高效液相色譜分離技術(shù)

生物技術(shù)及應(yīng)用專業(yè)教學(xué)資源庫4.6高效液相色譜分離技術(shù)4.色譜分離技術(shù)高效液相色譜法及特點(diǎn)1高效液相色譜法與經(jīng)典液相色譜法的區(qū)別2高效液相色譜法的分類3高效液相色譜分離方法的選擇依據(jù)4高效液相色譜儀的結(jié)構(gòu)5高效液相色譜分離技術(shù)高效液相色譜法的應(yīng)用6高效液相色譜法及特點(diǎn)高效液相色譜法（highpressureLiquidchromatography，HPLC）是采用高壓輸液泵將規(guī)定的流動相泵入裝有填充劑的色譜柱，對供試品進(jìn)行分離測定的色譜方法。高效液相色譜法的特點(diǎn)：1.高壓2.高效3.高靈敏度4.應(yīng)用范圍廣5.分析速度快、載液流速快高效液相色譜法及特點(diǎn)高效液相色譜法與經(jīng)典液相色譜法的區(qū)別高效液相色譜法經(jīng)典液相色譜法高壓，40～50Mpa填料顆粒小，2～50μm柱效高，40000～60000塊/m分析速度快

色譜柱可重復(fù)多次使用

能在線檢測常壓或減壓

填料顆粒大柱效低分析速度慢色譜柱只用一次不能在線檢測高效液相色譜法的分類按分離原理的不同，高效液相色譜法可分為：1.分配色譜：疏水作用2.吸附色譜：吸附能、氫鍵3.離子交換色譜：庫倫力4.親和色譜：特異親和力5.凝膠色譜：溶質(zhì)分子大小6.離子排斥色譜：Donnan膜平衡7.離子對色譜：疏水作用8.離子抑制色譜：疏水作用9.配位體交換色譜：配合作用10.手性色譜：立體效應(yīng)高效液相色譜分離方法的選擇依據(jù)樣品種類水溶性HPLC分離方法的選擇相對分子質(zhì)量大于2000溶于水空間排阻色譜，水為流動相不溶于水空間排阻色譜，非水為流動相相對分子質(zhì)量小于2000溶于水的離子酸性化合物用陽離子交換色譜堿性化合物用陰離子交換色譜溶于水，不解離反相液-液色譜空間排阻色譜，水為流動相不溶于水同系物用液-液色譜，凝膠色譜異構(gòu)體多官能團(tuán)用液固色譜分子大小差別大用空間排斥色譜高效液相色譜儀的結(jié)構(gòu)

高效液相色譜儀由輸液系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)及數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)五個部分組成。高效液相色譜儀的結(jié)構(gòu)1.輸液系統(tǒng)組成：貯液瓶、脫氣裝置、高壓輸液泵、過濾器、梯度洗脫裝置等。用途：儲存流動相，并將其以高壓形式連續(xù)不斷地送入液路系統(tǒng)。貯液瓶高壓輸液泵高效液相色譜儀的結(jié)構(gòu)2.進(jìn)樣系統(tǒng)包括手動進(jìn)樣器（六通閥）或自動進(jìn)樣器。通常要求具有重復(fù)性好，死體積小，保證中心進(jìn)樣，進(jìn)樣時對色譜柱系統(tǒng)流量波動要小，便于實(shí)現(xiàn)自動化等性能。進(jìn)樣過程引起色譜峰展寬的主要因素有進(jìn)樣體積、進(jìn)樣時間、樣品濃度、進(jìn)樣器死體積，進(jìn)樣技術(shù)等。六通閥高效液相色譜儀的結(jié)構(gòu)3.分離系統(tǒng)即色譜柱，內(nèi)部填充有固定相，是色譜分離系統(tǒng)的核心部分。色譜柱管為內(nèi)部拋光的不銹鋼柱管或塑料柱管，高效液相色譜柱幾乎都是直形。高性能的色譜柱與固定相本身性能、柱結(jié)構(gòu)、裝填和使用技術(shù)有關(guān)。為保證柱溫的穩(wěn)定，一般將色譜柱置于柱溫箱中。色譜柱柱溫箱高效液相色譜儀的結(jié)構(gòu)4.檢測系統(tǒng)用于檢測被分離的各組分。根據(jù)組分特點(diǎn)，選擇適宜的檢測器。常用的檢測器有紫外檢測器、熒光檢測器、示差折光檢測器、質(zhì)譜檢測器等，其中紫外檢測器是HPLC應(yīng)用最普遍的檢測器。紫外檢測器高效液相色譜儀的結(jié)構(gòu)5.數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)由硬件計(jì)算機(jī)和軟件色譜工作站組成。用于數(shù)據(jù)采集、泵及閥控制、數(shù)據(jù)處理、定性定量分析、數(shù)據(jù)存儲、報(bào)告輸出等。數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)高效液相色譜儀的結(jié)構(gòu)高效液相色譜法的應(yīng)用類型主要分離機(jī)理主要分析對象或應(yīng)用領(lǐng)域分配色譜疏水作用有機(jī)化合物分離、分析、制備吸附色譜吸附能、氫鍵異構(gòu)體分離、制備離子交換色譜庫倫力無機(jī)陰離子與陽離子，環(huán)境與食品工程分析親和色譜特異親和力蛋白質(zhì)、酶、抗體分離，生物工程和醫(yī)藥分析凝膠色譜溶質(zhì)分子大小大分子量樣品分離測定，如蛋白質(zhì)和人造聚合物的分離離子排斥色譜Donnan膜平衡有機(jī)離子、弱電解質(zhì)離子對色譜