幾種菌種的保存及復蘇方法

令狐采學創(chuàng)作幾種菌種的保管及蘇醒辦法（含擴增辦法）按期移植法，亦稱傳代培養(yǎng)收藏法，包含斜面培養(yǎng)、穿刺培養(yǎng)、液體培養(yǎng)等。是指將菌種接種于適宜的培養(yǎng)基中，最適條件下培養(yǎng)，待生長充分后，于4?6℃進行保管并間隔一按時間進行移植培養(yǎng)的菌種收藏辦法。操縱步調(diào)如下：1培養(yǎng)基制備器皿準備培養(yǎng)基制備過程中所用的一些玻璃器皿，如三角瓶、試管、培養(yǎng)皿、燒杯、吸管等，經(jīng)洗滌、干燥、包裝、滅菌后使用。溶解培養(yǎng)基配料先在燒杯中放適量水，按培養(yǎng)基配方稱取各項資料，依次將緩沖化合物、主要元素、微量元素、維生素等資料加入水中溶解，最后加足水量，攪拌均勻。調(diào)pH值配料溶解后將培養(yǎng)基冷卻至室溫，根據(jù)要求加稀酸（0.1mol/L鹽酸）或稀堿（10%氫氧化鈉）調(diào)pH值。加酸或堿液時要緩慢、少量、屢次攪拌，避免局部過堿或過酸而招致丈量禁絕確和營養(yǎng)成分被破壞。加凝固劑配制固體培養(yǎng)基時需加凝固劑，如瓊脂、明膠等。將凝固劑加入液體培養(yǎng)基中，加熱其實不竭攪拌至融解，再補足令狐采學創(chuàng)作令狐采學創(chuàng)作所蒸發(fā)水分。過濾分裝在二層紗布中間夾入脫脂棉，將配好的培養(yǎng)基趁熱過濾并分裝。斜面培養(yǎng)基分裝量約為試管高度的四分之一（4?5mL）,穿刺培養(yǎng)基分裝量以試管高度的二分之一為宜。分裝過程中勿使培養(yǎng)基沾污管口，以免弄濕棉塞造成污染。包扎標識表記標幟將試管加棉塞，外面包扎一層牛皮紙或鋁箔并注明培養(yǎng)基名稱及配制日期。滅菌根據(jù)要求將培養(yǎng)基滅菌，通常蒸汽滅菌為121℃,15?20mino斜面擺放滅菌后及時擺放斜面，斜面長度不超出試管管長的二分之一為宜。無菌檢查將滅菌的培養(yǎng)基放入培養(yǎng)箱中作無菌檢驗，通常30℃培養(yǎng)1?3天。無菌檢查合格后將其保管于4℃下備用。2接種斜面接種點接把菌種點接在斜面中部偏下方處。適用于擴散型生長及絨毛狀氣生菌絲類霉菌（如毛霉、根霉等）。令狐采學創(chuàng)作令狐采學創(chuàng)作中央劃線從斜面中央自下而上劃一直線。適用于細菌和酵母菌等。稀波狀蜿蜒劃線法從斜面底部自下而上劃“之”字形線。適用于易擴散的細菌，也適用于部分真菌。密波狀蜿蜒劃線法從斜面底部自下而上劃密“之”字形線。能充分利用斜而獲得年夜量菌體細胞，適用于細菌和酵母菌等。挖塊接種法挖取菌絲體連同少量培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)接到新鮮斜面上。適用靈芝等擔子菌類真菌。穿刺接種用接種針從原菌種斜面上挑取少量菌體，從柱狀培養(yǎng)基中心自上而下刺入，直到接近管底（勿穿到管底），然后沿原穿刺途徑慢慢抽出接種針。適用于細菌和酵母菌等。液體接種挑取少量固體斜面菌種或用無菌滴管等吸取原菌液接種于新鮮液體培養(yǎng)基中。3培養(yǎng)將接種后的培養(yǎng)基放入培養(yǎng)箱中，在適宜的條件下培養(yǎng)至細胞穩(wěn)按期或獲得成熟抱子。細菌培養(yǎng)溫度一般為30?37℃,真菌培養(yǎng)溫度一般為25?28℃。令狐采學創(chuàng)作令狐采學創(chuàng)作4收藏培養(yǎng)好的菌種于4?6℃保管，根據(jù)要求每3?6個月移植一次。某些菌種，如芽裂酵母，阿舒假囊酵母，棉病囊霉等，須1?3個月移植一次。收藏濕度用相對濕度暗示，通常為50%?70%。斜面菌種應收藏相繼三代培養(yǎng)物以便對比，避免因意外和污染造成損失。液體石蠟收藏法亦稱礦物油收藏法，按期移植收藏法的幫助辦法。是指將菌種接種在適宜的斜面培養(yǎng)基上，最適條件下培養(yǎng)至菌種長出健壯菌落后注入滅菌的液體石蠟，使其籠蓋整個斜面，再直立放置于高溫（4?6℃）干燥處進行保管的一種菌種收藏辦法。操縱步調(diào)如下：1液體石蠟的準備選用優(yōu)質(zhì)化學純液體石蠟，將液體石蠟分裝加塞，用牛皮紙包好，采取以下兩種方法進行滅菌：121℃濕熱滅菌30min,置40℃恒溫箱中蒸發(fā)水分，經(jīng)無菌檢查后備用。160℃干熱滅菌2個小時，冷卻后，經(jīng)無菌檢查后備用。2斜面培養(yǎng)物的制備參照按期移植法。3灌注石蠟令狐采學創(chuàng)作令狐采學創(chuàng)作將無菌的液體石蠟在無菌條件下注入培養(yǎng)好的新鮮斜面培養(yǎng)物上，液面高出斜面頂部1cm左右，使菌體與空氣隔絕。4收藏注入液體石蠟的菌種斜面以直立狀態(tài)置高溫（4?6℃）干燥處收藏，收藏時間2?10年。收藏期間應按期檢查，如培養(yǎng)基露出液而，應及時彌補無菌的液體石蠟。5恢復培養(yǎng)恢復培養(yǎng)時，挑取少量菌體轉(zhuǎn)接在適宜的新鮮培養(yǎng)基上，生長繁衍后，再重新轉(zhuǎn)接一次。3.標準菌的蘇醒、復壯及標準蘊藏菌株的制備物品及試劑：接種針、酒精燈、移液管、75%酒精及75%酒精棉球培養(yǎng)基改進馬丁瓊脂培養(yǎng)基:用于黑曲霉蘇醒、復壯.用于白色念珠菌蘇醒、復壯.液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基:用于生抱梭菌蘇醒、復壯.營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：用于金黃色葡萄球菌、枯草芽抱桿菌、年夜腸埃希菌、乙型副傷寒沙門菌、短小芽抱桿菌、銅綠假單令狐采學創(chuàng)作令狐采學創(chuàng)作胞菌蘇醒、復壯。操縱步調(diào)：a.掀開潔凈工作臺。b.在安甑的外概略用75%的酒精擦拭并讓其自然風干。c.用一小砂輪在安甑的上部劃一條線，用手輕輕將安甑掰開（開啟安甑時必須小心，因為安甑遇熱時可能會破裂）。d.以無菌辦法用一無菌吸管從已準備好的上述液體培養(yǎng)基中移取0.5?0.8ml到安甑中。e.輕輕地旋轉(zhuǎn)安甑以使凍干菌種和液體培養(yǎng)基充分混合并完全溶解。f.用無菌吸管將安瓿內(nèi)菌液全部轉(zhuǎn)接到相應的液體培養(yǎng)基。g.根據(jù)安甑上所標明的不合菌種類型而將其培養(yǎng)于相應的溫度（細菌培養(yǎng)溫度30?35℃,培養(yǎng)18?24小時；真菌培養(yǎng)溫度23?28℃,培養(yǎng)3?5天。觀察是否渾濁，渾濁說明菌種蘇醒生長；若不渾濁，細菌應延長培養(yǎng)時間至7天，真菌應延長培養(yǎng)時間至14天，若仍未渾濁，滅菌處理。h.黑曲霉的菌懸液先室溫待菌懸液融化后用無菌吸管吸取管內(nèi)液體1?2滴滴在改進馬丁瓊脂斜面上，用吸管涂布均勻，置23?28℃培養(yǎng)5?7天，斜面正面為黑褐色厚絨狀，色澤均一，不該有雜色，斜面正面無色，接近菌層培養(yǎng)基略帶黃色。確認后用含有0.05%（ml/ml）的吐溫80的0.9%無菌氯化鈉溶液洗脫到無菌試管中。i.取經(jīng)蘇醒后的上述細菌菌液810ml至液體培養(yǎng)基中按g項令狐采學創(chuàng)作令狐采學創(chuàng)作操縱對菌種進行復壯。以無菌技術(shù)向復壯后的菌種中加入100m120%的無菌甘油混勻，12ml/管分裝于凍存管。每個菌種制備10支，按順序進行編號，最后一支做為質(zhì)控管進行質(zhì)量控制，即進行相應簡直認。其余作為蘊藏管。黑曲霉的h項下洗脫液按卜項下辦法進行復壯，制成復壯后的抱子懸液20ml。以無菌技術(shù)向復壯后的菌種中加入20ml、30%的無菌甘油混勻，12ml/管封存于凍存管。制備10支，按順序進行編號，最后一支做為質(zhì)控管進行質(zhì)量控制，即進行相應簡直認。其余作為蘊藏管。將上述制備好的凍存管逐支粘貼標簽。內(nèi)容包含：菌種名稱、菌種代號、編號、代次、制備日期、制備人、貯存條件、有效期至等。j蘊藏菌種管制備勝利，貯存于一20℃,有效期為三年。菌種確認用無菌接種環(huán)從質(zhì)控管中取細菌培養(yǎng)物接種到營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上，或相應的宜于該細菌生長的鑒別平板上，劃線別離出單個菌落。然后在30?35℃下培養(yǎng)2?3天；同樣的辦法取真菌到玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基平板，并在23?28℃下培養(yǎng)7天；培養(yǎng)后，觀察其菌落形態(tài)，應合適該菌種形態(tài)特征。污染處理假如在該平板上發(fā)明有其他菌落生長，則說明或操縱有污染或菌種不純。將此被污染了的培養(yǎng)物滅菌處理?？蓪ふ以蛄詈蓪W創(chuàng)作令狐采學創(chuàng)作重新別離挑選純菌落轉(zhuǎn)接斜面菌種作為第四代。偏重新制備蘊藏菌種管菌種的傳代與收藏將菌種接種至一新鮮培養(yǎng)基上，每萌發(fā)一次即稱為一代，因此，當原始菌種復溶并轉(zhuǎn)至新培養(yǎng)基內(nèi)生長，即認為已傳代一次，從菌種收藏中心獲得的冷凍干燥的菌種為第0代，冷凍干燥的原始菌種開啟后轉(zhuǎn)種后為第1代，直到第3代為工作菌種。菌種的傳代次數(shù)（自原始菌種凍干粉起）不得超出5代。菌種的傳代收藏過程3.3項下標準菌的蘇醒為傳第一代，復壯為第二代。傳第三代時取1支凍存管自然解凍，將其轉(zhuǎn)接斜面菌種作為工作用菌種。此時，工作用菌種為第3代。工作用菌種，分為兩類:一類用于按期傳代（W3），一類用于實驗用（S3）。按期傳代用菌的傳代其操縱步調(diào)如下（斜面接種法）：（1）從冰箱冷藏室中取出菌種斜面后，應在室溫放置約30分鐘。（2）將裝有新鮮配制的培養(yǎng)基菌種收藏管管壁上注明菌名及接種日期，和傳代菌種一并移入潔凈工作臺，掀開紫外燈照射一小時。（3）關(guān)閉紫外燈。撲滅酒精燈，左手握住菌種斜面，將管令狐采學創(chuàng)作令狐采學創(chuàng)作口靠近火焰上方，右手拿接種棒后端，將接種環(huán)燒紅約30秒，隨后將接種棒金屬部分在火焰上燒灼，往返通過三次。（4）右手用無名指、小指及掌部夾住管塞，左手將管口在火焰上旋轉(zhuǎn)燒灼，右手再輕輕拔開管塞，將接種環(huán)伸入管內(nèi)先在近壁的瓊脂斜面上靠一下，稍冷后再至菌苔上，刮取少量菌苔，隨即取出接種棒并將菌種管口移至火焰上方。（5）塞上管塞，左手將菌種管放下，取營養(yǎng)瓊脂斜面（或改進馬丁瓊脂斜面）一支，照上述操縱掀開管塞，將接種環(huán)伸入管內(nèi)至瓊脂斜面的底部向上劃一條直線，然后從底部向上作連續(xù)曲線劃線，一直劃到斜面頂端，使細菌接種在斜面的概略上。（6）取出接種環(huán)，在火焰上方將培養(yǎng)基管蓋上塞子，然后將接種過細菌的接種環(huán)在火焰上燒灼滅菌。（7）將已接種好的細菌管置30?35℃細菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)22?24h,真菌管置23?28℃真菌培養(yǎng)箱最多培養(yǎng)7天。當工作用菌種傳代代數(shù)小于5時，可直接用上一代工作用菌種轉(zhuǎn)接下一代工作用菌種，如：（W3）可直接轉(zhuǎn)接為（W4）。按上述法度操縱，直至（W4）轉(zhuǎn)為（W5）為止，需重新接種，舊的工作菌種進行銷毀。菌種斜面的培養(yǎng)、收藏條件及時間菌種培養(yǎng)條件及時間培養(yǎng)基保管條件及時間令狐采學創(chuàng)作令狐采學創(chuàng)作年夜腸埃希菌(CMCC(B)44102)30?35℃22?24h營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基2℃?8℃保管3個月金黃色葡萄球菌(CMCC(B)26003)30?35℃22?24h營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基2℃?8℃保管3個月枯草芽抱桿菌(CMCC(B)63501)30?35℃22?24h營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基2℃?8℃保管3個月銅綠假單胞菌(CMCC(B)10104)30?35℃22?24h營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基2℃?8℃保管3個月乙型副傷寒沙門菌(CMCC(B)50094)30?35℃22?24h營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基2℃?8℃保管3個月生抱梭菌(CMCC(B)64941)30?35℃22?24h營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基2℃?8℃保管3個月白色念珠菌(CMCC(F)98001)23?28℃最多7天改進馬丁瓊脂培養(yǎng)基2℃?8℃保管3個月黑曲霉(CMCC(F)98003)23?28℃最多7天改進馬丁瓊脂培養(yǎng)基2℃?8℃保管3個月短小芽抱桿菌(CMCC(B)63602