電泳概述及分類

藥物分離與純化技術課程電泳概述及分類2023/5/132電泳技術一、概述二、電泳分類三、凝膠電泳大綱1.電泳:帶電顆粒在電場的作用下，向著與其電性相反的電極移動，稱為電泳。正極負極帶負電粒子帶正電粒子一、概述

2.電泳的發(fā)展歷史1809年俄國物理學家Рейсе首次發(fā)現(xiàn)電泳現(xiàn)象。他在濕粘土中插上帶玻璃管的正負兩個電極，加電壓后發(fā)現(xiàn)正極玻璃管中原有的水層變混濁，即帶負電荷的粘土顆粒向正極移動，這就是電泳現(xiàn)象。1937年瑞典Uppsala大學的Tiselius對電泳儀器作了改進，創(chuàng)造了Tiselius電泳儀，建立了研究蛋白質的移動界面電泳方法。Tiselius在電泳技術方面做出的開拓性貢獻而獲得了1948年的諾貝爾化學獎。

1948年Wieland和Fischer重新發(fā)展了以濾紙作為支持介質的電泳方法，對氨基酸的分離進行研究。1959年Raymond和Weintraub利用人工合成的凝膠作為支持介質，創(chuàng)建了聚丙烯酰胺凝膠電泳，極大地提高了電泳技術的分辨率，開創(chuàng)了近代電泳的新時代。20世紀80年代發(fā)展起來的新的毛細管電泳技術，是化學和生化分析鑒定技術的重要新發(fā)展，己受到人們的充分重視。3.遷移率及其影響因素3.1遷移率:是指帶電顆粒在單位電場下泳動的速度。

3.2遷移率的影響因素

內在因素

外在因素

3.2.1影響遷移率的內在因素所帶靜電荷的多少——遷移率與表面電荷成正比。大小和形狀——直徑小而接近于球形，則在電場中泳動速度快。DNA構象——一般遷移速率超螺旋環(huán)狀>線狀DNA>單鏈開環(huán)。質粒DNA的構象3.2.2影響遷移率的外界因素電場強度

溶液的pH值

溶液的離子強度

溫度的影響

支持物的影響

電滲

①電場強度電場強度是指單位長度（每一厘米）支持物體上的電位降，它對泳動速度起著十分重要的作用。當電壓在500V以下，電場強度在2-10v/cm時為常壓電泳。電壓在500V以上，電場強度在20-200V/cm時為高壓電泳。一般，電場強度越高，帶電顆粒移動速度越快。

②溶液的pH值

溶液的pH決定被分離物質的解離程度和質點的帶電性質及所帶凈電荷量。溶液的pH離pl越遠，質點所帶凈電荷越多，電泳遷移率越大。因此在電泳時，應根據(jù)樣品性質，選擇合適的pH值緩沖液。③溶液的離子強度電泳液中的離子增加會使電泳遷移率降低，原因是帶電的離子會吸引相反符號的離子聚集在其周圍，相成一個與運動粒子符號相反的離子氛（ionicatmosphere），它使該離子向相反的方向運動，從而降低了該粒子的遷移率。④溫度的影響電泳過程中由于通電產生焦耳熱，熱對電泳有很大的影響。溫度每升高1℃，遷移率約增加2.4%。為降低熱效應對電泳的影響，可控制電壓或電流，或在電泳系統(tǒng)中安裝冷卻散熱裝置

⑤支持物的影響

對支持物的要求一般是均勻和吸附力小，否則電場強度不均勻，影響區(qū)帶的分離，實驗結果及掃描圖譜無法重復。⑥電滲

電場作用下液體對于固體支持物的相對移動稱為電滲（electro-osmosis）。其產生的原因是固體支持物多孔，且?guī)в锌山怆x的化學基團，因此常吸附溶液中的正離子或負離子，使溶液相對帶負電或正電。應盡可能選擇低電滲作用的支持物以減少電滲的影響。二、電泳的分類Tise-leas式微量電泳顯微電泳等電聚焦電泳等速電泳密度梯度電泳電泳自由電泳（無支持體）區(qū)帶電泳（有支持體）濾紙電泳（常壓及高壓）薄層電泳（薄膜及薄板）凝膠電泳（瓊脂、瓊脂糖、淀粉膠、聚丙烯酰胺凝膠）凝膠電泳：由瓊脂、瓊脂糖、淀粉膠及聚丙烯酰胺等物質作支持物的電泳。特點：1.可以制成非常均勻的凝膠，帶電質點在凝膠的孔中泳動。2.電泳操作方法簡便，電泳速度快3.分辨率高，重復性好，電泳圖譜清晰。4.適用于生化，免疫等定性定量測定

三、凝膠電泳1瓊脂糖凝膠電泳1.1實驗原理瓊脂糖凝膠電泳是分子生物學研究中常用的技術，可用于分離，鑒定和純化DNA或RNA片段。不同大小、不同形狀和不同構象的DNA分子在相同的電泳條件下，有不同的遷移率，所以可通過電泳使其分離。1.2瓊脂糖簡介天然瓊脂（agar）是一種多聚糖，主要由瓊脂糖（agarose，約占80%）及瓊脂膠（agaropectin）組成。瓊脂糖是由半乳糖及其衍生物構成的中性物質，不帶電荷，而瓊脂膠是一種含硫酸根和羧基的強酸性多糖，由于這些基團帶有電荷，在電場作用下能產生較強的電滲現(xiàn)象，加之硫酸根可與某些蛋白質作用而影響電泳速度及分離效果。因此，目前多用瓊脂糖為電泳支持物進行平板電泳。

分離不同大小DNA片段的

合適瓊脂糖凝膠濃度1.3電泳緩沖液

TAE：乙酸鹽緩沖液TBE：硼酸鹽緩沖液TPE：磷酸鹽緩沖液1.4實驗步驟1.制作膠模：用膠帶將洗凈、干燥的水平板的邊緣封住，并插入梳子，形成一個膠模并水平放置。2.熔膠：按水平板的長×寬×0.5cm膠厚，量取0.5×TBE，并按0.7％的濃度稱取agarose瓊脂糖，在微波爐或電爐上加熱至全熔。3.制備凝膠板等凝膠溫度降至大約50－60℃以下時，加入1mg/L溴化乙錠（EB）至終濃度為0.5ug/mL；搖勻并輕快地倒入水平板中，并除掉氣泡。在凝膠電泳中，一般加入溴化乙錠（EB）--ethidiumbromide染色，此時，核酸分子在紫外光下發(fā)出熒光，肉眼能看到約50ngDNA所形成的條帶。溴化乙錠4.凝固后，將梳子輕輕拔出。去掉膠帶，將水平板放入加有0.5×TBE電泳緩沖液的電泳槽中，并且使電泳緩沖液高出凝膠約1mm。5.點樣——在核酸樣品中加入適量上樣Buffer，混勻后點樣。6.電泳

——蓋好電泳槽蓋子，選擇適當?shù)碾娪倦妷海ā?V/cm）開始電泳。7.當色素接近膠的先端，停止電泳，樣品在紫外燈下觀察、成像。EB是強誘變劑，操作時應帶手套，并注意安全。制備凝膠時，倒膠的溫度不可太低，否則凝固不均勻；速度也不可太快，否則容易出現(xiàn)氣泡。1.5實驗注意事項聚丙烯酰胺凝膠單體丙烯酰胺(Acr)和交聯(lián)劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺(Bis)在加速劑N，N，N，N—四甲基乙二胺(TEMED)和催化劑過硫酸銨(AP)或核黃素的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結構的凝膠，以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamidegelelectrophoresis，簡稱PAGE)。2.聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠有下列特性：(1)在一定濃度時，凝膠透明，有彈性，機械性能好；(2)化學性能穩(wěn)定，與被分離物不起化學反應，在很多溶劑中不溶；(3)對pH和溫度變化較穩(wěn)定；(4)幾乎無吸附和電滲作用，只要Acr純度高，操作條件一致，則樣品分離重復性好；(5)樣品不易擴散，且用量少，其靈敏度可達10-6g(6)凝膠孔徑可調節(jié)，根據(jù)被分離物的分子量選擇合適的濃度，通過改變單體及交聯(lián)劑的濃度調節(jié)凝膠的孔徑；(7)分辨率高，尤其在不連續(xù)凝膠電泳中，集濃縮、分子篩和電荷效應為一體。因而較醋酸纖維薄膜電泳、瓊脂糖電泳等有更高的分辨率。凝膠濃度(T)的選擇與被分離物質分子量密切相關。表：

分子量范圍與凝膠濃度的關系分子量范圍 適用的凝膠濃度/(%)

蛋白質

104 20-30 1-4×104 15-201-5×104-1×105 10-15 1×105 5-10

5×105 2-5

核酸(RNA) 104 15–20 104–105 5-10 105-2×106 2-2.6 按凝膠裝置分為盤狀電泳（圖1）及板狀電泳（圖2）盤狀電泳通常是不連續(xù)系統(tǒng)，利用緩沖液離子成分、pH、凝膠孔徑進行電泳，帶電顆粒電泳時具有電荷效應、分子篩效應、

濃縮效應。聚丙烯酰胺凝膠電泳分類圖1聚丙烯酰胺凝膠圓盤電泳示意圖

(A為正面,B為剖面)

(1)樣品膠pH6.7(2)濃縮膠pH6.7

(3)分離膠pH8.9(4)電極緩沖液pH8.3

圖2夾心垂直板電泳槽示意圖圖3凝膠模示意圖

1.導線接頭2.下貯槽3.凹形橡膠框4.樣品槽模板5.固定螺絲6.上貯槽7.冷凝系統(tǒng)

PAGE根據(jù)其有無濃縮效應，分為連續(xù)系統(tǒng)和不連續(xù)系統(tǒng)兩大類，連續(xù)系統(tǒng)電泳體系中緩沖液pH值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場作用下，主要靠電荷和分子篩效應。不連續(xù)系統(tǒng)中由于緩沖液離子成分，pH，凝膠濃度及電位梯度的不連續(xù)性，帶電顆粒在電場中泳動不僅有電荷效應，分子篩效應，還具有濃縮效應，因而其分離條帶清晰度及分辨率均較前者佳。不連續(xù)體系由電極緩沖液、濃縮膠及分離膠所組成。濃縮膠是由AP催化聚合而成的大孔膠，凝膠緩沖液為pH6.7的Tris-HC1。分離膠是由AP催化聚合而成的小孔膠，凝膠緩沖液為pH8.9Tris-HC1。電極緩沖液是pH8.3Tris-甘氨酸緩沖液。2種孔徑的凝膠、2種緩沖體系、3種pH值使不連續(xù)體系形成了凝膠孔徑、pH值、緩沖液離子成分的不連續(xù)性，這是樣品濃縮的主要因素。

緩沖液離子成分、PH的不連續(xù)性：電極緩沖液通常為pH8.3Tris-甘氨酸緩沖液，樣品及凝膠中緩沖液為pH6.7Tris-HCL緩沖液。電極緩沖液的pH=8.3，甘氨酸的電離小，有效遷移率小，稱為慢離子；濃縮膠中的氯離子完全電離，有效遷移率大，稱為快離子；蛋白質在濃縮膠中介于二者之間。電泳開始后，氯離子跑得最快，留下一段低電導區(qū)，產生高電位梯度（電位與電導率成反比），使甘氨酸離子追趕氯離子，蛋白質夾在中間而被壓縮。1cm厚樣品層可以壓縮0.25μm的厚度。濃縮效應

圖4電泳過程示意圖

A為電泳前3層凝膠排列順序，3層膠中均有快離子，慢離子

B顯示電泳開始后，蛋白質樣品夾在快、慢離子之間被濃縮成極窄的區(qū)帶。C顯示蛋白質樣品分離成數(shù)個區(qū)帶。

圖5不連續(xù)系統(tǒng)濃縮效應示意圖

分子篩效應：分子量或分子大小和形狀不同的蛋白質通過一定孔徑分離膠時，受阻滯的程度不同而表現(xiàn)出不同的遷移率，這就是分子篩效應。當樣品進入分離膠，凝膠孔徑變小，分子量小，阻力小，移動快；分子量大，阻力大，移動慢。電荷效應：電荷量不同，遷移率不同。SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）：蛋白質在聚丙烯酰胺凝膠電泳時，它的遷移率取決于它所帶凈電荷以及分子的大小和形狀等因素。如果在丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中加入陰離子去污劑十二烷基磺酸鈉(sodiumdodecylsulfate,簡稱SDS)，則蛋白質分子的電泳遷移率主要取決于它的分子量，而與所帶電荷和形狀無關。因此可以利用SDS測定蛋白質分子量。實驗步驟1.安裝夾心式垂直板電泳槽(1)裝上貯槽和固定螺絲銷釘，仰放在桌面上。(2)將長、短玻璃板分別插到凵形硅橡框的凹形槽中，注意勿用手接觸灌膠面的玻璃。(3)將已插好玻璃板的凝膠模平放在上貯槽上，短玻璃板應面對上貯槽。(4)將下貯槽的銷孔對準已裝好螺絲銷釘?shù)纳腺A槽，雙手以對角線的方式旋緊螺絲帽。(5)豎直電泳槽，在長玻璃板下端與硅膠?？蚪唤绲目p隙內加入已融化的1%瓊脂(糖)。其目的是封住空隙，凝固后的瓊脂(糖)中應避免有氣泡。3.制備凝膠板 將混合后的分離膠溶液，用細長頭的滴管加至長、短玻璃板間的窄縫內，加膠高度距樣品模板梳齒下緣約1cm。用1mL注射器在凝膠表面沿短玻璃板邊緣輕輕加一層重蒸水(約3–4mm)，用于隔絕空氣，使膠面平整。約30-60min凝膠完全聚合，則可看到水與凝固的膠面有折射率不同的界線。 將上、下貯槽的蒸餾水倒去，將混合均勻后的濃縮膠溶液，用細長頭的滴管加到長、短玻璃板的窄縫內(即分離膠上方)，距短玻璃上緣0.5cm處，輕輕加入樣品槽模板.在上、下貯槽中加入蒸餾水，但不能超過短玻璃板上緣。靜置電泳槽，10min左右，上膠即可聚合，再放置10-20min，加入電極緩沖液，使液面沒過短玻璃板約0.5cm，輕輕取出樣品槽模板，即可加樣。4.樣品的處理及加樣

將樣品按0.5–1mg/mL加樣品溶解液，溶解后，將其轉移到帶塞的小離心管中，輕輕蓋上蓋子(不要塞緊，以免加熱時迸出)，在100℃沸水浴中加熱3min，取出冷卻后加樣。 用微量進樣器取25l上述混合液，通過緩沖液，小心地將樣品加到凝膠凹形樣品槽底部。5.電泳 將電泳儀的正極與下槽連接，負極與上槽連接，接通冷卻水，打開電泳儀開關，開始時電流為10mA，待樣品進入分離膠后，將電流調至20-30mA，當溴酚藍染料距硅膠框1cm時，停止電泳，關閉電源及冷卻水。6.染色與脫色 電泳結束后，取下凝膠模，卸下硅膠框，用不銹鋼藥鏟或鑷子撬開短玻璃板，從凝膠板上切下一角作為加樣標記，在兩側溴酚藍染料區(qū)帶中心，插入細銅絲作為前沿標記。加入染色液染色1-2h，再用脫色液脫色，直至蛋白質區(qū)帶清晰，即可計算相對遷移率。電泳后的凝膠經考馬斯亮藍染色、脫色后的凝膠照片

7.結果處理量出加樣端距細銅絲間的距離(cm)以及各蛋白質樣品區(qū)帶中心與加樣端的距離(cm)，按下式計算相對遷移率mR:相對遷移率mR=

蛋白質樣品距加樣端遷移距離(cm)溴酚藍區(qū)帶中心距加樣端距離(cm)注意事項

（1）丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺是神經毒性試劑，對皮膚有刺激作用，注意避免直接接觸。（2）安裝電泳槽時要注意均勻用力旋緊固定螺絲，避免緩沖液滲漏。（3）用瓊脂(糖)封底及灌膠時不能有氣泡，以免電泳時影響電流的通過。（4）樣品中應含一定濃度的蔗糖溶液，目的是用以防止樣品因對流而被稀釋。

（5）加樣時樣品不能超出凹形樣品槽。加樣槽中不能有氣泡，如有氣泡，可用注射器針頭挑除。SDS電泳常見問題分析1.配膠緩沖液系統(tǒng)對電泳的影響？

在SDS－PAGE不連續(xù)電泳中，制膠緩沖液使用的是Tris－HCL緩沖系統(tǒng)，濃縮膠是pH6.7，分離膠pH8.9；而電泳緩沖液使用的Tris－甘氨酸緩沖系統(tǒng)。在濃縮膠中，其pH環(huán)境呈弱酸性，因此甘氨酸解離很少，其在電場的作用下，泳動效率低；而CL離子卻很高，兩者之間形成導電性較低的區(qū)帶，蛋白分子就介于二者之間泳動。由于導電性與電場強度成反比，這一區(qū)帶便形成了較高的電壓剃度，壓著蛋白質分子聚集到一起，濃縮為一狹窄的區(qū)帶。當樣品進入分離膠后，由于膠中pH的增加，呈堿性，甘氨酸大量解離，泳動速率增加，直接緊隨氯離子之后，同時由于分離膠孔徑的縮小，在電場的作用下，蛋白分子根據(jù)其固有的帶電性和分子大小進行分離。

所以，pH對整個反應體系的影響是至關重要的，實驗中在排除其他因素之后仍不能很好解決問題的情況，應首要考慮該因素。

2.樣品如何處理？

根據(jù)樣品分離目的不同，主要有三種處理方法：還原SDS處理、非還原SDS處理、帶有烷基化作用的還原SDS處理。

1）還原SDS處理：在上樣buffer中加入SDS和DTT（或Beta巰基乙醇）后，蛋白質構象被解離，電荷被中和，形成SDS與蛋白相結合的分子，在電泳中，只根據(jù)分子量來分離。一般電泳均按這種方式處理，樣品稀釋適當濃度，加入上樣Buffer，離心，沸水煮5min，再離心加樣。

2）帶有烷基化作用的還原SDS處理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并經久牢固的保護SH基團，得到較窄的譜帶；另碘乙酸胺可捕集過量的DTT，而防止銀染時的紋理現(xiàn)象。100ul樣品緩沖液中10ul20％的碘乙酸胺，并在室溫保溫30min。

3）非還原SDS處理：生理體液、血清、尿素等樣品，一般只用1％SDS沸水中煮3min，未加還原劑，因而蛋白折疊未被破壞，不可作為測定分子量來使用。

3.SDS電泳凝膠中各主要成分的作用？

聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺與為蛋白質電泳提供載體，其凝固的好壞直接關系到電泳成功與否，與促凝劑及環(huán)境密切相關；

制膠緩沖液：濃縮膠選擇pH6.7，分離膠選擇pH8.9，選擇tris－HCL系統(tǒng)，TEMED與AP：AP提供自由基，TEMED是催化劑，催化自由基引起的聚合反應進行；十二烷基硫酸鈉（SDS）：陽離子去污劑，作用有四：去蛋白質電荷、解離蛋白質之間的氫鍵、取消蛋白分子內的疏水作用、去多肽折疊。

4.提高SDS電泳分辨率的途徑？

聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝膠的分辨率。建議做法：待凝膠在室溫凝固后，可在室溫下放置一段時間使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易導致凝固不充分，后者可導致SDS結晶。一般凝膠可在室溫下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。

一般常用的有氨基黑、考馬斯亮藍、銀染色三種染料，不同染料又各自不同的染色方法，具體可參照郭堯君編著的《蛋白質電泳技術手冊》P82-103。

5.“微笑”（兩邊翹起中間凹下）形帶原因？

主要是由于凝膠的中間部分凝固不均勻所致，多出現(xiàn)于較厚的凝膠中。

處理辦法：待其充分凝固再作后續(xù)實驗。

6.“皺眉”（兩邊向下中間鼓起）形帶原因？

主要出現(xiàn)在蛋白質垂直電泳槽中，一般是兩板之間的底部間隙氣泡未排除干凈。

處理辦法：可在兩板間加入適量緩沖液，以排除氣泡。7.為什么帶出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象？

主要是樣品融解效果不佳或分離膠濃度過大引起的。

處理辦法：加樣前離心；選擇適當?shù)臉悠肪彌_液，加適量樣品促溶劑；電泳緩沖液時間過長，重新配制；降低凝膠濃度。

8.為什么帶出現(xiàn)紋理現(xiàn)象？

主要是樣品不溶性顆粒引起的。

處理辦法：加樣前離心；加適量樣品促溶劑。

9.什么是“鬼帶”，如何處理？

“鬼帶”就是在跑大分子構象復雜的蛋白質分子時，常會出現(xiàn)在泳道頂端（有時在濃縮膠中）的一些大分子未知條帶或加樣孔底部有沉淀，主要由于還原劑在加熱的過程中被