Trizol法提取RNA實驗步驟

Trizol法使用步驟一、分離純化的基本原理研究基因的表達(dá)和調(diào)控時常常要從組織和細(xì)胞中分離和純化RNA;RNA質(zhì)量的高低常常影響cDNA庫,RT-PCR和NorthernBlot等分子生物學(xué)實驗的成敗;Trizol是一種新型總RNA抽提試劑，內(nèi)含異硫氰酸胍等物質(zhì),能迅速破碎細(xì)胞,抑制細(xì)胞釋放出的核酸酶;二、用戶需自備的試劑和材料無水乙醇、氯仿、Glycogen可能需要、 Eppendorf管RNase-free、TipsRNase-free三、準(zhǔn)備工作RNase酶非常穩(wěn)定,是導(dǎo)致RNA降解最主要的物質(zhì)；它在一些極端的條件可以暫時失活,但限制因素去除后有迅速復(fù)性;用常規(guī)的高溫高壓蒸氣滅菌方法和蛋白抑制劑都不能是RNase完全失活;它廣泛存在于人的皮膚上,因止匕在與RNA制備有關(guān)的分子生物學(xué)實驗時,必須戴手套；RNase的又一污染源是取液器,根據(jù)取液器制造商的要求對取液器進(jìn)行處理;一般情況下采用用DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的內(nèi)部和外部,基本達(dá)到要求;取RNase-free的物品時必須戴手套；料制品的處理盡可能使用無菌，一次性塑料制品，已標(biāo)明RNase-Free的塑料制品，如沒有開封使用過通常沒有必要再次處理;對于國產(chǎn)塑料制品,原則上都必須處理方可使用;處理步驟如下：1在玻璃燒杯中注入去離子水,加入DEPC使DEPC的終濃度為％;注意：DEPC為劇毒物,活性很強(qiáng),小心在通風(fēng)柜中使用;2處理的塑料制品放入一個可以高溫滅菌的容器中，注入DEPC水溶液,使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中;3在通風(fēng)柜中室溫處理過夜;4將DEPC水溶液小心倒到廢液瓶中，用鋁箔封住含已DEPC水處理過的塑料制品的燒杯,高溫高壓蒸氣滅菌至少30分鐘;5烘箱用合適的溫度烘拷至干燥;置于干凈處備用;璃玻和金屬物品250°C烘烤3小時以上;四、從組織中提取總RNA1液氮研磨：組織塊直接放入研缽中,加入少量液氮,迅速研磨,待組織變軟，再加少量液氮，再研磨，如此三次,按50-100mg組織/mlTrizol加入Trizol,轉(zhuǎn)入離心管進(jìn)行第2步操作；2勻漿：組織樣品按50-100mg/mlTrizol加入。1%^;另外，組織體積不能超過Trizol體積的10%,否則勻漿效果會不好，用電動勻漿器充分勻漿約需1-2分鐘;五、從細(xì)胞中提取總RNA1培養(yǎng)貼壁細(xì)胞：不須消化，可直接用丁三％^進(jìn)行消化、裂解,Trizol體積按10cm2/ml比例加入；2懸浮細(xì)胞可直接收集、裂解，每1mlTrizol可裂解5X106動物、植物或酵母細(xì)胞,或107細(xì)菌細(xì)胞;六、操作步驟1、細(xì)胞或組織加Trizol后，室溫放置5min,使其充分裂解;注：此時可放入-70℃長期保持;2、12,000rpm離心5山皿,棄沉淀；3、按200ul氯仿/mlTriz。l加入氯仿,振蕩混勻后室溫放置15min;注：禁用漩渦振蕩器，以免基因組DNA斷裂；4、4℃12,0008離心15山皿；5、吸取上層水相,至另一離心管中;注：千萬不要吸取中間界面；若同時提取DNA和蛋白質(zhì)，則保留下層酚相存于4℃冰箱,若只提RNA,則棄下層酚相;6、按異丙醇/mlTrizol加入異丙醇混勻，室溫放置5T0min;7、4℃12,0008離心10山皿,棄上清,RNA沉于管底；8、按1ml75%乙醇/mlTrizol加入75%乙醇，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀;9、4℃8,0008離心5山也,盡量棄上清；10、室溫晾干或真空干燥5T0min;注：RNA樣品不要過于干燥,否則很難溶解;11、可用50ulHO,TE6口￡￡?1或％5口5溶解RNA樣品，55-60℃,5T0min;注：H0、1￡或%5口5均須用DEPC處理并高壓；212、測值定量RNA濃度;注：此方法提取RNA./%0值在之間；產(chǎn)率估計：組織標(biāo)本:ugRNA/mg組織1-10ug,培養(yǎng)細(xì)胞ugRNA/106Cell：5-15ug;注：組織或細(xì)胞量過少，可酌情減少Trizol用量；組織或細(xì)胞用量過多,會引起DNA對RNA的污染；高蛋白、脂肪或多糖類組織,肌肉組織或塊狀植物組織等,組織勻漿或液氮研磨后須4℃12,000g離心10山皿去掉不溶物,再進(jìn)行下面操作,若頂層有脂肪物,則也須去掉；熱天提RNA,帶手套是必須的,手是RNase的主要來源；組織塊用液氮研磨,效果最好,若沒有液氮或電動勻漿器,可用手動勻漿器代替,此時組織塊不宜過大,且需先用眼科剪刀將組織堿堿剪碎,然后再充分研磨;肝臟、腸道、肌肉總RNA提取方法①使用已高溫蒸汽滅菌的手術(shù)刀和鑷子從魚的腹部解剖開，從中取出完整的肝臟、腸、肌肉等組織,置于離心管后立即放入液氮中；②組織在液氮下研磨成粉,取少量至加有ImLTrizol的離心管中,充分混合后于4℃,12,000rpm離心15min；③取上清移至新離心管中,加入200ul氯仿，劇烈震蕩直至呈乳白色，于4c12,000rpm離心15min；④取上清移至新離心管中，加入500ul異丙醇，輕輕顛倒10次，冰上放置20mins,于4℃,12,000rpm離心15min；⑤棄上清,加入1ml75%乙醇用DEPC水現(xiàn)配現(xiàn)用，于4℃,12000rpm離心5min,重復(fù)此步驟一次；⑥棄上清后,室溫干燥5-7mins；⑦加入適量20-30ul的DEPC水溶解沉淀65℃溶解,-20℃最好-80℃保存，檢測RNA濃度,并電泳檢測;RNA濃度測定和電泳檢測取2ul提取好的RNA溶液,于Nanodrop2000Spectrophptpmeter測定RNA濃度及A260/A280的相對吸光度，純凈RNA的A260/A280應(yīng)在之間；電泳檢測：1%瓊脂糖,1XATE緩沖液,90V電泳30min,凝膠成像系統(tǒng)觀察，分析結(jié)果；

肝臟、肌肉、腸道樣品cDNA的合成反應(yīng)按照TaKaRa公司的PrimeScript?RTreagentKitWithgDNAEraserPerfectRealTime反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行，合成cDNA模板；①基因組DNA的除去反應(yīng)，在PCR管中配置如下緩沖液；試劑 用量TOC\o"1-5"\h\z5xgDNAEraserBuffer p!gDNAEraser plTotalRNA XulRNaseFreedH2O upto10plX：根據(jù)檢測到的RNA濃度來配置；混合均勻后,室溫放置20-30min②反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，在PCR管中配置如下緩沖液20ulsystem,反應(yīng)液配制在冰上進(jìn)行;為了保證反應(yīng)液配制的準(zhǔn)確性，進(jìn)行各項反應(yīng)時,先按反應(yīng)數(shù)+1的量配制MasterMix,然后再分裝到每個反應(yīng)管中；5xPrimeScript?Buffer2forRealTime

PrimeScript?RTEnzymeMixI

RTPrimerMix

①的反應(yīng)液

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P