過敏編制說明

《食品中多種植源性過敏原同步定量確證同位素稀釋質(zhì)譜法（征求意見稿）》編制說明《食品中多種植源性過敏原同步定量確證同位素稀釋質(zhì)譜法》標準編制組二0二三年四月《食品中多種植源性過敏原同步定量確證同位素稀釋質(zhì)譜法》編制說明1項目背景1.1任務(wù)來源根據(jù)浙江省食品學(xué)會關(guān)于2022年度第一批團體標準立項的通知，南開大學(xué)、浙江工商大學(xué)、杭州海關(guān)技術(shù)中心組織起草工作組負責(zé)團體標準《食品中多種植源性過敏原同步定量確證同位素稀釋質(zhì)譜法》草案稿的起草工作，并由浙江省食品學(xué)會歸口。1.2標準制訂工作主要過程2022年10月：提交《食品中多種植源性過敏原同步定量確證同位素稀釋質(zhì)譜法》草案稿2022年12月：召開標準起草工作組會議2023年2月：在全國團體標準信息平臺發(fā)布該標準征求意見稿2023年4月：根據(jù)征求意見對標準進行修改，形成送審稿2023年6月：召開團體標準評審會2023年8月：正式發(fā)布該團體標準1.3與我國法律法規(guī)和其他標準的關(guān)系經(jīng)查新機構(gòu)查新，目前國內(nèi)外沒有相關(guān)的多種過敏原同時定性和定量檢測的技術(shù)標準。國內(nèi)標準：目前過敏原檢測有國家標準GB/T38163-2019《常見過敏蛋白的測定液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)法》和出入境檢驗檢疫行業(yè)標準SN/T5276-2020《口食品中多種過敏原的測定液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)法》出。這兩種方法都是進行單一過敏原的定性檢測，外標法進行定量，準確度和通量都低。即，不能實現(xiàn)對多種過敏原的同步定性和精準定量。其他參考了《AOACSMPR2016.002StandardMethodPerformanceRequirements(SMPRs?)forDetectionandQuantitationofSelectedFoodAllergens》及《食品檢驗操作技術(shù)規(guī)范（理化檢驗）》中的技術(shù)要求。2標準制訂的必要性（標準制訂工作的目的與意義）2.1食物過敏已成為全球廣泛關(guān)注的重大公共衛(wèi)生和食品安全問題食物過敏是人體攝入食物中的某種成分（過敏原或變應(yīng)原）后，機體對其產(chǎn)生的異常免疫反應(yīng)。食物過敏反應(yīng)發(fā)生迅速，微小劑量即可引發(fā)消化問題、蕁麻疹或氣道腫脹等體征和癥狀，有的可導(dǎo)致嚴重癥狀，甚至危及生命。近年來食物過敏已成為全球廣泛關(guān)注的重大公共衛(wèi)生和食品安全問題。一些國外流行病學(xué)調(diào)查研究表明,在世界范圍內(nèi)食物過敏影響近8%的5歲以下兒童和5%的成年人。我國尚沒有全國性的食物過敏發(fā)生率的調(diào)查，但區(qū)域調(diào)查的結(jié)果顯示我國的食物過敏形勢也不容樂觀。如2016對全國31個城市兒童食物過敏調(diào)查情況顯示，0-14歲兒童食物過敏報告率為5.83%，2022年溫州市、江西省調(diào)查顯示兒童過敏報告率分別為12.86%和3.75%等。隨著經(jīng)濟貿(mào)易全球化，食品種類越來越豐富和多樣，食物過敏的發(fā)生率也以每年10%的速度遞增[7]，嚴重影響了易敏人群的身體健康，也給其家庭和社會帶來沉重的負擔(dān)。2.2過敏原定量檢測的必要性針對食物過敏治療，目前尚無完備方案及特效藥，食物過敏聯(lián)盟（FoodAllergyandAnaphylaxisNetwork,FAAN）、美國國家過敏和傳染病研究所（NationalInstituteofAllergyandInfectiousDiseases,NIAID）等的研究結(jié)果均表明，避免接觸或攝入過敏原是防止過敏反應(yīng)發(fā)生的唯一有效途徑。食物過敏原標簽制度是國際公認控制食物過敏的最有效手段，易敏人群通過識別食品標簽規(guī)避對自己有害的食物過敏原。目前，歐美日澳加韓等30多個國家或地區(qū)相繼對食物過敏原標識進行了規(guī)定。我國GB7718-2011《預(yù)包裝食品標簽通則》中也規(guī)定，食品及其制品若可能導(dǎo)致過敏反應(yīng)，需要進行標注。食品標簽準確標注過敏原信息依賴于過敏原精準檢測技術(shù)，所以建立準確的過敏原檢測方法可以為過敏原標識標準實施提供技術(shù)支撐。更重要的是，食物過敏原按“風(fēng)險管理”的方式在國內(nèi)外形成廣泛共識，隨著激發(fā)過敏反應(yīng)的過敏原閾值被逐漸確定，在實際檢測中需要關(guān)于過敏性食品的閾值劑量的準確數(shù)據(jù)（不會在食物過敏人群中引起反應(yīng)的最高水平的過敏原），從而更有效地向消費者傳達這些風(fēng)險。可見，精準、靈敏的過敏原定量檢測技術(shù)可為準確評估食物過敏性風(fēng)險提供技術(shù)基礎(chǔ)。3國內(nèi)外相關(guān)分析方法研究3.1國內(nèi)外現(xiàn)有食物過敏原檢測技術(shù)目前已有多種檢測技術(shù)應(yīng)用于食物中潛在過敏原的檢測，一類是基于蛋白水平的免疫學(xué)檢測技術(shù)，如免疫吸附實驗(radio-allergosorbenttest,RAST)、酶吸附實驗(enzymeallergosorbenttest,EAST)、火箭免疫電泳(rockedimmuno-electrophoresis,RIE)、免疫印跡(immuno-blotting)、酶聯(lián)免疫吸附實驗(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)等。免疫學(xué)方法是目前應(yīng)用最廣的過敏原檢測方法之一，但由于靶蛋白構(gòu)象易受加工過程（熱處理，pH變化，水解等）的影響，檢測結(jié)果往往會出現(xiàn)假陽性或假陰性，準確度較差。另一類是基于基因水平的分子生物學(xué)檢測技術(shù)，包括基聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerasechainreaction,PCR)，實時熒光定量PCR法(quantitativereal-timePCR)以及環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)等。PCR法是間接檢測食物過敏原，難以反應(yīng)過敏原蛋白的真實情況，具有一定的局限性。此外，隨著檢測新技術(shù)和新裝備的發(fā)展，針對食物過敏原已有不少儀器檢測技術(shù)，如,生物傳感器，納米材料等。而質(zhì)譜分析技術(shù)以高分辨率、高靈敏度、高通量等優(yōu)勢，在食物過敏原的識別、表征以及定量等研究領(lǐng)域發(fā)揮了巨大的作用，成為近年來的研究熱點，被認為是過敏原精準定量檢測的有力技術(shù)手段。3.2同位素稀釋質(zhì)譜法的優(yōu)越性同位素稀釋質(zhì)譜法（Isotopedilutionmassspectrometry，IDMS）被國際計量組織定為基準方法，是唯一能直接提供微量、痕量和超痕量量值的權(quán)威方法[11,12]。也被定為國際上食品安全檢測最權(quán)威的仲裁檢測方法，可實現(xiàn)復(fù)雜食品基質(zhì)中目標物精準定量的重要確證技術(shù)，通過將已知質(zhì)量和豐度的穩(wěn)定同位素標記物加入到待測樣品中，可有效校正檢測過程中的基質(zhì)效應(yīng)[13]。該技術(shù)以篩選到的靶蛋白特征肽段為待檢目標物，對應(yīng)的同位素標記定量特征肽段為內(nèi)標。由于目標待測物質(zhì)與其同位素標記物在樣本前處理，后期的色譜分離、離子化、質(zhì)譜分析的整個過程在一起，過程中各因素影響程度相同，因此可以將各類誤差降至最低，具有較高的準確度。3.3現(xiàn)有質(zhì)譜法檢測食物致敏原存在的問題在現(xiàn)代化的飲食模式中，加工類食品已成為主要的食品消費模式。目前針對食物過敏原的IDMS方法多是基于單一未加工過敏食物如花生、大豆、雞蛋、牛奶、榛子等建立的，與實際檢測的復(fù)雜加工食品（面包、餅干、豆瓣醬、魚丸蝦丸等）或餐飲食品（沙拉、三明治等）不同。相較于未加工的過敏性食物，加工食品中的過敏原具有復(fù)雜性、多樣性和痕量性的特征，對過敏原的精準定量檢測技術(shù)提出了更高的要求。首先，加工食品中組分眾多，基質(zhì)效應(yīng)更加復(fù)雜。且食品加工過程（高溫、美拉德反應(yīng)、低PH等）會對過敏原的結(jié)構(gòu)等信息產(chǎn)生較大影響，從而影響過敏原的可檢測性[14]。有研究將6種食物過敏原加入巧克力和奶粉基質(zhì)，質(zhì)譜掃描分析結(jié)果也可以看到：在兩種基質(zhì)中，檢測到的肽段數(shù)量和種類顯著不同。鑒于加工食品中過敏原的復(fù)雜性，對篩選的特征肽段提出了更高的要求，用于檢測的過敏原特征肽段需較少受基質(zhì)效應(yīng)和加工過程的影響。其次，加工食品中往往含有不止一種的食物過敏原，如堅果面包就同時含有小麥、雞蛋、牛奶、堅果等過敏物質(zhì)。冰淇淋中同時含有牛奶、雞蛋、堅果等過敏性食物。由于絕大多數(shù)的加工食品都同時含有多種過敏原，具有多樣性的特點，因此，高通量的檢測方法極具優(yōu)勢，可大大提高檢測效率。同時，食品加工環(huán)境復(fù)雜，鏈條長，在加工制造過程中因共用加工生產(chǎn)線、共用存儲空間等原因而常常存在“痕量”的“cross-contact”。由于極少量的（mg級）食物過敏原即可激發(fā)過敏反應(yīng)[9]，所以加工食品中隱蔽的痕量過敏原極具危險性，潛在風(fēng)險較大。因此過敏原的檢測方法應(yīng)具有較高的靈敏度，以便能夠準確的檢測出潛在的痕量過敏原。3.4本標準應(yīng)用方法的目的和意義建立過敏原精準、靈敏、高通量的檢測方法具有重要的應(yīng)用價值，是保障過敏原標識標準順利實施、準確評估食品中的過敏原風(fēng)險、保障我國食品安全和大眾健康的技術(shù)手段和必然要求，具有良好的應(yīng)用前景。從應(yīng)用場景“復(fù)雜加工食品”出發(fā)建立食物過敏原的確證檢測技術(shù)，建立一種可以同時對食品中多種過敏原定性和定量的檢測方法。其特點一方面可以實現(xiàn)多重檢測，通量高，可同時對食物中多種植源性過敏原（小麥、大豆、花生、榛子、核桃、杏仁、腰果和芝麻）檢測；特點二是既能定性，同時又能絕對定量，且內(nèi)標法的準確度遠高于外標法。用該方法進行食物過敏原的檢測既能提質(zhì)（準確性高），其多重檢測的特點又使得其檢測效率提高，檢測成本下降，達到了降本增效的目的。4標準查一下，是制訂，還是制訂。通篇改一下制訂的基本原則和技術(shù)路線查一下，是制訂，還是制訂。通篇改一下4.1標準制訂原則根據(jù)《中華人民共和國食品安全法》及其實施條例等有關(guān)法律法規(guī)，按GB/T1.1-2020的編寫原則進行編寫。以加強海藻纖維衛(wèi)生安全為原則，深入調(diào)查研究，保證起草工作的科學(xué)性、規(guī)范性和可操作性。（一）可操作性原則本文件制訂過程中根據(jù)可操作性的原則，結(jié)合實際情況，對文件內(nèi)容進行科學(xué)設(shè)定。為生產(chǎn)企業(yè)、檢測單位、市場監(jiān)督等部門提供科學(xué)管理的依據(jù)。（二）與國內(nèi)外標準協(xié)調(diào)一致原則在制訂過程中，起草組按照食品安全標準《標準化工作導(dǎo)則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》（GB/T1.1-2020）中的原則要求進行編寫。仔細查閱國內(nèi)外的相關(guān)標準，根據(jù)實際情況，確定了團標的框架結(jié)構(gòu)和各項技術(shù)內(nèi)容要求。（三）公開透明的原則起草過程中堅持公開、透明的原則，除召開專家座談會聽取意見外，還將向社會公開廣泛征求意見，如來自行業(yè)協(xié)會、檢測機構(gòu)、生產(chǎn)企業(yè)以及食品安全監(jiān)督管理部門等各方意見，并吸收和采納部分意見。4.2標準制訂的技術(shù)路線技術(shù)路線見下圖。圖SEQ圖\*ARABIC1標準制訂的技術(shù)路線示意圖5方法研究報告5.1方法研究的目標本標準規(guī)定了加工食品中小麥、大豆、花生、榛子、核桃、杏仁、腰果和芝麻過敏原定量確證液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。本標準適用于餅干、巧克力、冰淇淋、早餐谷物、奶制品等食品基質(zhì)中小麥、大豆、花生、榛子、核桃、杏仁、腰果和芝麻過敏蛋白的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定和確證。5.2規(guī)范性引用文件在規(guī)范性引用文件中，根據(jù)要求和管理引用了相關(guān)國家標準等文件。5.3術(shù)語和定義、縮略語明確了食物過敏、過敏原、過敏蛋白、多肽、特征肽段等定義規(guī)定了下列縮略語適用于本文件。DTT：二硫蘇糖醇（dithiothreitol）IAA：碘代乙酰胺（iodoacetamide）IDMS：同位素稀釋質(zhì)譜法（theisotopedilutionmassspectrometry）LC-MS：液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（liquidchromatography-tandemmassspectrometry）PRM：平行反應(yīng)檢測（parallelreactionmonitoring）Tris：三羥甲基氨基甲烷[tris（hydroxymethyl）aminomethane]5.4原理利用質(zhì)譜技術(shù)篩選出過敏原特征肽段。利用同位素標記特征肽段（重標肽段）和目標特征肽段（輕標肽段）具有相同的理化性質(zhì)的特點，以同位素標記肽段為內(nèi)標，建立輕標肽段與重標肽段豐度比與過敏原含量的線性關(guān)系，內(nèi)標法定量。5.5主要試劑及試劑配制根據(jù)實驗確定食物中多種植源性過敏原同步定量確證同位素稀釋質(zhì)譜法所需的試劑5.6主要儀器及設(shè)備根據(jù)實驗確定了主要儀器及設(shè)備：液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：UHPLC和配有HESI源的obitrap高分辨率質(zhì)譜；分析天平：測量精度為0.0001g；恒溫水浴鍋；離心機：轉(zhuǎn)速不低于12000g；組織研磨器；各規(guī)格移液器；pH計：測量精度為0.01；真空離心濃縮儀；注射器和0.22μm的水系濾膜（聚醚砜濾膜）；酶標儀。5.7試樣制備和保存5.7.1標準溶液制備及保存因難以購買到標準物質(zhì)，實驗中以摩爾濃度處理，肽段濃度與靶蛋白同摩爾濃度，以此定量。實驗用到的特征肽段和重標特征肽段均要求純度大于98%。目標肽段，也稱輕標肽段，為不含同位素標記氨基酸的各肽段。目標肽段用0.1%的甲酸溶液配置成106fmol/μL的儲備液，每管分裝成10μL，在-80℃長期凍存。使用時每次使用一管，不重復(fù)使用。內(nèi)標肽段，也稱重標肽段，為對應(yīng)的含有同位素標記氨基酸的肽段。重標肽段也使用0.1%的甲酸溶液配置成106fomol/μL儲備液，每管分裝成10μL，在-80℃長期凍存；使用時每次使用一管，不重復(fù)使用。5.7.2基質(zhì)溶液制備及保存超市購買面粉、巧克力、冰淇淋、麥片、餅干、早餐谷物粉等產(chǎn)品，參照其配料表含有的成分，同時提取總蛋白并酶解后（詳細步驟同8.1試樣前處理），進行質(zhì)譜掃描，采用fullMS-ddMS2掃描模式，確認其含有的蛋白成分。參照AOACSMPR2016.002要求的基質(zhì)，且不含目標蛋白的基質(zhì)用于肽段稀釋?；|(zhì)參照其說明書的保存條件密封保存；提取的蛋白用Bradford方法測定提取液中總蛋白的濃度，提取液置于-20℃冰箱內(nèi)保存。質(zhì)譜分析前的酶解產(chǎn)物用肽段定量試劑盒進行定量，并置于-80℃冰箱內(nèi)保存。在制樣的操作過程中，應(yīng)防止樣品受到污染或發(fā)生殘留物含量的變化。5.8分析步驟5.8.1試樣前處理5.8.1.1蛋白提取、還原、烷基化和酶解1）2-3g的食品樣本充分研磨后，稱量3g放入50mL離心管中，加入20mL300mMTris（pH9.2）、2M尿素，20℃震蕩溫浴30min，90℃水浴10min。2）5000g離心10min。3)取1mL上清用1mL溶解buffer（200mM的NH3HCO3，pH8.2）稀釋。選做步驟：取10μL上清跑SDS；用蛋白定量試劑盒蛋白濃度。4）加入40μL的500mM的DTT，75℃溫育30min；80μL500mM的IAA（避光），室溫溫育30min。5）加入100μL的1%的胰酶乙酸溶液，37℃過夜。6）次日，3000g離心30秒，取上清在90℃孵育10min，終止酶解。7）12000g離心30min，取上清（底部多留一些，上清取500μL足夠）。5.8.1.2脫鹽用MonoSpinC18脫鹽柱（GLSciencesInc.）或其他等同產(chǎn)品進行脫鹽，方法參見產(chǎn)品說明書。簡述為：1）調(diào)節(jié)樣本pH值：樣本用甲酸調(diào)節(jié)pH約為3-4。2）condition柱子：加入200μL的乙腈，5000g離心1min。加入200μL0.1%的甲酸，5000g離心1min。3）上樣：將樣本加入柱子上，5000g離心1-2min。4）加入300μL0.1%的甲酸，5000g離心1min。5）將柱子放入回收管內(nèi)，加入300μL80%的乙腈（含0.1%甲酸），5000g離心1-2min。離心所得溶液即為脫鹽后的肽段。5.8.1.3真空懸干用真空濃縮儀懸干脫鹽后的肽段。5.8.6.4上樣前處理上樣前用500μL0.1%的色譜純甲酸回溶懸干后的肽段，12000g離心30min或過0.22μm的PES濾膜。質(zhì)譜掃描前建議用肽段定量試劑盒確定肽段濃度，根據(jù)質(zhì)譜要求適量上樣。5.8.2標準曲線繪制5.8.2.1輕標肽段系列標準溶液制備取輕標肽段的儲存液用不含目標肽段的食物基質(zhì)制備得到的胰酶酶解物稀釋至2500，1000，500，250，100，50，25，10，5，2.5，1，0.5，0.25fmol/μL的標準濃度。5.8.2.2重標肽段溶液的制備向上述輕標肽段系列標準溶液中加入固定量的重標肽段，最終小麥重標濃度為100fmol/μL，杏仁重標肽段濃度為200fmol/μL，其余重標肽段濃度均為50fmol/μL。5.8.2.3LC-MS檢測取10μL上述配置好的系列標準溶液，進行LC-MS檢測，采用PRM掃描模式。條件參考8.3儀器參考條件部分。5.8.2.4結(jié)果計算輕標肽段和重標肽段產(chǎn)物離子的面積，從而得出豐度比與輕標濃度對應(yīng)關(guān)系的標準曲線，并得到最低定量限（S/N=10時的最低濃度）。5.8.3儀器參考條件5.8.3.1液相色譜條件儀器：ThermoScientic?VanquishBinaryFlexUHPLC或相當者。其中ThermoScientic?VanquishBinaryFlexUHPLC型號的UHPLC包含以下組件：SystemBaseVanquishFlex(P/NVF-S01-A)；BinaryPumpF(P/NVF-P10-A-01)；SplitSamplerFT(P/NVF-A10-A)；ColumnCompartmentH(P/NVH-C10-A)；MSConnectionKitVanquish(P/N6720.0405)；VanquishFPumps100μLMixerSet(P/N6044.5100)；VanquishSplitSamplerHTSampleLoop,100μL(P/N6850.1913)分離條件：流動相A:0.1%甲酸/水;流動相B:0.1%甲酸/乙腈色譜柱:Shim-packGISS-HPC18(metalfreecolumn)3.0μm,2.1mm*150mm(P/N:227-30924-03)柱溫：40℃，stillair液相色譜梯度見表1。表1高效液相色譜梯度洗脫程序Time（min）Flowrate（mL/min）%A%B00.29010300.26040310.21090360.21090370.29010420.290105.8.3.2質(zhì)譜條件質(zhì)譜儀器：ThermoScienticTMQExactive或相當者。質(zhì)譜源參數(shù)：表2。表2掃描所選的質(zhì)譜源參數(shù)Sheathgasflowrate35Auxgasflowrate10Sweepgasflowrate0Sprayvoltage3.8kVCapillarytemp320℃S-lensRFlevel55.0Auxgasheatertemp350℃掃描模式：PRM。掃描條件：見表3，表4和表5。表3PropertiesofthemethodGlobalsettingUserroleStandUselockmassesOffChrom.peakwidth(FWHM)5sTimeMethodduration42minGeneralruntime0to42minPolaritypositiveDefaultchargestate2Inclusion2MS2Resolution70,000AGCtarget1e6MaximumIT100msIsolationwindow1.6m/zFixedfirstmass-(N)CE/stepped(N)CE27表4PropertiesofPRM表5inclusionlist設(shè)置Mass（m/z）CS(z)PolarityStart[min]End[min]479.610003positive11.4513.45481.943003positive11.4513.45525.793002positive13.7115.71528.793002positive13.7115.71560.786002positive8.4810.48563.786002positive8.4810.48571.800002positive11.8613.86574.800002positive11.8613.86576.288002positive5.977.97579.288002positive5.977.97678.847002positive7.299.29682.347002positive7.299.29684.355003positive14.6016.60687.688003positive14.6016.60713.433402positive19.2021.20716.433402positive19.2021.20849.968002positive20.1622.16852.968002positive20.1622.165.8.4測定5.8.4.1定性和定量測定該方法能同時完成定性和絕對定量。按8.1試樣前處理的步驟對樣本進行處理，除了在胰酶酶解步驟后加入和標準曲線繪制時等量的重標肽段。采用和標準曲線繪制時同樣的液相色譜條件和質(zhì)譜條件進行掃描。用和標準曲線繪制時一樣的參數(shù)進行數(shù)據(jù)處理，得到輕標肽段和重標肽段的豐度比。每例樣本進行三個平行實驗。待測物質(zhì)的保留時間，與重標肽段的保留時間偏差在±2.5％之內(nèi)，且樣本中所選肽段定性離子均出現(xiàn)（附錄Ａ中表A.1），則樣本中含有相應(yīng)的主要過敏原。根據(jù)內(nèi)標法原理，將測得的產(chǎn)物離子峰的豐度比值代入基質(zhì)相近的標準曲線，得到樣本中含有的過敏原的絕對數(shù)量。對于同時有多個特征肽段的過敏原物質(zhì)，應(yīng)根據(jù)質(zhì)譜響應(yīng)選擇最佳肽段用于定量，其余肽段用于輔助過敏原物質(zhì)定性。5.8.4.2空白實驗除不加試樣外，均按以上操作步驟進行。5.9結(jié)果計算和表述試樣中過敏原物質(zhì)的含量按式（1）進行計算，計算結(jié)果保留兩位有效數(shù)字。C=C=X×V×Mm×106……………（1）式中：C——試樣中被測組分的含量，單位為毫克每千克（mg/kg）；X——從標準工作曲線得到的被測組分溶液濃度，單位為飛摩爾每微升（fmol/μL）；V——樣品定容體積，單位為毫升（mL）；M——過敏原蛋白的分子量，單位為千克每摩爾（kg/mol）;m——樣品稱樣量，單位克（g）。5.9.1精密度在重復(fù)性條件下，獲得的三次獨立測定結(jié)果差值的絕對值，不得超過其算術(shù)平均值的20％。5.9.2線性和定量限通過實驗確定不同基質(zhì)中的定量標準曲線、線性范圍及定量限5.9.3回收率通過實驗確定不同基質(zhì)中添加濃度水平各待測過敏原的回收率范圍6方法驗證6.1方法驗證方案參考了《AOACSMPR2016.002StandardMethodPerformanceRequirements(SMPRs?)forDetectionandQuantitationofSelectedFoodAllergens》及《食品檢驗操作技術(shù)規(guī)范（理化檢驗）》中的方法驗證要求，在3家有資質(zhì)的實驗室進行準確度和精密度驗證。具體驗證方案如下：方法準確度：樣品中加入標準品，通過加標實驗計算回收率。6.2方法驗證的主要過程驗證方案設(shè)計；建立質(zhì)量檢驗要求；選定分析人員和單位；樣品的統(tǒng)一制備；數(shù)據(jù)記錄、處理；最后報告結(jié)果。被委托機構(gòu)按照委托方提供的驗證方法，結(jié)合已有的設(shè)備儀器情況進行驗證，具體方法見方法研究報告。6.3方法驗證結(jié)果經(jīng)驗證，該方法符合標準要求，回收率在60-120%之間。表6肽段回收率項目加標量理論Arearatio實際Arearatio回收率%（實際Arearatio-截距/理論Arearatio-截距平均回收率fmol/μL榛子TNDNAQISPLAGR2.50.01750.0125571.51%71.51%0.0125571.51%250.20450.2035599.51%98.04%0.1975596.58%2502.08351.9945595.73%96.66%2.0335597.60%榛子ADIYTEQVGR2.50.05340.052498.13%97.19%0.051496.25%250.66240.653498.64%99.09%0.659499.55%2506.64146.565498.86%98.76%6.552498.66%核桃ISTVNSHTLPVLR2.50.04350.041595.40%94.25%0.040593.10%250.46950.437593.18%96.38%0.467599.57%2504.58154.514598.54%96.70%4.346594.87%杏仁GNLDFVQPPR2.50.01630.012375.46%72.39%0.011369.32%250.21230.199393.88%94.58%0.212395.29%2502.11332.081398.49%98.39%2.077398.30%腰果ADIYTPEVGR2.50.08200.060073.16%76.82%0.066080.48%250.70800.666094.07%94.35%0.670094.63%2506.80706.625097.33%98.07%6.726098.81%芝麻AFYLAGGVPR2.50.07980.069887.47%88.10%0.070888.72%250.80580.777896.53%97.52%0.793898.51%2507.47287.459899.83%98.34%7.237896.86%大豆VLIVPQNFVVAAR250.47110.431191.51%92.25%0.438193.00%2505.01114.915198.08%98.09%4.916198.10%花生RPFYSNAPQEIFIQQGR2.50.13420.110282.12%86.22%0.121290.31%250.42020.417299.29%97.62%0.403295.95%2502.64122.482293.98%99.37%2.6002104.75%小麥2506.9475.48179.0%78.92%YFIALPVPSQPVDPR5.48878.9%牛奶TPEVDDEALEK250.20420.192295.05%97.04%0.202299.02%2502.83822.629292.64%97.29%2.6802101.94%牛奶HQGLPQEVLNENLLR2.50.00870.006777.02%88.51%0.0087100.00%250.13070.111785.46%91.97%0.128798.47%2501.70271.686799.06%97.68%1.639796.30%雞蛋GGLEPINFQTAADQAR2.50.08370.080796.42%96.42%250.33370.276782.92%85.02%0.290787.12%2504.06173.848794.76%95.65%3.921796.55%蝦蟹AISNAEGEVAALNR250.27160.244690.06%100.34%0.2706110.63%2503.35163.317698.99%97.96%3.248696.93%魚TIDDLEDELYAQK250.03530.030385.83%85.83%2500.66730.606390.86%89.88%0.593388.91%7標準實施建議本方法的過敏原特征肽段作為“內(nèi)標試劑”，形成的高通量定量確證方法可以推廣應(yīng)用于國家及省市食品安全風(fēng)險評估中心或監(jiān)測中心對食品過敏原的國檢、法檢中。還可應(yīng)用于企業(yè)對產(chǎn)品的過敏原篩查及污染源追溯之中。此外，隨著國際上30多個國家或地區(qū)出臺了過敏原標簽標識的規(guī)定，本研究形成和建立的食品中多過敏原的高通量定量檢測技術(shù)，還可應(yīng)用于食品加工企業(yè)的委托檢驗，以便準確進行標簽標識，避免因過敏原標識錯誤而導(dǎo)致的產(chǎn)品撤回和召回，保證進出口食品貿(mào)易順利進行。8參考文獻[1]LopesJP,SichererS.Foodallergy:epidemiology,pathogenesis,diagnosis,prevention,andtreatment.CurrOpinImmunol.2020Oct;66:57-64.

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（避光），室溫溫育30min。（5）加入100μL的1%的胰酶乙酸溶液，37℃過夜。（6）次日，3000g離心30秒，取上清在90℃孵育10min，終止酶解。（7）12000g離心30min，取上清（底部多留一些，上清取500μL足夠）。脫鹽用MonoSpinC18脫鹽柱（GLSciencesInc.）或其他等同產(chǎn)品進行脫鹽，方法參見產(chǎn)品說明書。簡述為：（1）調(diào)節(jié)樣本pH值：樣本用甲酸調(diào)節(jié)pH約為3-4。（2）condition柱子：加入200μL的乙腈，5000g離心1min。加入200μL0.1%的甲酸，5000g離心1min。（3）上樣：將樣本加入柱子上，5000g離心1-2min。（4）加入300μL0.1%的甲酸，5000g離心1min。（5）將柱子放入回收管內(nèi)，加入300μL80%的乙腈（含0.1%甲酸），5000g離心1-2min。離心所得溶液即為脫鹽后的肽段。真空懸干用真空濃縮儀懸干脫鹽后的肽段。上樣前用500μL0.1%的色譜純甲酸回溶懸干后的肽段，12000g離心30min或過0.22μm的PES濾膜。質(zhì)譜掃描前建議用肽段定量試劑盒確定肽段濃度，根據(jù)質(zhì)譜要求適量上樣。標準曲線繪制輕標肽段系列標準溶液制備：取輕標肽段的儲存液用不含目標肽段的食物基質(zhì)制備得到的胰酶酶解物稀釋至2500，1000，500，250，100，50，25，10，5，2.5，1，0.5，0.25fmol/μL的標準濃度。重標肽段溶液的制備：向上述輕標肽段系列標準溶液中加入固定量的重標肽段，最終小麥重標濃度為100fmol/μL，杏仁重標肽段濃度為200fmol/μL，其余重標肽段濃度均為50fmol/μL。取10μL上述配置好的系列標準溶液，進行LC-MS檢測，采用PRM掃描模式。條件參考8.3儀器參考條件部分。計算輕標肽段和重標肽段產(chǎn)物離子的面積，從而得出豐度比與輕標濃度對應(yīng)關(guān)系的標準曲線，并得到最低定量限（S/N=10時的最低濃度）。儀器參考條件液相色譜條件儀器：ThermoScienticUltimateTM3000UHPLC。其中ThermoScienticUltimateTM3000UHPLC型號的UHPLC包含以下組件:SRD-3600(P/N5035.9230)；HPG-3400RS(P/N5040.0046);WPS-3000TRS(P/N5340.0020);TCC-3000RS(P/N5730.0000);分離條件：流動相A:0.1%甲酸/水;流動相B:0.1%甲酸/乙腈色譜柱:Shim-packGISS-HPC18(metalfreecolumn)3.0μm,2.1mm*150mm(P/N:227-30924-03)柱溫：40℃，stillair液相色譜梯度見表2。表2，高效液相色譜梯度洗脫程序Time（min）Flowrate（mL/min）%A%B00.29010300.26040310.21090360.21090370.29010420.29010質(zhì)譜條件質(zhì)譜儀器：ThermoScienticTMQExactive或相當者。質(zhì)譜源參數(shù)：表3。表3，掃描所選的質(zhì)譜源參數(shù)Sheathgasflowrate35Auxgasflowrate10Sweepgasflowrate0Sprayvoltage3.8kVCapillarytemp320℃S-lensRFlevel55.0Auxgasheatertemp350℃掃描模式：PRM。掃描條件：見表4-1，表4-2和表4-3。表4-1，PropertiesofthemethodGlobalsettingUserroleStandUselockmassesOffChrom.peakwidth(FWHM)5sTimeMethodduration42min表4-2，PropertiesofPRMGeneralruntime0to42minPolaritypositiveDefaultchargestate2Inclusion2MS2Resolution70,000AGCtarget1e6MaximumIT100msIsolationwindow1.6m/zFixedfirstmass-(N)CE/stepped(N)CE27表4-3，inclusionlist設(shè)置Mass（m/z）CS(z)PolarityStart[min]End[min]479.610003positive10.8012.80481.943003positive10.8012.80525.793002positive13.1515.15528.793002positive13.1515.15560.786002positive8.0610.06563.786002positive8.0610.06571.800002positive11.2813.28574.800002positive11.2813.28576.288002positive5.907.90579.288002positive5.907.90678.847002positive7.079.07682.347002positive7.079.07684.355003positive13.9315.93687.688003positive13.9315.93713.433402positive18.6020.60716.433402positive18.6020.60849.968002positive19.6321.63852.968002positive19.6321.63587.322003positive14.8316.83589.322003positive14.8316.83623.297002positive5.817.81626.790002positive5.817.81844.420002positive13.6915.69849.420002positive13.6915.69518.250003positive13.8415.84520.916003positive13.8415.84707.868002positive8.9010.90711.368002positive8.9010.90測定定性和定量測定該方法能同時完成定性和絕對定量。按5