質(zhì)粒的提取及鑒定

實驗六

質(zhì)粒DNA的少量提取及鑒定天津醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院生物化學與分子生物學系辛靈彪目前一頁\總數(shù)四十七頁\編于點目的要求了解質(zhì)粒的概念。熟悉提取質(zhì)粒的基本原理。掌握堿變性法提取質(zhì)粒DNA的方法。目前二頁\總數(shù)四十七頁\編于點a.什么是質(zhì)粒（plasmid）？b.質(zhì)粒的本質(zhì)是什么？c.質(zhì)粒有哪些構型？c.質(zhì)粒有哪些特點？d.質(zhì)粒的用途有哪些？31.關于質(zhì)粒的概念目前三頁\總數(shù)四十七頁\編于點質(zhì)粒的定義

質(zhì)粒是細菌細胞內(nèi)一種自我復制的環(huán)狀雙鏈DNA分子，能穩(wěn)定地獨立于染色體外，并傳遞到子代，一般不整合到宿主染色體上。在細胞內(nèi)它們常以共價閉環(huán)的超螺旋形式存在。

4目前四頁\總數(shù)四十七頁\編于點超螺旋DNA(supercoiledDNA,SCDNA)線狀DNA(linearDNA,LDNA):

如果兩條鏈均斷開，即為線狀DNA。（3）開環(huán)DNA(opencircularDNA,OCDNA)

如果兩條鏈中有一條的一處或多處斷裂，分子就能發(fā)生旋轉(zhuǎn)而消除鏈的張力，形成松弛型的環(huán)狀分子。質(zhì)粒的三種構型5目前五頁\總數(shù)四十七頁\編于點質(zhì)粒DNA的一般特性：(1)宿主菌染色體DNA通常比質(zhì)粒DNA要大得多(2)它是雙鏈閉合環(huán)狀DNA，分子量大小不等。(3)質(zhì)粒是細菌內(nèi)的共生型遺傳因子,有相對獨立性。(4)它能在細菌中垂直遺傳并賦予宿主細胞一些表型：菌毛、抗藥性等

目前六頁\總數(shù)四十七頁\編于點分離純化質(zhì)粒DNA的主要步驟(1)培養(yǎng)細菌使質(zhì)粒擴增（DNA的擴增與選擇）(2)細菌的收集與裂解

收集方法：高速離心的方法裂解細菌方法：去污劑法、有機溶劑法、堿變性法、沸水熱裂法、溶菌酶法、超聲處理法等。根據(jù)質(zhì)粒的大小、宿主菌菌株及裂解后的純化方法等因素綜合后加以選擇。

(3)質(zhì)粒DNA的純化

常用的方法有：超速離心、層析法、聚乙二醇沉淀法等所有純化方法都是利用了質(zhì)粒DNA相對較小及共價閉合環(huán)狀的性質(zhì)。2提取大腸桿菌質(zhì)粒DNA的方法和原則目前七頁\總數(shù)四十七頁\編于點原理示意圖目前八頁\總數(shù)四十七頁\編于點實驗原理：高堿細菌的細胞壁破裂，內(nèi)容物釋放①染色體DNA斷裂成不同長度的線性雙鏈DNA；②線性雙鏈DNA片段中的氫鍵斷裂，雙鏈解離變性。①質(zhì)粒DNA不發(fā)生斷裂，保持雙鏈閉合環(huán)狀；②雙鏈DNA并不完全分離。高酸中和至中性變性的染色體DNA與變性的蛋白質(zhì)以及細胞碎片凝聚成網(wǎng)絡狀大分子不溶性沉淀物質(zhì)粒DNA又恢復天然構型，溶解在上清液中純化RNA酶消化除去RNA，并用除去殘留的蛋白質(zhì)目前九頁\總數(shù)四十七頁\編于點試劑盒主要試劑及作用溶液Ⅰ：由葡萄糖、EDTA、Tris?HCl組成.(保護、緩沖)①葡萄糖的作用是增加溶液的粘度,減少抽提過程中的機械剪切作用,防止破壞質(zhì)粒.(保護作用)②EDTA

的作用是絡合掉鎂等二價金屬離子,防止DNA酶對質(zhì)粒分子的降解作用。（保護作用）③Tris?HCl能使溶菌液維持溶菌作用的最適PH范圍（緩沖作用）10目前十頁\總數(shù)四十七頁\編于點

溶液II：由SDS（十二烷基硫酸鈉）與NaOH組成(裂解、變性)①SDS是離子型表面活性劑,其主要作用是：溶解細胞膜上的脂質(zhì)與蛋白，從而破壞細胞膜；解聚細胞中的核蛋白；使蛋白質(zhì)變性而沉淀下來。SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在接下來的提取過程必須把它去除干凈，以便后續(xù)更好地進行。②NaOH（PH>12）的作用是破壞氫鍵，使DNA分子變性（DNA變性作用）可瞬間溶解細胞及細菌。11試劑盒主要試劑及作用目前十一頁\總數(shù)四十七頁\編于點溶液III：pH4.8KAC(乙酸鉀)高鹽溶液，pH調(diào)至中性

(復性，分離)①中和溶液Ⅱ的堿性，使染色體DNA變性而發(fā)生纏繞，并使質(zhì)粒DNA復性。②KAC會與SDS形成溶解度很低的鹽，并與蛋白質(zhì)形成沉淀而除去；溶液中的DNA也會與蛋白質(zhì)-SDS復合物纏繞成大分子而與小分子質(zhì)粒DNA分離。試劑盒主要試劑及作用目前十二頁\總數(shù)四十七頁\編于點吸附株純化質(zhì)粒DNA目前十三頁\總數(shù)四十七頁\編于點實驗步驟1.收集4.5ml菌液于EP管，每次12000g×30s

2.棄上清，加含RnaseA溶液I250μl，劇烈振蕩3.加250μl

溶液II，快速顛倒數(shù)次

4.加350μl溶液III，溫和振蕩10s，12000g×10min5.轉(zhuǎn)移500μl上清到吸附株，12000g×1min

6.吸附柱中加700μl漂洗液，12000g×1min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。7.向吸附柱中加入500μl漂洗液，12000g×1min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。12000g×2min，8.將吸附柱敞口置于室溫放置2min，揮發(fā)殘余的乙醇。9.將吸附柱放入一個干凈的EP管中，向吸附膜中央懸空滴加50μl經(jīng)65℃水浴預熱的洗脫液，室溫放置2min，12000g×1min。10.將此質(zhì)粒DNA溶液置于-20℃保存。目前十四頁\總數(shù)四十七頁\編于點

瓊脂糖是由半乳糖及其衍生物構成的中性物質(zhì)，不帶電荷。瓊脂糖透明無紫外吸收，因此，目前多用瓊脂糖為電泳支持物進行平板電泳。

在堿性環(huán)境下，DNA的磷酸基團解離，使DNA帶負電荷，在電場中向正極方向泳動，因各種DNA分子的電荷數(shù)、分子量、構象不同，在通過凝膠立體網(wǎng)格時所受的動力和阻力不同，所以泳動的速度有差異，以此達到分離的目的。

153、質(zhì)粒DNA的瓊脂糖凝膠電泳鑒定目前十五頁\總數(shù)四十七頁\編于點實驗材料及試劑

6xloadingbuffer：主要成分甘油、電泳指示劑和tris.甘油主要負責沉降DNA，避免飛樣。指示劑肉眼可見，確定電泳狀態(tài)，一般指示劑兩種，溴酚藍呈藍紫色，甲苯晴呈藍色。溴化乙錠（EB）：熒光染料，可與DNA結合，在紫外光照射下呈紅橙色熒光。有致癌性。TBE:Tris，Boric

acid,EDTA。核酸電泳的經(jīng)典緩沖液。瓊脂糖：用1xTBE配置瓊脂糖凝膠。DNAmarker目前十六頁\總數(shù)四十七頁\編于點DNAMarker：是分子量不同的DNA片段，主要用途就是DNA分子凝膠電泳時，加樣用做對比來檢測瓊脂糖凝膠是否有問題，以及粗略判斷樣品的分子量。DNAMarker應選擇在目標片段大小附近ladder較密集的marker，這樣對目標片段大小的估計較準確。目前十七頁\總數(shù)四十七頁\編于點影響DNA在凝膠中遷移速率的因素

1DNA分子的大小2構象3凝膠濃度4電壓5緩沖液目前十八頁\總數(shù)四十七頁\編于點OC型質(zhì)粒DNA點樣孔細菌基因組DNAL型質(zhì)粒DNASC質(zhì)粒DNA細菌RNA質(zhì)粒電泳圖譜目前十九頁\總數(shù)四十七頁\編于點實驗步驟瓊脂糖凝膠板的制備（封板、制備1%凝膠待溫度降至60-70℃時加入EB（0.5μ/ml）、倒膠、插梳、凝固后拔梳）倒緩沖液，加樣（取質(zhì)粒DNA樣品液5μl+1μl上樣緩沖液，混勻）電泳（100V20min左右，5V/cm）紫外燈下檢測目前二十頁\總數(shù)四十七頁\編于點移液器的使用將微量液體從一個容器轉(zhuǎn)移到另一個容器的計量器具，我們稱之為移液器。目前二十一頁\總數(shù)四十七頁\編于點移液器的使用移液循環(huán)安裝槍頭設定容量吸液放液卸去槍頭目前二十二頁\總數(shù)四十七頁\編于點移液器的使用安裝槍頭目前二十三頁\總數(shù)四十七頁\編于點移液器的使用原點第一停點第二停點勿在液體中按至第一停點槍頭勿伸入液面太深管壁加入排盡液體復位后，卸去槍頭目前二十四頁\總數(shù)四十七頁\編于點移液器的使用卸去槍頭無需用手接觸槍頭目前二十五頁\總數(shù)四十七頁\編于點

1、加樣槍正確使用；2、標記自己所提取的質(zhì)粒類型；3、廢液倒在水池中，槍頭扔到垃圾桶中；4、加不同溶液要換槍頭；5、離心前把管擦干；6、轉(zhuǎn)移上清時不要吸到沉淀；7、使用前請先檢查溶液Ⅱ和溶液Ⅲ是否出現(xiàn)混濁；8、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ和漂洗液使用后應立即擰緊蓋子。9、洗脫液不少于50μl，-20℃保存，以防DNA降解。質(zhì)粒提取注意事項：目前二十六頁\總數(shù)四十七頁\編于點1.凝膠濃度選擇根據(jù)樣品DNA分子大小而定，所以電泳前應對DNA片段大小有粗略估計。2.加EB時，膠的溫度不要太高。高溫會導致EB揮發(fā)，EB有致癌性。倒膠時避免產(chǎn)生氣泡。3.緩沖液要完全沒過點樣孔。點樣孔不能有氣泡。4.紫外線照射不要太久。尤其避免直接照射皮膚。瓊脂糖電泳注意事項：目前二十七頁\總數(shù)四十七頁\編于點質(zhì)粒的定義

質(zhì)粒是細菌細胞內(nèi)一種自我復制的環(huán)狀雙鏈DNA分子，能穩(wěn)定地獨立于染色體外，并傳遞到子代，一般不整合到宿主染色體上。在細胞內(nèi)它們常以共價閉環(huán)的超螺旋形式存在。

28目前二十八頁\總數(shù)四十七頁\編于點目前二十九頁\總數(shù)四十七頁\編于點目前三十頁\總數(shù)四十七頁\編于點基因克隆示意圖分、切接轉(zhuǎn)篩實現(xiàn)基因克隆所采用的方法及相關的工作統(tǒng)稱為重組DNA技術，又稱基因工程。目前三十一頁\總數(shù)四十七頁\編于點目前三十二頁\總數(shù)四十七頁\編于點2BamHI、HindⅢ酶切質(zhì)粒及鑒定2.1實驗原理：利用限制性內(nèi)切酶特異的識別DNA特異的核苷酸序列，并切割DNA,產(chǎn)生一定長度的DNA片段，通過電泳對酶切前后產(chǎn)物分析可以鑒別目的基因（重組質(zhì)粒DNA）33目前三十三頁\總數(shù)四十七頁\編于點實驗七質(zhì)粒DNA質(zhì)粒DNA的濃度測定與雙酶切鑒定天津醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院生物化學與分子生物學系辛靈彪目前三十四頁\總數(shù)四十七頁\編于點1.熟悉DNA的濃度測定方法。2.了解限制性核酸內(nèi)切酶在基因工程中的應用。3.熟悉利用限制性核酸內(nèi)切酶切割質(zhì)粒的方法。目的要求目前三十五頁\總數(shù)四十七頁\編于點實驗原理1.質(zhì)粒DNA濃度測定目前三十六頁\總數(shù)四十七頁\編于點1.DNA或RNA的定量OD260=1.0相當于50μg/ml雙鏈DNA40μg/ml單鏈DNA（或RNA）20μg/ml寡核苷酸2.判斷核酸樣品的純度DNA純品:OD260/OD280=1.8RNA純品:OD260/OD280=2.0OD260的應用目前三十七頁\總數(shù)四十七頁\編于點DNA樣品的濃度（μg/μl）=OD260×稀釋倍數(shù)×50/1000OD260/OD280打開紫外分光光度計，設定波長260nm,切換至紫外。1.質(zhì)粒DNA濃度測定方法200倍稀釋樣品，10μl質(zhì)粒加水稀釋至2000μl洗凈比色皿，加入待測樣品。記錄260nm的OD值。設定波長280nm，記錄OD值。計算樣品濃度和純度目前三十八頁\總數(shù)四十七頁\編于點限制性核酸內(nèi)切酶定義：能在特異位點（酶切位點）上催化雙鏈DNA分子的斷裂,產(chǎn)生相應的限制性DNA片段。

切割不同來源的DNA分子將產(chǎn)生特征性限制性酶切圖譜，具有重大應用價值（“分子手術刀”）。

主要存在于細菌體內(nèi)。392.質(zhì)粒DNA雙酶切鑒定目前三十九頁\總數(shù)四十七頁\編于點第一個字母取自產(chǎn)生該酶的細菌屬名，用大寫；第二、第三個字母是該細菌的種名，用小寫；第四個字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。

限制性核酸內(nèi)切酶命名Hin

dⅢ屬

系

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血桿菌d株的第三種酶目前四十頁\總數(shù)四十七頁\編于點

限制性核酸內(nèi)切酶的切割方式目前四十一頁\總數(shù)四十七頁\編于點（1）20μl酶切體系：取兩支1.5ml的Ep管，標號，按下表加入試劑，實驗組對照組10×酶解反應液2μl2μl質(zhì)粒DNAupto1μgupto1μgXhoI1μl0μlHindⅢ1μl0μlddH2O至20μl至20μl（2）加樣后，小心混勻，置于37℃水浴中，酶解15min。（3）終止酶解反應：80℃