DB51-T 2964-2022 口岸松材線蟲疫情監(jiān)測技術(shù)規(guī)范

ICS

65.020CCS

B

16DB

51 DB51/T

2964—2022口岸松材線蟲疫情監(jiān)測技術(shù)規(guī)范Technical

the

四川省市場監(jiān)督管理局發(fā)

布DB51/T

前言

................................................................................

II1

范圍

...............................................................................

12

規(guī)范性引用文件

.....................................................................

13

術(shù)語和定義

.........................................................................

14

監(jiān)測范圍

...........................................................................

35

應(yīng)施監(jiān)測的植物及其產(chǎn)品

.............................................................

36

制定監(jiān)測計(jì)劃及實(shí)施方案

.............................................................

37

監(jiān)測方法

...........................................................................

38

實(shí)驗(yàn)室檢測

.........................................................................

49

監(jiān)測樣品的保存及處理

...............................................................

610

監(jiān)測結(jié)果管理

......................................................................

6附 錄 A

（資料性附錄）

............................................

7附 錄 B

（規(guī)范性附錄）

口岸松材線蟲疫情監(jiān)測記錄表

.................................

10附 錄 C

（資料性附錄）

松材線蟲組介紹及鑒定特征

...................................

11附 錄 D

（資料性附錄）

松材線蟲及其近似種

.........................................

17附 錄 E

（規(guī)范性附錄）

鑒定方法

...........................................

26附 錄 F

（規(guī)范性附錄）

實(shí)時(shí)熒光

鑒定方法

.......................................

28附 錄 G

（規(guī)范性附錄）

條形碼..................................................

30參考文獻(xiàn)

............................................................................

32DB51/T

1 范圍驗(yàn)室檢測、監(jiān)測樣品的保存及處理、監(jiān)測結(jié)果管理。林地的松材線蟲監(jiān)測。2規(guī)范性引用文件文件。GB/T

松材線蟲病檢疫技術(shù)規(guī)程GB/T

23478

松材線蟲普查監(jiān)測技術(shù)規(guī)程SN/T

1132-2002

松材線蟲檢疫鑒定方法SN/T

1724-2006

進(jìn)境針葉樹原木、木制品和木質(zhì)包裝材料中松材線蟲的檢疫操作規(guī)程SN/T

2757

植物線蟲檢測規(guī)范SN/T

4350-2015

旅客攜帶物和郵寄物檢疫鑒定和處理程序3 術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1口岸

port是國家批準(zhǔn)對外開放，允許人員、貨物、交通工具、寄遞物等進(jìn)出國境的地方。3.2松材線蟲 pinewood

nematode學(xué)名：Bursaphelenchus

(Steiner

&

Buhrer)

Nickle,

1970。松材線蟲是一種植物寄生線蟲，Rhabditida），墊刃亞目（），滑刃總科（Aphelenchoidea），滑刃科（Aphelenchoididae），寄生滑刃亞科（Parasitaphelenchinae），傘滑刃屬（Bursaphelenchus），能引起松樹萎蔫病，是針葉樹木上最重要的病原生物之一。松材線蟲相關(guān)信息參見附錄A。3.3媒介昆蟲

intermediary

insect（Monochamus）的天牛實(shí)現(xiàn)近距離傳播。3.4松褐天牛 Monochamus

alternatus

Hope,1843DB51/T

又名松墨天牛、松天牛，屬于天牛科（）、墨天牛屬（），是為害松樹的一種蛀干性昆蟲，為傳播松材線蟲的主要媒介天牛。3.5云杉花墨天牛

Monochamus

saltuarius

又名云杉花黑天牛，屬于天?？疲ǎ?、墨天牛屬（），是一種蛀干性昆蟲，是松材線蟲病的傳播媒介昆蟲。3.6木材wood帶皮或不帶皮的原木、鋸木、木板、木片等。3.7原木 raw

woods未經(jīng)過干燥、化學(xué)防腐劑等處理，并未永久改變其特性的木材。3.8松木及其制品 pine

wood

andwoodenware等深度加工的木質(zhì)材料（如膠合板、纖維板等）除外。3.9木質(zhì)包裝材料wood

materials用于承載、包裝、鋪墊、支撐、加固貨物的木質(zhì)材料，如木板箱、木條箱、木托盤、木框、木桶、木軸、木楔、墊木、枕木、襯木等。3.10疫木 diseased

wood感染松材線蟲病的寄主植物及其制品，主要為松屬植物及其制品。3.11藍(lán)變 blue-stain色物將胞壁染色，促使木材藍(lán)變的現(xiàn)象。藍(lán)變是判斷松材線蟲監(jiān)測抽樣的一個(gè)重要依據(jù)。3.12海關(guān)指定監(jiān)管場地

designated

site高風(fēng)險(xiǎn)動植物及其產(chǎn)品實(shí)施查驗(yàn)、檢驗(yàn)、檢疫的監(jiān)管作業(yè)場地。3.13海關(guān)監(jiān)管貨物 cargo

customs

supervision減免稅貨物，以及暫時(shí)進(jìn)出口貨物、保稅貨物和其他尚未辦結(jié)海關(guān)手續(xù)的進(jìn)出境貨物。3.14誘捕器監(jiān)測 trap

利用人工合成引誘劑來捕獲松墨天牛，并檢查其體內(nèi)、體表是否攜帶松材線蟲的一種監(jiān)測方法。3.15松墨天牛引誘劑 pine

對松墨天牛成蟲具有引誘活性的揮發(fā)性化合物，如萜烯類等特異性植物源物質(zhì)、昆蟲源信息素等，需與松墨天牛誘捕器配合使用。DB51/T

4 監(jiān)測范圍業(yè)場所等作業(yè)場地、郵檢作業(yè)場地等。5應(yīng)施監(jiān)測的植物及其產(chǎn)品墊材料、運(yùn)輸工具、郵寄物及旅客攜帶物。松材線蟲的寄主植物范圍參見附錄A.6。6 制定監(jiān)測計(jì)劃及實(shí)施方案牙以及中國臺灣等國家或地區(qū)的松木及其制品、郵寄物及旅客攜帶物。7監(jiān)測方法7.1 抽樣監(jiān)測重點(diǎn)抽取材質(zhì)干燥無松脂香味、有藍(lán)變、有媒介昆蟲棲居痕跡的松木或其加工制品，若無上述特征時(shí)，SN/T

中和6.3

中第5章和第6樣品標(biāo)識信息應(yīng)完整、清晰，確?？伤菰?、可追查，規(guī)范填寫附錄表。7.2 誘捕器監(jiān)測7.2.1誘捕器設(shè)置DB51/T

相距50

m～100

m。周邊有林地的按照GB/T

23478執(zhí)行。7.2.2 誘捕時(shí)間誘捕時(shí)間一般為每年的4月下旬至月底（不同地區(qū)有差異），即松墨天牛成蟲羽化初期開始，直至當(dāng)年成蟲羽化完畢為宜。7.2.3 松墨天牛引誘劑可根據(jù)監(jiān)測需要選用商品化的高效引誘劑。7.2.4誘捕器安裝、維護(hù)及媒介天牛的收集誘捕器安裝及維護(hù)在松墨天牛羽化前1

d～5

d，誘捕器應(yīng)安裝在空氣流通較好的地方，懸空掛置，誘捕器下端離地面

m～2.0

m。誘捕器上下兩端應(yīng)用鐵絲綁牢并固定，正確添加或更換引誘劑，應(yīng)注意防撒漏、防跌落，以免影響誘捕效果。后也要及時(shí)檢查誘捕器，確保誘捕器處于良好的誘蟲狀態(tài)。定期添加誘劑，每隔10

d～15

d添加1誘捕器每隔3

d～5

d檢查一次，及時(shí)收集并清理誘捕器中的媒介天牛，并在當(dāng)日送實(shí)驗(yàn)室檢測。詳細(xì)記錄相關(guān)信息，填寫附錄表B.2。7.2.5 安全事項(xiàng)規(guī)定和安全使用方法。8 實(shí)驗(yàn)室檢測8.1 松材線蟲的分離照GB/T

23476-2009中附錄C20

℃～

h～24

h

cm10

ml），置體視顯微鏡下鏡檢（放大倍率10

X～20

X為宜）。媒介昆蟲樣品的分離，可將天牛剪碎后直接分離或分離線蟲，也可直接浸泡于加水的表面皿或培養(yǎng)皿中，2h后在體視顯微鏡下直接觀察是否有線蟲。8.2 鏡檢100

μL～200

μL10條為宜，以避免漏檢），轉(zhuǎn)移到載玻片上，液滴體積50

μL左右為宜。在酒精燈上以1

s左右的頻率通過8

次～10

次，使線蟲恰好被殺死為宜。加蓋玻片，制成臨時(shí)玻片。若分離的線蟲均為幼蟲或數(shù)量極少影響后續(xù)鑒定時(shí)，可培養(yǎng)獲得成蟲后再進(jìn)行鑒定。一般要求觀察線蟲2020鑒定要求至少發(fā)現(xiàn)雌蟲和雄蟲各1球、尾部，尤其注意雌蟲陰門區(qū)以及雄蟲交合刺，并拍攝顯微照片。一般在

倍物鏡下，拍攝雌蟲頭DB51/T

部、陰門區(qū)、尾部各1張照片，拍攝雄蟲頭部和尾部各1張照片，必要時(shí)在100倍油鏡下拍攝。顯微鏡配DIC測量并計(jì)算體長/蟲體最寬處體寬（a）、體長/c）、尾長/肛門處體寬（c’）等值。如樣品足夠，應(yīng)測量雄蟲、雄蟲各20條以上。測計(jì)方法參考SN/T

2757。8.3 半永久標(biāo)本及永久標(biāo)本的制作按照SN/T

1132-2002中附錄C.2相關(guān)內(nèi)容執(zhí)行。8.4 線蟲培養(yǎng)按照

1724-2006中附錄B執(zhí)行。8.5 松材線蟲檢測鑒定8.5.1 鑒定流程發(fā)現(xiàn)雄蟲和（或）幼蟲，則無法進(jìn)行形態(tài)鑒定；如僅有雌蟲，有經(jīng)驗(yàn)的鑒定人員可做出初步鑒定結(jié)論，PCRPCR或DNA聯(lián)系相關(guān)專家復(fù)核。特異PCRPCR或DNA態(tài)學(xué)鑒定的補(bǔ)充。8.5.2 形態(tài)學(xué)鑒定松材線蟲形態(tài)學(xué)鑒定按照SN/T

1132-2002中第8C材線蟲及其近似種顯微特征詳見附錄D。8.5.3 分子生物學(xué)檢測松材線蟲特異E，實(shí)時(shí)熒光檢測見附錄F，DNA條形碼鑒定見附錄G。8.5.4 結(jié)果判定及復(fù)核8.5.4.1 結(jié)果判定形態(tài)學(xué)鑒定符合8.5.2機(jī)構(gòu)鑒定或復(fù)核的，可采納專家出具的結(jié)果進(jìn)行判定。分子生物學(xué)檢測依據(jù)附錄E～附錄G相關(guān)內(nèi)容進(jìn)行判定，檢測結(jié)果呈陽性的可鑒定為松材線蟲。8.5.4.2 復(fù)核CNAS認(rèn)可的有效能力范圍覆蓋松材線蟲檢測項(xiàng)目。提供復(fù)核的材料為具松材線蟲雌雄成蟲的線蟲分離液、臨時(shí)玻片、照片、分子檢測數(shù)據(jù)或影像材料等。9 監(jiān)測樣品的保存及處理DB51/T

4

4

4

及時(shí)銷毀或滅活處理，確保疫情不擴(kuò)散。的樣品除外），保存期不少于6個(gè)月，以備復(fù)查、談判或仲裁。56

℃以上時(shí)，處理時(shí)間不少于

min）。10監(jiān)測結(jié)果管理并按檔案要求進(jìn)行管理，保存期限為3好數(shù)據(jù)核查、溯源分析等工作，必要時(shí)按照四川省重大植物疫情防控管理要求及時(shí)啟動應(yīng)急預(yù)案響應(yīng)。AA附 錄A（資料性附錄）松材線蟲相關(guān)信息

DB51/T

A.1發(fā)現(xiàn)歷史和背景松材線蟲最早于1929年從美國德克薩斯州的長葉松（Pinus

）木材中分離到，被描述為Aphelenchoides

&

Buhrer，19341905年就有關(guān)于大量松1971年，等研究認(rèn)為一種傘滑刃屬線蟲是日本松樹枯萎病病原。1972年，等將該病原線蟲描述為Bursaphelenchus

。1981年，Nickle等確認(rèn)其為異名，松材線蟲從此被定名為Bursaphelenchus

（Steiner

&

Buhrer，1934）Nickle，1970。害。昆蟲長達(dá)數(shù)十年的防治工作都收效甚微，目前松材線蟲在日本除北部數(shù)縣外已擴(kuò)散到全國。我國19822020個(gè)省份、673個(gè)縣級行政區(qū)、4187樹數(shù)量112.48萬株。19982009A.2 地理分布美國、加拿大、墨西哥、日本、韓國、西班牙、葡萄牙、中國。A.3侵染循環(huán)松材線蟲通過墨天牛屬（Monochamus）昆蟲在寄主植物間傳播。天牛蛹中羽化后即將離開寄主樹木之前，線蟲進(jìn)入其體內(nèi)。天牛飛至健康樹木的樹冠，取食嫩枝和樹葉補(bǔ)充營養(yǎng)。隨后，雌雄蟲交配，通過傷口進(jìn)入松樹后，立即轉(zhuǎn)為繁殖階段，4

d～5

d即可發(fā)育為成蟲。松材線蟲利用天牛的發(fā)育過程，通過取食和產(chǎn)卵這兩種途徑，傳播到新的寄主樹木。A.4 傳播途徑DB51/T

M.

alternatusM.

saltuarius納墨天牛（M.

），葡萄牙為樟子松墨天牛（M.

galloprovincialis）。天牛科其它屬及鞘翅目其它昆蟲曾被發(fā)現(xiàn)其體內(nèi)攜帶松材線蟲的幼蟲，但未證實(shí)其傳播媒介作用。樹加工成的木質(zhì)包裝材料中經(jīng)常被截獲。因此，松材線蟲在國際貿(mào)易中進(jìn)一步擴(kuò)散的風(fēng)險(xiǎn)很高。A.5 松材線蟲生活史4 1松材線蟲具有6個(gè)幼蟲階段及成蟲。J124 122與段。在

℃的有利條件下，松材線蟲從卵開始，經(jīng)過4個(gè)繁殖階段的幼蟲齡期（J1至），在4天內(nèi)發(fā)育為成蟲。3齡幼蟲JⅢ而非繁殖型3齡幼蟲蟲在腸道細(xì)胞中積累脂肪，可在干旱、低溫或營養(yǎng)缺乏的逆境下存活。通常該齡幼蟲蛻皮成為分散型4齡幼蟲（持久型幼蟲），再由媒介甲蟲傳播給新的樹木。然而，如果條件變得適合線蟲發(fā)育，例如將分散型3齡幼蟲JⅢ接種到真菌培養(yǎng)皿中，線蟲會發(fā)育成為繁殖型4齡幼蟲。A.6 寄主松材線蟲的寄主主要是松屬（Pinus

spp.）針葉木，我國寄主主要是馬尾松（

massoniana）、黑松（P.

thunbergii）和赤松（P.

densiflora）。此外，香脂冷杉（

balsamea）、歐洲云杉（Picea

）、加拿大云杉（P.

canadensis）、北美云杉（P.

pungens）、歐洲落葉松（

europaea）、美加落葉松（L.

Cedrus

daeodaraC.

atlantica松屬以外的寄主很少在感染松材線蟲后死亡。目前僅美國報(bào)道藍(lán)杉（

pungens）和花旗松（Pseudotsuga

）感染松材線蟲后死亡。A.7 松材線蟲雌蟲尾形變化綜述2

μm。然而，這不是絕對的。許多學(xué)者的研究證實(shí)，松材線蟲的尾形會隨著寄主、環(huán)境等條件的變化而改變。19951

μm的占77

%（其中圓尾型占

%），超過1

μm（1.46

μm～3.41

μm）的占23

%。2005年，趙文霞等報(bào)道到黑松后重新分離，4.2

%雌蟲有尾尖突；接種到油松上，

%雌蟲有尾尖突，但未測量尾尖突長度。2007尖突，平均長度約為

μm，最長達(dá)

μm。但該線蟲經(jīng)灰葡萄孢培養(yǎng)后，所有雌蟲尾均寬圓，無尾尖突。2009度為0.5

μm～

μm，較本文的群體更短。2011年，顧建鋒等報(bào)道了一種美國木質(zhì)包裝中截獲的松材線蟲，從木質(zhì)包裝中直接分離獲得的雌蟲約一半尾端寬圓，無尾尖突；其余則有很短的尾尖突，約μm～1

μm。但經(jīng)過灰葡萄孢人工培養(yǎng)一月后，超過一半雌蟲有1

μm～2

μm的尾尖突，另有大約10

%的雌蟲尾尖突為2

μm～2.4

μm，其余雌蟲則無尾尖突或小于0.5

μm。2020年，顧建鋒等從遼寧紅松分離DB51/T

到一種具明顯尾尖突的松材線蟲，其雌蟲尾末端寬圓且無尾尖突的個(gè)體極少，僅占2

%～3

%部分均有或長或短的尾尖突，末端鈍圓或銳尖，長

μm(0.3

μm～

μm)

。但經(jīng)灰葡萄孢人工培養(yǎng)后，所有的雌蟲尾端鈍圓，均無尾尖突。由此可見，無論是國內(nèi)外松材線蟲群體，都有不少關(guān)于雌蟲尾尖突變異的報(bào)道。松材線蟲雌蟲均有尾尖突、或者尾尖突長度超過2

μm的情況是比較罕見的，從實(shí)驗(yàn)室對上千批次松材線蟲檢測結(jié)果來看，發(fā)現(xiàn)這種情況不到1

%。末端寬圓，無尾尖突。群體內(nèi)一些雌蟲有短尾尖突，但長度不超過2

μm。并且，通常群體內(nèi)總能發(fā)現(xiàn)無尾尖突的個(gè)體。時(shí)間口岸樣品編號樣品來源報(bào)關(guān)單號或郵件號來源渠道樣品類型抽樣場所外部癥狀取樣部位有無天牛危害有無藍(lán)變是否發(fā)現(xiàn)活蟲及采取的措施取樣數(shù)量備注誘捕器編號檢查時(shí)間監(jiān)測地點(diǎn)地理坐標(biāo)捕獲天牛數(shù)量誘劑添加/情況監(jiān)測點(diǎn)是否變更檢查人BB附 錄 B（規(guī)范性附錄）口岸松材線蟲疫情監(jiān)測記錄表表B.1～B.2給出了口岸松材線蟲疫情監(jiān)測情況記錄表。

表B.1 口岸松材線蟲疫情監(jiān)測抽樣記錄表表B.1 口岸松材線蟲疫情監(jiān)測抽樣記錄表【樣品編號】填寫“關(guān)區(qū)代碼+2【來源渠道】填寫貿(mào)易渠道、非貿(mào)易渠道；【樣品類型】填寫貨物、木質(zhì)包裝、旅客攜帶物、郵遞物等；【抽樣場所】填寫查驗(yàn)場所、快件中心、監(jiān)管作業(yè)場所、貨物堆放場所、檢疫處理場所等；【有無天牛危害】填寫是或否；【有無藍(lán)變】填寫是或否；表B.2 口岸松材線蟲誘捕監(jiān)測記錄表口岸：【誘捕器編號】填寫“關(guān)區(qū)代碼口岸：【誘捕器編號】填寫“關(guān)區(qū)代碼+2如貨物堆放場所、檢疫處理場所或周邊區(qū)域等；10CC

DB51/T

附 錄C（資料性附錄）松材線蟲組介紹及鑒定特征15單如下：——松材線蟲

B.

（

&

Buhrer，1934），1970——偽傘滑刃線蟲

B.

fraudulentus

Rühm，1956（J.

B.

，1960）——擬松材線蟲

B.

mucronatus

&

Enda，1979——錐尾傘滑刃線蟲

B.

conicaudatus

Kanzaki，Tsuda

&

，2000——鮑嘉傘滑刃線蟲

B.

baujardi

Negi，Bajaj

&

，2003——灰黃錦天牛傘滑刃線蟲

B.

luxuriosae

Kanzaki

&

，2003——豆傘滑刃線蟲

B.

doui

Braasch，Gu，

&

Zhang，2004——新加坡傘滑刃線蟲

B.

singaporensis

Gu，，Braasch

&

，2005——大尖尾傘滑刃線蟲

B.

macromucronatus

Gu，Zheng，Braasch

&

，2008——楊傘滑刃線蟲

B.

populi

&

，2010——擬灰黃錦天牛傘滑刃線蟲

B.

paraluxuriosae

Gu,Wang,Braasch,2012——日本冷杉傘滑刃線蟲

B.

Maehara,

&

2012——韓國傘滑刃線蟲

B.

Gu,

Wang

&

Chen,

——吉拉尼傘滑刃線蟲

B.

Sch?nfeld,

Braasch,

Riedel

&

Gu,

2013——錦天牛屬傘滑刃線蟲

B.

Ekino,

Maehara,

Aikawa

&

2019松材線蟲組線蟲均具有以下共同鑒定特征：側(cè)線4條；典型的雄蟲交合刺形狀（較長、弓形，喙突明顯，遠(yuǎn)端一般有盤狀突：均與松材線蟲交合刺形態(tài)相似）；尾乳突7個(gè)，明顯，和P4鄰近且位于交合傘起始處；雌蟲陰門蓋較長（圖）。上述特征中，由于側(cè)線和尾乳突特征有時(shí)在光學(xué)顯微鏡下（表C.2）。11DB51/T

A.C.D.圖C.1典型的松材線蟲組線蟲的特征12DB51/T

表C.1 松材線蟲組雄蟲交合刺和雌蟲尾形特征圖種類 交合刺雌蟲尾松材線蟲（圓尾型）偽傘滑刃線蟲擬松材線蟲（歐洲亞種）擬松材線蟲（東亞亞種）錐尾傘滑刃線蟲鮑嘉傘滑刃線蟲灰黃錦天牛傘滑刃線蟲擬灰黃錦天牛傘滑刃線蟲13DB51/T

種類交合刺雌蟲尾豆傘滑刃線蟲新加坡傘滑刃線蟲大尖尾傘滑刃線蟲楊傘滑刃線蟲日本冷杉傘滑刃線蟲韓國傘滑刃線蟲吉拉尼傘滑刃線蟲錦天牛屬傘滑刃線蟲14DB51/T

表C.2 松材線蟲組雌蟲尾形顯微特征圖種類 雌蟲尾

雌蟲尾

松材線蟲（圓尾型

R

型）偽傘滑刃線蟲擬松材線蟲歐洲亞種擬松材線蟲東亞亞種錐尾傘滑刃線蟲擬灰黃錦天牛傘滑刃線蟲豆傘滑刃線蟲新加坡傘滑刃線蟲15DB51/T

種類 雌蟲尾

雌蟲尾

大尖尾傘滑刃線蟲楊傘滑刃線蟲韓國傘滑刃線蟲吉拉尼傘滑刃線蟲錦天牛屬傘滑刃線蟲16DD附 錄 D（資料性附錄）松材線蟲及其近似種顯微特征圖D.1～圖給出了松材線蟲及其近似種的顯微特征照片。

DB51/T

A.B.F.K.

圖D.1 典型的松材線蟲雌雄蟲照片(=10

μm)17DB51/T

A.持久型幼蟲；繁殖型幼蟲；雌蟲；雄蟲；繁殖型幼蟲體前端；雌蟲陰門區(qū)；繁殖型幼蟲尾部；H.圖D.2不同發(fā)育階段松材線蟲形態(tài)圖(標(biāo)尺

μm)18DB51/T

A.圖D.3松材線蟲持久型幼蟲頭部和尾部顯微特征圖(標(biāo)尺

μm)19DB51/T

，其余絕大部分均有或長或短的尾尖突，末端鈍圓或銳尖，長1.8

μ±

μ

(0.3

μ3.2

μm)葡萄孢人工培養(yǎng)后，所有的雌蟲尾端鈍圓，均無尾尖突。N.直接從紅松樣品分離到的松材線蟲雌蟲尾形；O.圖D.4 遼寧紅松中分離到的松材線蟲雌蟲尾尖形態(tài)圖(=10

μ20DB51/T

A.體前部；中食道球區(qū)；E.雄蟲尾部；雌蟲陰門區(qū)；雌蟲尾部。松材線蟲型株系雌蟲具有長約2.2

μ3.0

μ的尾尖突，且經(jīng)人工培養(yǎng)后仍如此。而松材線蟲型株系盡管有些個(gè)體會有短尾尖突，甚至有些群體大部分都有尾尖突，但尾尖突一般在人工培養(yǎng)后消失。目前型松材線蟲僅分布于北美，其寄主主要是圖D.5松材線蟲

M

型株系(標(biāo)尺

μm)21DB51/T

圖D.6 擬松材線蟲東亞亞種（上面

4

幅）和歐洲亞種（下面

4

幅）雌蟲尾形圖(

10

μm)22DB51/T

A.J-K.H.圖D.7偽傘滑刃線蟲（B.

fraudulentus）(標(biāo)尺

μm)23DB51/T

A BC

DE

F

G

HI J K LA-B.E-H.圖D.8 豆傘滑刃線蟲新種雄蟲顯微照片(=

μ24DB51/T

B.頭部；C.雌蟲陰門蓋；雌蟲陰門至尾末端；培養(yǎng)后的雌蟲尾部形態(tài)；木質(zhì)包裝中直接分離的雌H.圖D.9 楊傘滑刃線蟲光學(xué)顯微照片(=10

μm)25引物名稱堿基序列擴(kuò)增片段長度X-F5’-

-3’約

560

bp5’-

-3’J10-15’-

’約

160

bpJ10-2Rc5’-

’EE附錄 E（規(guī)范性附錄）特異

鑒定方法

DB51/T

E.1試劑10×PCR

（Mg

K、2×

預(yù)混液、O。E.2 實(shí)驗(yàn)步驟E.2.1 DNA方法1（蛋白酶K1條或數(shù)條線蟲放入OμL

PCR管中（含8

μL

ddHO和1

μL

10×PCR

Buffer（Mg

free）），液氮中放置1

（或超低溫冰箱放置20

以上），

℃加熱2

，向PCR管中加入1

μL

1

蛋白酶K，56

℃15

，95

℃加熱10

，即得到線蟲DNA模板。得到的DNA提取液可直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增（或者于-20℃?zhèn)溆茫?。方?O1分鐘后用1DNA模板后可直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增（或者于-20

℃?zhèn)溆茫?。E.2.2 特異E.2.2.1 引物序列引物序列見表。表E.1 引物序列E.2.2.2 表E.1 引物序列PCR反應(yīng)體系見表E.2。引物對的反應(yīng)參數(shù)：94

℃

4

；94

℃

sec，56

℃

sec，72

℃1

，35個(gè)循環(huán)；72

℃

5

。J10-1和J10-2Rc引物對的反應(yīng)參數(shù)：

℃

5

；94

℃

30

，64

℃

1，72

℃

1

，35個(gè)循環(huán)；72

℃

5

。26試劑名稱加樣量

μL2×

MasterMix

預(yù)混液25正向引物（濃度

10

）2反向引物（濃度

10

）2DNA

2ddHO補(bǔ)足反應(yīng)總體積至

μLDB51/T

表E.2表E.2PCR

反應(yīng)體系以松材線蟲DNA模板作為陽性對照，以不含松材線蟲的DNA模板作為陰性對照，以O(shè)作為空E.2.3 瓊脂糖電泳配制1.0%GelRed0.5

5

μL

PCR100

DNA

3V/cm～5

V/cm電場強(qiáng)度電泳，約0.5

h，將瓊脂糖凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)上拍照并保留結(jié)果。E.2.4 結(jié)果判定在陽性對照、陰性對照和空白對照正確的前提下，經(jīng)瓊脂糖電泳：采用引物對擴(kuò)增后，電泳檢測得到與陽性對照一致的

bp左右大小的特有條帶，或采用J10-1/J10-2Rc引物對得到

bp左右大小的特有條帶，判定結(jié)果為陽性；否則判定結(jié)果為陰性。陽性對照、陰性對照和（或）空白對照不正確，無論待測樣品結(jié)果如何，應(yīng)重復(fù)試驗(yàn)。27試劑名稱加樣量

μL2×

MasterMix

預(yù)混液25引物

BsatF（濃度

10

）2引物

（濃度

10

）2探針

BSatS

（濃度

）1DNA

2ddHO補(bǔ)足反應(yīng)總體積至

μL引物名稱堿基序列正向引物

BsatF5’’反向引物

5’’探針

BSatS5’’注：探針

5’端含有

基團(tuán)的熒光染料，3’端含有

基團(tuán)的熒光染料。FF附錄 F（規(guī)范性附錄）實(shí)時(shí)熒光

鑒定方法F.1 試劑10×PCR

Buffer（Mg

）、蛋白酶K、2×Taq

預(yù)混液、O。F.2實(shí)驗(yàn)步驟F.2.1 DNA操作方法見附錄E.2.1F.2.2 實(shí)時(shí)熒光F.2.2.1引物及探針序列引物及探針序列見表F.1。

表F.1 引物及探針序列表F.1 引物及探針序列F.2.2.2實(shí)時(shí)熒光每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，同時(shí)每次檢測設(shè)立3個(gè)對照，分別為：含有松材線蟲DNA的陽性對照，不含松材線蟲的陰性對照以及雙蒸水代替模板為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系見表F.2。表F.2 實(shí)時(shí)熒光

表F.2 實(shí)時(shí)熒光

反應(yīng)體系實(shí)時(shí)熒光PCR的反應(yīng)參數(shù)：95

℃

；95

℃

15

sec，60

℃

45

sec，共個(gè)循環(huán)。對PCR反應(yīng)管F.2.3 結(jié)果判定28DB51/T

實(shí)時(shí)熒光5～應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整基線范圍。閾值設(shè)置原則以基線剛好超過正常陰性對照擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)，且值=40為準(zhǔn)。在陽性對照、陰性對照和空白對照正確的前提下：——如果待測樣品的

Ct

值等于

40

時(shí)，則判定結(jié)果為陰性；——如果待測樣品的

Ct

值小于或等于

35

時(shí)，則判定結(jié)果為陽性；——如果待測樣品的

Ct

40

而大于

35

時(shí)，應(yīng)重新進(jìn)行測試，如果重新測試的

Ct

值等于

40

Ct

值小于或等于

35

新測試的

值小于

40

而大于

，且分離曲線明顯時(shí)，則判定結(jié)果為陽性。29引物名稱堿基序列擴(kuò)增片段D2A5′′約

800

bpD3B5′′GG附 錄 G（規(guī)范性附錄）DNA

條形碼G.1 試劑10×

Buffer（Mg2+

、蛋白酶K、2×Taq

預(yù)混液、ddH2O。G.2 實(shí)驗(yàn)步驟G.2.1 DNA操作方法見E.2.1G.2.2 28S基因片段擴(kuò)增G.2.2.1 引物序列引物序列見表。

表G.1引物序列表G.1引物序列G.2.2.2PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系及參數(shù)PCR反應(yīng)體系參見附錄表。反應(yīng)參數(shù)

℃

4

min；94

℃

30

，

℃

30sec，72

℃

1min，37個(gè)循環(huán)；72

℃

8

min。G.2.3瓊脂糖電泳操作方法見附錄E.2.3。G.2.4 產(chǎn)物測序該引物正常的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為

bp左右，若樣品PCR到生物測序公司雙向測序（可要求公司進(jìn)行拼接），建議每個(gè)樣品做3個(gè)以上重復(fù)。G.3 DNA條形碼分析G.3.1序列拼接使用Chormas軟件或其他序列分析軟件，對28S基因測序得到的雙向峰圖文件（后綴名.ab）進(jìn)行拼接。為確保DNA條形碼序列的可靠性，需對測序質(zhì)量進(jìn)行評估，去除測序結(jié)果兩端峰形雜亂的低質(zhì)量序列，并去除引物所在序列區(qū)域，獲得相應(yīng)的DNA序列。拼接完成后，DNA序列方向應(yīng)與PCR擴(kuò)增正向引物方向一致并保證序列長度大于740

bp。30DB51/T

G.3.2序列比對登

陸

NCBI

網(wǎng)

站

中

的

BLAST

（

basic local search tool

）

頁

面（）進(jìn)行比對。在

Basic

BLAST

中選擇

blast，在Query

Sequence

（Per.

）。在

BLAST

結(jié)果中查看序列相似性最高的物種，一般為與查詢序列最接近的物種。G.4結(jié)果判定若待測樣品序列與已知的松材線蟲序列（AY508107.1、EF446929.1-EF446933.1、、EF446936.1、EF446941.1、