免疫球蛋白異常的免疫球蛋白病，免疫球蛋白病主要表現(xiàn)為高免疫球蛋白血癥。第二頁(yè)，共三十五頁(yè)。當(dāng)臨床上考慮為多發(fā)性骨髓瘤、巨球蛋白血癥或其它漿細(xì)胞惡變等免疫球蛋白病時(shí)，一般先以血清蛋白區(qū)帶電泳、免疫球蛋白定量檢測(cè)或尿本－周蛋白定性作為初篩實(shí)驗(yàn)。如果發(fā)現(xiàn)有異常球蛋白區(qū)帶，繼而進(jìn)行免疫固定電泳、免疫球蛋白亞型定量等檢測(cè)做進(jìn)一步定量分析和免疫球蛋白分類鑒定。第三頁(yè)，共三十五頁(yè)。實(shí)驗(yàn)一

血清免疫固定電泳實(shí)驗(yàn)第四頁(yè)，共三十五頁(yè)。實(shí)驗(yàn)?zāi)康谋緦?shí)驗(yàn)以血清免疫固定電泳實(shí)驗(yàn)為例進(jìn)行實(shí)習(xí)通過實(shí)習(xí)，熟悉血清免疫固定電泳的實(shí)驗(yàn)過程及注意事項(xiàng)；掌握血清免疫固定電泳檢測(cè)M蛋白的基本原理與臨床意義。第五頁(yè)，共三十五頁(yè)。實(shí)驗(yàn)原理將患者血清在瓊脂糖凝膠介質(zhì)上經(jīng)電泳分離后，將固定劑和各型Ig及其輕鏈抗血清加于凝膠表面的各自泳道上，經(jīng)孵育讓固定劑和抗血清在各自泳道對(duì)應(yīng)的凝膠內(nèi)滲透并擴(kuò)散，若有對(duì)應(yīng)抗原存在，則在適當(dāng)位置形成抗原抗體復(fù)合物并沉淀下來。電泳凝膠在洗脫液中漂洗，去除未結(jié)合蛋白質(zhì)，僅保留貯存在凝膠內(nèi)的抗原抗體復(fù)合物。經(jīng)染色后蛋白質(zhì)電泳參考道和抗原抗體沉淀區(qū)帶被AcideViolet染色液著色。根據(jù)電泳移動(dòng)距離分離出單克隆組分。第六頁(yè)，共三十五頁(yè)。試劑與器材AcideViolet染色液：用1L10%冰醋酸溶解AcideViolet。脫色液：用1L蒸餾水溶解CitricAcidDestain。清洗液：8L蒸餾水溶解Tris-BufferedSaline。電泳儀：spife3000全自動(dòng)電泳儀。第七頁(yè)，共三十五頁(yè)。Spife3000全自動(dòng)電泳儀第八頁(yè)，共三十五頁(yè)。操作步驟樣本處理：用生理鹽水將血清標(biāo)本適當(dāng)稀釋后備用，其中同一份血清第一泳道樣本稀釋3倍，第二至第六泳道樣本稀釋5倍。第九頁(yè)，共三十五頁(yè)。區(qū)帶電泳上樣

膠片準(zhǔn)備

電泳第十頁(yè)，共三十五頁(yè)。沉淀反應(yīng)加抗血清洗滌、烘干著色第十一頁(yè)，共三十五頁(yè)。結(jié)果分析

對(duì)染色烘干后的膠片進(jìn)行判讀。將第一泳道作為血清蛋白分子量參考道，觀察第二至第六泳道有無對(duì)應(yīng)的特異性單克隆免疫球蛋白條帶。如圖12-1所示,其中sp泳道為血清蛋白參考道，由下至上分別為白蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白、γ球蛋白。第2、3、4、5、6泳道分別為IgG、IgA、IgM、κ、λ抗血清泳道。第十二頁(yè)，共三十五頁(yè)。第十三頁(yè)，共三十五頁(yè)。注意事項(xiàng)標(biāo)本需取新鮮血清進(jìn)行分析，為避免抗原過剩引起的帶現(xiàn)象，血清于加樣前應(yīng)先作適當(dāng)稀釋并混勻?？偯庖咔虻鞍椎乃剑?0g/L稀釋劑量加倍，當(dāng)總免疫球蛋白水平＜5g/L稀釋劑量減半（除了ELP泳道）。某些樣本（尤其是含有冷球蛋白或冷凝膠）冷藏或冰凍后，可能變得粘稠或混濁。這種樣本可能由于擴(kuò)散障礙而存在點(diǎn)樣問題。在這樣情況下，加25μl液化劑于75μl血清中，混勻15s。然后按規(guī)定程序繼續(xù)進(jìn)行。第十四頁(yè)，共三十五頁(yè)。某些單克隆蛋白質(zhì)可能因多聚體而導(dǎo)致所有的免疫固定泳道上均出現(xiàn)單克隆片段。在這樣情況下可加25μl還原劑（1％β-巰基乙醇）于75μl血清混勻并令其反應(yīng)至少15min（至多3h)后按規(guī)定程序繼續(xù)進(jìn)行。在電泳之前，凝膠與電泳槽的貼合面充滿電泳介質(zhì)，并確保兩者之間無氣泡。第十五頁(yè)，共三十五頁(yè)。在抗血清加入血清加樣孔后，確保血清與凝膠之間無氣泡。染色之前的膠片一定要置于洗滌液中充分洗滌，以出去游離的血清和抗血清成分，降低染色后凝膠的背景色。第十六頁(yè)，共三十五頁(yè)。臨床應(yīng)用本法可對(duì)各類Ig及其輕鏈進(jìn)行分型，最常用于臨床常規(guī)M蛋白的分型與鑒定。通常用于單克隆Ig增殖病，單克隆Ig病，本周蛋白和游離輕鏈病、多組份單克隆Ig病，重鏈病、腦脊液寡克隆蛋白鑒別、多克隆Ig病的診斷和鑒別診斷。免疫固定電泳的優(yōu)點(diǎn)是分辨率高、敏感度高、操作周期短（僅需數(shù)小時(shí)）、結(jié)果易于分析。第十七頁(yè)，共三十五頁(yè)。思考題結(jié)合實(shí)驗(yàn)室的免疫固定電泳分析系統(tǒng)，簡(jiǎn)述血清免疫固定電泳的影響因素及其克服的方法。溫州醫(yī)學(xué)院陶志華第十八頁(yè)，共三十五頁(yè)。實(shí)驗(yàn)二

血清IgG定量檢測(cè)的可

報(bào)告范圍評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)第十九頁(yè)，共三十五頁(yè)?？蓤?bào)告范圍指可以報(bào)告的所有結(jié)果范圍，包含兩種類型的范圍，即分析測(cè)量范圍和臨床可報(bào)告范圍。分析測(cè)量范圍指對(duì)沒有進(jìn)行任何預(yù)處理（稀釋，濃縮等）的標(biāo)本，分析方法能夠直接測(cè)定出的待測(cè)物范圍，也就是系統(tǒng)最終的輸出值（活性或濃度）與被分析物的活性或濃度成線性比例的范圍，它反映整個(gè)系統(tǒng)的輸出特性。概述第二十頁(yè)，共三十五頁(yè)。臨床可報(bào)告范圍是指對(duì)臨床診斷、治療有意義的待測(cè)物濃度范圍。此范圍如果超出了分析測(cè)量范圍，可將標(biāo)本通過稀釋、濃縮等預(yù)處理使待測(cè)物濃度處于分析測(cè)量范圍內(nèi)，最后結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)。第二十一頁(yè)，共三十五頁(yè)。實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆昭錓gG定量檢測(cè)的可報(bào)告范圍評(píng)價(jià)的原理和方法學(xué)，了解血清IgG測(cè)定方法學(xué)的性能。第二十二頁(yè)，共三十五頁(yè)。實(shí)驗(yàn)原理由于抗原抗體反應(yīng)的特殊性，免疫學(xué)檢測(cè)項(xiàng)目應(yīng)使用多點(diǎn)定標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，在繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線上查閱結(jié)果。由于計(jì)算機(jī)技術(shù)的發(fā)展，儀器可對(duì)反應(yīng)響應(yīng)呈不同表現(xiàn)的結(jié)果做適當(dāng)?shù)奶幚?，直接以最終計(jì)量單位方式報(bào)告檢驗(yàn)結(jié)果，在此情況下，評(píng)價(jià)患者結(jié)果可報(bào)告范圍時(shí)，可不必再去評(píng)價(jià)響應(yīng)結(jié)果的真實(shí)曲線狀態(tài)，只要將樣品作不同程度的稀釋或配制后，將預(yù)期值和實(shí)際檢測(cè)值作比較，繪制在坐標(biāo)紙上應(yīng)呈一條通過原點(diǎn)、斜率為1的直線。直線所達(dá)的限值即為該方法的患者結(jié)果可報(bào)告范圍。第二十三頁(yè)，共三十五頁(yè)。試劑與器材選用與檢測(cè)儀器相配套的試劑、校準(zhǔn)品及其他輔助試劑參考選用檢測(cè)系統(tǒng)中血清IgG的檢測(cè)范圍選擇低濃度標(biāo)本和高濃度標(biāo)本第二十四頁(yè)，共三十五頁(yè)。操作步驟按標(biāo)本操作規(guī)程做好項(xiàng)目校準(zhǔn)、常規(guī)質(zhì)控，保證檢測(cè)系統(tǒng)處于良好狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)標(biāo)本的配制，將血清IgG的高（H）和低（L）樣品按：5L、4L+1H、3L+2H、2L+3H、1L+4H、5H關(guān)系各自配制混合，形成系列評(píng)價(jià)的實(shí)驗(yàn)樣品。并計(jì)算各樣品的預(yù)期值。將系列評(píng)價(jià)的實(shí)驗(yàn)樣品上機(jī)檢測(cè)，每標(biāo)本重復(fù)檢測(cè)2~4次，結(jié)果記錄于下表。依照稀釋關(guān)系，計(jì)算各實(shí)驗(yàn)樣品的預(yù)期值。按實(shí)驗(yàn)要求，每個(gè)樣品做6次重復(fù)測(cè)定，得6個(gè)實(shí)測(cè)值，它們和預(yù)期值形成6對(duì)數(shù)據(jù)。第二十五頁(yè)，共三十五頁(yè)。結(jié)果分析第二十六頁(yè)，共三十五頁(yè)。觀察結(jié)果有無明顯的數(shù)據(jù)差異，若有明顯差異時(shí)，應(yīng)判斷是否為離群點(diǎn)。在坐標(biāo)紙上，以X表示各樣品的預(yù)期值，以Y表示各樣品的實(shí)測(cè)值，將實(shí)驗(yàn)結(jié)果點(diǎn)在圖上。若所有實(shí)驗(yàn)點(diǎn)在坐標(biāo)紙上呈明顯直線趨勢(shì)，用直線回歸對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，得直線回歸方程Y=bX+a，若b在0.97～1.03范圍內(nèi)，a接近于0，則可直接判斷測(cè)定方法可報(bào)告范圍在實(shí)驗(yàn)已涉及濃度。若b不在0.97～1.03范圍內(nèi)，a較大，試著舍去某組數(shù)據(jù)，另作回歸統(tǒng)計(jì)。若縮小分析范圍后，回歸式有明顯改善，若b接近于1，a趨于0。此時(shí)，縮小的分析范圍可作為真實(shí)的可報(bào)告范圍。第二十七頁(yè)，共三十五頁(yè)。注意事項(xiàng)

進(jìn)行可報(bào)告范圍實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)的樣品必須與真實(shí)標(biāo)本盡可能相似，也要與真實(shí)標(biāo)本具有相同的基質(zhì)狀態(tài)。評(píng)價(jià)樣品要5個(gè)或以上系列濃度的實(shí)驗(yàn)樣品，濃度范圍遍及整個(gè)預(yù)期可報(bào)告范圍。最高濃度的樣品應(yīng)達(dá)到可報(bào)告范圍的上限。若收不到低值樣品，可收集高值樣品，經(jīng)系列不同程度稀釋，形成系列評(píng)價(jià)樣品。一天內(nèi)做完本實(shí)驗(yàn)，一般每個(gè)實(shí)驗(yàn)樣品做2～4次重復(fù)測(cè)定。綜合所有結(jié)果作統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。第二十八頁(yè)，共三十五頁(yè)。應(yīng)仔細(xì)閱讀試劑說明書，某些檢測(cè)項(xiàng)目不適宜用稀釋方法獲取系列濃度的臨床新鮮血清標(biāo)本，可采用商品質(zhì)控物、校準(zhǔn)品等。臨床可報(bào)告范圍的評(píng)價(jià)要對(duì)分析標(biāo)本進(jìn)行最大稀釋度的評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)，以此作為臨床可報(bào)告范圍的上限；如果低限有臨床意義時(shí)，可增加分析標(biāo)本反應(yīng)量來進(jìn)行檢測(cè)下限評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)，并以此作為臨床可報(bào)告范圍下限。第二十九頁(yè)，共三十五頁(yè)。臨床應(yīng)用可報(bào)告范圍評(píng)價(jià)是評(píng)價(jià)在此范圍內(nèi)不同患者標(biāo)本報(bào)告結(jié)果間的比值與各標(biāo)本內(nèi)含有的分析物確實(shí)存在這樣的比例關(guān)系。第三十頁(yè)，共三十五頁(yè)。思考題若血清IgG低值為0.5g/L（L）、高值為40.0g/L（H），請(qǐng)計(jì)算按：5L、4L+1H、3L+2H、1L+4H、5H關(guān)系配制的系列實(shí)驗(yàn)樣品理論濃度分別為多少？溫州醫(yī)學(xué)院陶志華第三十一頁(yè)，共三十五頁(yè)。病案討論

免疫增殖性疾病第三十二頁(yè)，共三十五頁(yè)。某患者，男，48歲。主述“乏力，臉色蒼白，骨骼疼痛、背痛”六個(gè)月，體檢發(fā)現(xiàn)：皮膚黏膜蒼白，局限性骨骼壓痛，伴肝脾腫大。輔助檢查發(fā)現(xiàn)：（1）血象：Hb8.2g/dl，WBC血小板紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板鏡檢形態(tài)學(xué)正常，分類可見幼粒、幼紅細(xì)胞，紅細(xì)胞呈緡錢狀排列；（2）骨髓象：增生活躍，漿細(xì)胞占20％，并發(fā)現(xiàn)形態(tài)異常的骨髓瘤細(xì)胞。其余各系細(xì)胞大致正常；（3）骨X線片、CT或同位素掃描：可發(fā)現(xiàn)多部位穿鑿樣溶骨性病變或廣泛性骨質(zhì)疏松。第三十三頁(yè)，共三十五頁(yè)。問題根據(jù)以上初步檢查結(jié)果，該患者初步診斷為什么疾?。扛鶕?jù)你的理論知識(shí)，該患者還需做哪些免疫學(xué)檢驗(yàn)項(xiàng)目？可能結(jié)果如何？與哪些疾病需進(jìn)行鑒別診斷？溫州醫(yī)學(xué)院陶志華第三十四頁(yè)，共三十五頁(yè)。內(nèi)容總結(jié)第九單元。經(jīng)染色后蛋白質(zhì)電泳參考道和抗原抗體沉淀區(qū)帶被AcideViolet染色液著色。電泳儀：spife3000全自動(dòng)電泳儀。某些樣本（尤