種苗快繁脫毒技術(shù)脫毒苗鑒定

種子生產(chǎn)基礎(chǔ)《種苗快繁脫毒技術(shù)-脫毒苗鑒定》目錄CONTENTS一直接檢測法指示植物法二三抗血清鑒定法分子生物學(xué)鑒定法四五電鏡檢測法直接檢測法

直接觀察植株生長狀態(tài)是否異常，莖葉上有無特定病毒可見癥狀，從而可判斷病毒是否存在。如矮縮病毒引起寄主植物葉片腿綠、壞死、扭曲、植株矮縮，花葉病毒引起寄主植物葉片脈間失綠等。簡便、直觀、準(zhǔn)確。一、直接檢測法指示植物法

對某種或某幾種病毒及類似病原物或株系具敏感反應(yīng)并表現(xiàn)明顯癥狀的植物稱為指示植物。二、指示植物法（一）草本指示植物鑒定

1．汁液涂抹法：取待測植物幼葉1～3g，加少量水及等量0.1mol/l磷酸緩沖液磨成勻漿。在指示植物葉上涂上一薄層500～600目的金剛砂，用脫脂棉球蘸勻漿在葉片上輕輕摩擦，以汁液進入細胞又不損傷葉片為度。5min后，以清水沖洗葉面多余的勻漿及金剛砂。置放蟲網(wǎng)內(nèi)數(shù)天至數(shù)周。觀察是否有癥狀。二、指示植物法汁液涂抹法的操作步驟蘋果莖溝病毒昆諾藜鑒定蘋果莖溝病毒莧色藜鑒定二、指示植物法2．小葉嫁接法取待測植物小葉嫁接到指示植物葉上，根據(jù)被嫁接指示植物葉上有無病毒癥狀，鑒定待測植物病毒。每株指示植物至少嫁接2片小葉，若待測植物有病毒，嫁接后15～25d，即會產(chǎn)生癥狀。二、指示植物法

（二）木本指示植物鑒定

1．直接在指示植物上嫁接待檢植株的芽片。２．雙重芽嫁接先將指示植物的芽嫁接到實生砧木基部距地面10～12cm處，再在接芽下方嫁接待檢植物芽，兩芽相距2～3cm。成活后剪去指示植物芽上部砧干。夏秋季芽接，次年可觀察。二、指示植物法

（3）雙芽嫁接法在休眠期剪取指示植物和待檢植物的接穗，萌芽前分別把帶有兩芽的指示植物接穗與待檢植物接穗同時切接在實生砧木上，指示植物接穗接在待檢接穗上方。二、指示植物法抗血清鑒定法

（一）原理人和動物感病后，血清中會產(chǎn)生抗體。刺激抗體產(chǎn)生的物質(zhì)多為蛋白質(zhì)，稱為抗原?？乖c抗體間能發(fā)生高度專一性的反應(yīng)，稱為血清學(xué)反應(yīng)（免疫反應(yīng)）。三、抗血清鑒定法

抗體存在于血清中，故叫抗血清。植物病毒是核酸和蛋白質(zhì)組成的復(fù)合體，因此，也是一種抗原，注射到動物體內(nèi)，會引起相應(yīng)特異抗體的產(chǎn)生。因此，利用特定病毒的抗血清．通討血清學(xué)反應(yīng)即可檢測該種病毒。三、抗血清鑒定法抗血清鑒定方法專一性強、快速簡便。

分離純化病毒（抗原），制備純凈的抗血清是抗血清鑒定中最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。

植物病毒抗血清的制備方法是：先提取、純化植物病毒，將高純度病毒注射到動物（如家兔、山羊、老鼠）體內(nèi)，再從動物血液中提取和純化抗血清。三、抗血清鑒定法

（二）方法

1．葉綠體凝集法采用待檢植物葉片提取液與專一抗血清發(fā)生凝結(jié)反應(yīng)檢測植物病毒，如煙草花葉病毒，馬鈴薯Y病毒等長形病毒

2．試管沉淀法即各種稀釋的抗血清與病毒抗原在小試管中混合反應(yīng)而產(chǎn)生沉淀，是常用的病毒檢測方法之一。長形病毒形成絮狀沉淀，球形病毒形成濃密粒狀沉淀。三、抗血清鑒定法3．環(huán)形接口法在毛細管或細長玻管中，抗原抗體通過擴散結(jié)合。病毒抗原位于上部呈層狀，少量抗血清向毛細管滲入，至達到足夠的抗原/抗體比率時，在該區(qū)域產(chǎn)生可見沉淀物。此法簡單快速。三、抗血清鑒定法

基本原理是用化學(xué)處理方法將酶與抗體（或抗原）結(jié)合，制成酶標(biāo)抗體（原），這些酶標(biāo)記物仍保持其免疫活性，能與相應(yīng)抗體或抗原特異結(jié)合形成酶標(biāo)記免疫復(fù)合物，遇相應(yīng)底物時，免疫復(fù)合物上的酶催化無色的底物，降解生成有色產(chǎn)物或沉淀物，前者可用比色法定量測定，后者可肉眼觀察或通過光學(xué)顯微鏡識別。4．酶聯(lián)免疫吸附分析法（ELISA）三、抗血清鑒定法分子生物學(xué)鑒定法1．雙鏈RNA法（dsRNA）

在受RNA病毒侵染的植物體內(nèi)，有相應(yīng)復(fù)制形式的雙鏈RNA（dsRNA）存在，而在健康植株中未發(fā)現(xiàn)病毒的dsRNA。通過提取純化待測植物RNA，并對其進行電泳分析，可確定有無dsRNA存在，從而判斷待檢植物是否帶病毒。四、分子生物學(xué)鑒定法2．互補DNA（cDNA檢測法）用互補DNA（cDNA）檢測病毒的方法又稱DNA分子雜交法。根據(jù)堿基互補原理，人工合成能與病毒堿基互補的DNA（cDNA）即cDNA探針，用cDNA探針與從待檢植物中提取的RNA進行DNA－RNA分子雜交，檢測有無病毒RNA存在，從而確定植物體內(nèi)有無該病毒。合成cDNA時，采用同位素標(biāo)記。因而檢測結(jié)果可通過放射自顯影顯示在圖像上，直觀、準(zhǔn)確。四、分子生物學(xué)鑒定法3．聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCRreversetranscriptionPCR,RT-PCR四、分子生物學(xué)鑒定法電鏡檢測法五、電鏡檢測法

運用電子顯微鏡可直接檢測待檢植物體內(nèi)有無病毒粒體存在，并根據(jù)所觀察病毒的形態(tài)、大小對病毒種類進行鑒定。完整成熟的病毒稱為病毒粒體，有固定形態(tài)和大小。病毒粒體的形態(tài)