基因工程酶學基礎

關于基因工程酶學基礎第1頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月第二章基因工程的酶學基礎第2頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月工具酶在生物技術中能用于DNA和RNA分子的切割、連接、聚合、反轉錄及其它修飾等有關的各種酶系統(tǒng)稱為工具酶。酶是DNA重組技術中必不可少的工具。第3頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月核酸水解酶類核酸合成酶類核酸修飾酶類核酸內(nèi)切酶核酸外切酶DNA聚合酶DNA連接酶RNA聚合酶磷酸酶核苷酸轉移酶核苷酸激酶甲基化酶第4頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月主要工具酶第5頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月第6頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶第二節(jié)DNA連接酶第三節(jié)DNA聚合酶和反轉錄酶第四節(jié)DNA修飾酶第7頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶核酸酶：核糖核酸酶RNase：脫氧核糖核酸酶DNase：核酸外切酶exonuclease：核酸內(nèi)切酶endonuclease：通過切割兩相鄰核苷酸殘基間的磷酸二酯鍵，使核酸分子的多核苷酸鏈發(fā)生水解斷裂的蛋白酶。專門水解斷裂RNA分子特異水解斷裂DNA分子

從核酸分子末端開始，一個一個核苷酸地消化降解多核苷酸鏈從核酸分子內(nèi)部切割磷酸二酯鍵使之斷裂形成小片段第8頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月限制性內(nèi)切酶Restrictionenzymes(分子手術刀)在DNA上核苷酸的特定連接處以特定的方式把DNA雙鏈打開。識別DNA上特定堿基組成的序列并在這些序列位點上切斷DNA分子水解磷酸二酯鍵的一種內(nèi)切核酸酶。第9頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月主要來源于原核生物自我保護作用功能來源據(jù)1994年美國出版的《分子生物學百科全書》統(tǒng)計，僅Ⅱ型限制性核酸內(nèi)切酶就已從各種不同的微生物中分離出了2300種以上，可識別230種不同的DNA序列。研究發(fā)現(xiàn)，細菌能將外來DNA片段在某些專一位點上切斷，而其自身的染色體DNA由于被一種特殊的酶所修飾而得以保護，一起構成限制-修飾系統(tǒng)。第10頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月早在上世紀60年代Linn和Arber在研究噬菌體的寄主范圍時發(fā)現(xiàn)如下的現(xiàn)象：分別在E.coli的K菌株和B菌株上生長的λ噬菌體（稱λK和λ

B）能高效感染各自的宿主;但用λK感染B菌株或用λ

B去感染K菌株則感染率會大大降低，這就是限制。如果一旦λK感染B菌株成功則在B菌株中形成的后代也就能高效感染B菌株，再也沒有限制現(xiàn)象，這個現(xiàn)象稱為修飾。限制和修飾是由宿主控制的，故稱為宿主控制的限制和修飾作用。限制-修飾系統(tǒng)第11頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月第12頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月限制限制性內(nèi)切酶將侵入細菌體內(nèi)的外源DNA切成小片斷。細菌自身的DNA堿基被甲基化酶修飾所保護，不能被自身的限制性內(nèi)切酶識別切割。修飾Dam甲基化酶：GATC腺嘌呤N6位置引入甲基Dcm甲基化酶：CCAGG或CCTGG序列在第二個C上C5位置引入甲基第13頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月現(xiàn)已從各種微生物中發(fā)現(xiàn)與鑒定出3800余種限制-修飾系統(tǒng)，其中有限制性內(nèi)切核酸酶3819個、甲基轉移酶844個?，F(xiàn)已商品化的限制酶624個，甲基轉移酶32個。1.限制性內(nèi)切核酸酶的類型Ⅰ型限制性內(nèi)切酶（90個）

Ⅱ型限制性內(nèi)切酶（3714個）

Ⅲ型限制性內(nèi)切酶（12個）

第14頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月

I型限制性內(nèi)切酶1968年首先由M.Meselson和R.Yuan在從大腸桿菌B株和K株分離（1）識別位點序列未甲基化修飾的特異序列

EcoB：TGA(N)8TGCT

EcoK：AAC(N)6GTGC（2）切割位點在距離特異性識別位點約1000—1500bp處隨機切開一條單鏈（3）作用條件需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）第15頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月首先由H.O.Smith和K.W.Wilcox在1970年從流感嗜血菌中分離第一個酶是HindⅡ，其次是

HindIII。II類限制性內(nèi)切酶（1）識別位點序列未甲基化修飾的雙鏈DNA上的特殊靶序列（多數(shù)是回文序列）,與DNA的來源無關。（2）切割位點識別位點處切開雙鏈DNA。形成粘性末端或平齊末端（3）粘性末端EcoRI5’-G

A

A

T

T

C-3’5’端凸出

3’-C

T

T

A

A

G-5’

EcoRV5’-G

A

T

A

T

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3’-C

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A

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A

G-5’PstI

5’-C

T

G

C

A

G-3’

3’-G

A

C

G

T

C-5’

3’端凸出

第16頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月III類限制性內(nèi)切酶在完全肯定的位點切割DNA（一般在識別位點24-26bp），但反應需要ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸）。EcoP1:AGACC——EcoP15:CAGCAG——在基因工程操作中用途不大第17頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月第18頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月2.限制性內(nèi)切核酸酶的命名1）用屬名的第一個字母和種名的頭兩個字母，構成酶的基本名稱。大腸桿菌（Escherichiacoli）用Eco表示；流感嗜血菌（Haemophilusinfluenzae）用Hin表示。2）將該菌株名的第一個字母加在基本名稱后，若酶的編碼基因位于噬菌體（病毒）或質粒上，則用一個大寫字母表示此染色體外遺傳成分。如HindⅡ：d菌株EcoRI：抗藥性R質粒3）如果一種特殊的菌株內(nèi)有幾種不同的限制與修復系統(tǒng)，用羅馬字母表示該菌株中發(fā)現(xiàn)某種酶的先后次序。4）還要冠以系統(tǒng)名稱。限制性內(nèi)切酶的系統(tǒng)命名為R，甲基化酶為M。如R.HindⅢ表示限制性內(nèi)切酶M.HindⅢ表示相應的甲基化酶。實際應用中，R常被省略。（EcoRI、HindⅢ）第19頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月1）識別序列的特異性未甲基化修飾的雙鏈DNA上的特殊靶序列（4-6bp，多數(shù)是呈典型的旋轉對稱型的回文結構）。與DNA的來源無關，即沒有種的特異性。3.Ⅱ型限制性內(nèi)切酶的基本特性第20頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月稀有切割限制性內(nèi)切核酸酶（rarecutter）可以識別6個以上的核苷酸序列的少數(shù)的限制內(nèi)切酶。如Not

I

（GCGGCCGC）某些限制性內(nèi)切酶的識別序列中，某一個或兩個堿基并非嚴格專一。如HindⅡ可識別不止一種核苷酸序列：

Y:C或TR:A或GGTYRAC-3’5’-HindⅡ可識別幾種核苷酸序列？GTCGAC和GTTAAC第21頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月2）Ⅱ型限制性內(nèi)切酶不具有甲基化功能Ⅱ型酶的甲基化修飾活性由相應的甲基化酶承擔。它們識別相同的DNA序列，但功能不同。如EcoRI限制性內(nèi)切酶和EcoRI甲基化酶前者：5’-GAATTC-3’

3’-CTTAAG-5’后者：5’-GAA*TTC-3’

3’-CTT*AAG-5作用的位點也不相同兩者命名如何區(qū)分？功能有何不同？第22頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月3）切割位點的特異性形成粘性末端（stickyend）或平齊末端（bluntend）i）不同的DNA雙鏈：只要粘性末端堿基互補就可以連接。這比連接兩個平齊末端容易得多。ii）同一個DNA分子內(nèi)連接：通過兩個相同的粘性末端可以連接成環(huán)形分子。粘性末端的意義①連接便利末端可用DNA多核苷酸激酶進行32P標記。粘性末端可以用DNA聚合酶補平成平齊末端。②末端標記③補平成平齊末端第23頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月粘性末端與平齊末端連接的處理方法?。┨硌a法：利用DNA聚合酶Ⅰ(klenowfragment）將堿基添補到目的基因的粘性末端上。ⅱ）削除(平)法利用S1和Bal31等核酸酶將目的基因粘性末端的單鏈突出部分削去，使其成為平齊末端第24頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月平齊末端的特點連接困難，連接效率低，只有粘性末端連接效率的1%，這種連接常出現(xiàn)多聯(lián)體連接。在識別序列的對稱軸上同時切割EcoRV5’-G

A

T

A

T

C-3’

3’-C

T

A

T

A

G-5’第25頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月不同來源的酶，識別相同的序列，切割方式相同或不同。識別位點和切點完全相同如HindⅢ

和HsuIHindⅢ

5’-A

A

G

C

T

T-3’3’-T

T

C

G

A

A-5’HsuI5’-A

A

G

C

T

T-3’3’-T

T

C

G

A

A-5’4.同切點酶（Isoschizomer)1）原型酶的同切點酶（同裂酶）：第26頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月識別位點相同，但切點不同。如XmaI和SmaI。2）新裂酶：第27頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月識別的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamHI、Bgl

Ⅱ、BclI、XhoⅡ等5’-G

G

A

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C

C-3’3’-C

C

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G-5’BamHIBclI5’-T

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A

G

A-5’BglⅡ5’-U

G

A

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C

T

A

G

U-5’Xho

ⅡU代表嘌呤；Y代表嘧啶。5.同尾酶(Isocaudamers）基因工程載體構建過程常用的同尾酶有：BamHI/BglII,EcoRI/MunI,SalI/XhoI,XbaI/SpeI。第28頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月同尾酶的粘性末端互相結合后形成的新位點一般不能再被原來的酶識別。5’-G3’-C

C

T

A

GG

A

T

C

T-3’A-5’BamHIBgl

Ⅱ5’-G

G

A

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T-3’3’-C

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A-5’5’-G

G

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C

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A

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G-5’5’-A

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A

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A-5’BamHIBgl

ⅡG

G

A

T

CCA

G

A

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C

T第29頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月6、影響限制性內(nèi)切酶活性的因素1）.DNA樣品的純度加大酶的用量，1ugDNA用10U酶擴大反應體積（>20l）延長保溫時間添加陽離子亞精胺一般采取在DNA樣品中若含有蛋白質，或沒有去除干凈制備過程中所用的乙醇、EDTA、SDS、酚、氯仿和某些高濃度金屬離子，均會降低限制酶的催化活性，甚至使限制酶不起作用。

DNA的濃度不宜過高，高濃度的DNA會使溶液的粘度增加從而抑制酶分子的擴散導致酶切反應不徹底。常為50ul內(nèi)含1ugDNA。第30頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月大腸桿菌一般有兩種甲基化酶修飾質粒：2）DNA的甲基化程度DNA腺嘌呤甲基化酶（DNAadeninemethylas,dam)（修飾GATC中的A）；DNA胞嘧啶甲基化酶（DNAcytosineethylas,dcm)（修飾CCA/TGG的C）。基因工程中必須使用甲基化酶失活突變的菌株。哺乳動物的DNA通常在鳥嘌呤核苷殘基的5'側也發(fā)生甲基化。甲基化程度與DNA來源的細胞類型、環(huán)境等有密切的關系?？梢愿鶕?jù)各種同裂酶所具有的不同的甲基化的敏感性對真核基因組DNA的甲基化作用模式進行研究。例如，當CCGG序列中內(nèi)部胞嘧啶殘基被甲基化之后，MspI仍會將它切割，而HpaII(正常情況下能切割CCGG序列)對此類的甲基化作用則十分敏感。第31頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月不同的限制性內(nèi)切酶的最適反應溫度不同。大多數(shù)是37oC，少數(shù)要求40-65oC。3）酶切反應的溫度第32頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月4）DNA分子的構型構型：對超螺旋的質粒或病毒DNA酶切時，所需酶量大于線性狀態(tài)。位點偏愛性：EcoRⅠ酶切割噬菌體中的5個位點時，近左端的位點比分子中間的位點切割快10倍。對只含識別序列不具催化活性：必須在兩側各延長一個或幾個核苷酸。（設計引物帶酶切位點必須考慮保護堿基）第33頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月第34頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月是影響限制酶活性的重要因素5）緩沖液(Buffer)緩沖液的化學組成MgCl2、NaCl/AcK

：提供Mg2+和離子強度Tris-HCl：維持pH,大多數(shù)為7-7.6二硫蘇糖醇（DTT）：防止酶氧化,保持酶穩(wěn)定性牛血清白蛋白（BSA）等：中性蛋白質,防止酶在低濃度的蛋白質溶液中變性商品化的限制酶一般都帶有專用緩沖液第35頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月如果改變反應條件就會影響酶的專一性和切割效率，稱為星號（*）活性。7、酶的星號活性特異性的限制性內(nèi)切酶介導的DNA裂解，可以從這些酶的最適合的不同的反應條件下發(fā)生的松弛或改動的。其結果通常是在非規(guī)范的識別位點裂解，或有時完全喪失的特異性。在低鹽、高pH（>8）時可識別和切割GAATTA、AAATTC、GAGTTC等GAATTCEcoRI：第36頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月誘發(fā)星（*）活性的原因酶量不宜過多，盡量遵循生產(chǎn)商推薦的反應條件高濃度甘油AvaI、AvaⅡ、PstI、XbaI堿性PH值AviⅡ、MstI低離子強度ApeI低鹽濃度

Bst707I低PH值PshBI其他二價離子代替mg2+(Mn,Cu,Co,Zn等)HindⅢ、SfiIβ-巰基乙醇+低離子強度AvaⅢ有機溶劑(DMSO、乙醇等)酶與底物DNA比例過高第37頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月第38頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月8、限制性內(nèi)切酶對DNA的消化內(nèi)切酶與識別序列的結合模式

1986年J.A.McClarin等通過X射線晶體衍射發(fā)現(xiàn)II類限制酶是以同型二聚體的形式與靶序列結合。第39頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月1）DNA分子的單酶切環(huán)狀DNA：完全酶切時，產(chǎn)生與識別序列數(shù)(n)相同的DNA片斷數(shù)，且DNA片斷的兩末端相同；線性DNA：n+1片斷數(shù)。EcoRIEcoRIEcoRIEcoRIEcoRIEcoRI第40頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月2)DNA分子的雙酶切消化在相同的緩沖液中反應同時進行若需要不同的緩沖液,采用3種方法ⅰ)先用要求低離子強度的酶切割（低鹽酶）,再加NaCl調節(jié)離子強度,并用第二種酶切割（高鹽酶）；ⅱ)先用最適反應溫度較低的酶，升溫后再加入第二種酶；ⅲ)反應體系相差大的，第一種酶切反應后回收，再切割。第41頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月第42頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月基因工程中一般使用雙酶切？BamHIEcoRIEcoRIEcoRIBamHIBamHIEcoRIBamHI單酶切陽性克隆比例非常低；單酶切無方向性。第43頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月3）完全酶切消化與不完全酶切10kb1kb3kb6kbEcoRIEcoRI6kb3kb1kb10kb9kb1kb6kb4kb3kb完全酶切不完全酶切通過縮短保溫時間、降低反應溫度、增大反應體積或減少酶量可達到局部消化的目的。第44頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月9、酶切反應的終止65℃保溫20min，或70℃10min。加入終止反應液，多為電泳上樣緩沖液，主要成分為50%甘油，100mMEDTA（pH=8.0），1%SDS和0.1%溴酚藍。用飽和酚、氯仿抽提DNA方法純化。第45頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月10、酶切反應的操作過程配酶解體系混勻反應終止酶解結果鑒定ddH2O+buffer+DNA+酶一般20μl，酶體積不超過總體積的10%，盡量降低反應總體積。DNA量大的情況下，可適當放大反應體系。移液槍吹打或手指輕彈管壁應避免強烈振蕩。離心機短暫離心，使管壁液體全部下沉。瓊脂糖凝膠電泳200010007505002501001：pBS-T空載體（EcoRⅠ+HindⅢ）；2,3：重組質粒（EcoRⅠ+HindⅢ）；4：目的基因；第46頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月10.Ⅱ型限制性內(nèi)切酶的主要用途第47頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月BamHIEcoRIBamHI思考題1載體基因1500bp2000bp如何將該基因完整片段整合到載體上？第48頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月方法1：單酶切BamHI載體基因1500bp2000bpBamHIEcoRI載體EcoRIEcoRI缺點？第49頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月如何鑒定單酶切連接產(chǎn)物方向BamHIEcoRIBamHI載體基因1500bp2000bp第50頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月方法2：部分酶切（雙酶切）BamHI載體基因1500bp2000bpBamHIEcoRI載體EcoRI缺點？BamHIEcoRIBamHIBamHI第51頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月EcoRIBamHIBamHI1.EcoRI完全酶切EcoRIBamHIBamHI2.BamHI部分酶切EcoRIBamHIBamHI部分酶切的方法？部分酶切的結果多少條帶？1500bp2000bp13510min第52頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月方法3：同尾酶（雙酶切）BamHI載體基因1500bp2000bpBamHIEcoRI載體EcoRI缺點？BamHIEcoRIBgl

IIBamHIBglII?MunI?第53頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月GCCTAG

AATTCGGATCCGGCTTAA

GATCCGGCTTAA

BamHIEcoRIBamHIEcoRI第54頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)DNA連接酶1、DNA連接酶（ligase)的發(fā)現(xiàn)1967年，世界上數(shù)個實驗室?guī)缀跬瑫r發(fā)現(xiàn)了一種能夠催化在2條DNA鏈之間形成磷酸二酯鍵的酶，即DNA連接酶。

定義：一種能夠催化雙鏈DNA片段靠在一起的3′羥基末端與5′磷酸基團末端，通過磷酸二酯鍵連接在一起的核酸酶第55頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月2、DNA連接酶的性質修復DNA-DNA雙鏈上的單鏈缺口；連接RNA-DNA雜交雙鏈上的DNA單鏈缺口；連接兩個完全斷開的平末端雙鏈DNA分子。X第56頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA連接酶催化的連接反應特點：需要在一條DNA鏈的3’-末端具有一個游離的羥基(-OH)，和在另一條DNA鏈的5’-末端具有一個磷酸基團(-P)。利用NAD或ATP作能源。不能連接兩條單鏈的DNA分子或環(huán)化的單鏈DNA分子，被連接的DNA鏈必須是雙螺旋的一部分。只封閉缺口，不封閉裂口。第57頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月3、常用的DNA連接酶對RNA-DNA分子無效活性低，不常用第58頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月4、DNA連接酶作用機理ATP（NAD+)提供激活的AMP。ATP與連接酶形成共價“連接酶-AMP”復合物，并釋放出焦磷酸PPi。AMP與連接酶的賴氨酸-氨基相連。AMP隨后從連接酶的賴氨酸-氨基轉移到DNA一條鏈的‘端P上，形成“DNA-腺苷酸”復合物。-OH對磷原子作親核攻擊，形成磷酸二脂鍵，釋放出AMP。第59頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月5、影響連接反應的因素1）反應溫度連接酶反應的最佳溫度是37C。實用溫度粘性末端：一般采用4-16C。平末端：一般采用10-20C。但在37℃下粘性末端的結合很不穩(wěn)定。第60頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月

T4DNA連接酶的活性一般用Weiss單位來衡量，即37℃條件下20min內(nèi)可使1nmol/L32P在有機焦磷酸與ATP之間產(chǎn)生交換的酶量為1個活性單位。黏性末端連接酶濃度0.1單位以上即可，而平末端連接可能需要1-2個活性單位。

反應時間，在16℃時，4h即可，而在4℃時則需連接過夜。2）連接酶濃度第61頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月3）ATP濃度一般，濃度范圍在10μmol-1mmol/L，ATP最適的終濃度為0.5mmol/L。ATP濃度高至5mmol/L，影響平頭末端的連接。ATP濃度高至7.5mmol/L，抑制粘性末端及平頭末端的連接。第62頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月

相同的分子末端間存在競爭，形成不同構型的DNA分子（自身環(huán)化、線形多聚體、環(huán)化多聚體以及重組質粒）。分子越小、濃度越低越容易形成自身環(huán)化；另要注意載體與目的DNA濃度之比。4.DNA片段末端類型與濃度插入片段：載體=3:1增加插入片段與載體的接觸機會，減少載體自我連接的現(xiàn)象。單酶切產(chǎn)物連接比例需要更高。第63頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月從分子動力學的角度講，由限制性核酸內(nèi)切酶創(chuàng)造的粘性末端的連接屬于分子內(nèi)部的連接，而平頭末端的連接則屬于分子間的連接，因此后者反應速度要慢得多。6、平頭雙鏈DNA片段的連接操作提高平頭末端連接效率的方法包括：加大連接酶用量（10倍大于粘性末端的連接）加大平頭末端底物的濃度，增加分子間碰撞機會加入10%PEG8000，促進大分子之間的有效作用加入單價陽離子（NaCl），最終濃度150-200mM第64頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月7、DNA連接的反應體系DNA+vector3:1ligase0.5-1UH2Oupto10-20ulligasebuffer第65頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月第三節(jié)DNA聚合酶1、基因工程中常用的DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶I、Klenow聚合酶、TaqDNA聚合酶T7DNA聚合酶、T4DNA聚合酶、逆轉錄酶第66頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月1）共同特點把dNTPs連續(xù)地加到引物的3’—OH端，催化核苷酸聚合，合成與模板互補的DNA序列2）主要區(qū)別T7DNA聚合酶可以連續(xù)添加數(shù)千個dNTPs而不從模板上掉下來。其它幾種DNA聚合酶只能連續(xù)添加10多個dNTPs就會從模板上解離下來。2、常用DNA聚合酶的特點持續(xù)合成能力和外切酶活性不同。第67頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月第68頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月第69頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月3'→5'外切酶活性──校對作用：這種酶活性的主要功能是從3'→5'方向識別和切除不配對的DNA生長鏈末端的核苷酸。當反應體系中沒有反應底物dNTP時，由于沒有聚合作用而出現(xiàn)暫時的游離現(xiàn)象，從而被3'→5'外切酶活性所降解。當向反應體系加入dNTP，而且只加放與模板互補的上述核苷酸才會使這種外切酶活性受到抑制，并繼續(xù)進行DNA的合成。由此推論，3'→5'外切酶活性的主要功能是校對作用，當加入的核苷酸與模板不互補而游離時則被3'→5'外切酶切除，以便重新在這個位置上聚合對應的核苷酸。第70頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月5'→3'外切酶活性──切除修復作用：5'→3'外切酶活性就是從5'→3'方向水解DNA生長鏈前方的DNA鏈，主要產(chǎn)生5'-脫氧核苷酸。這種酶活性只對DNA上配對部分（雙鏈）磷酸二酯鍵有切割活力作用，方向是5'→3'。每次能切除10個核苷酸，而且DNA的聚合作用能刺激5'→3'外切酶活力達10倍以上。因此，這種酶活性在DNA損傷的修復中可能起著重要作用。對岡崎片段5'末端RNA引物的去除依賴此種外切酶活性。第71頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月3、常用DNA聚合酶的用途1）大腸桿菌DNA聚合酶I(PolI)活性:5`→3`聚合活性,5`→3`外切和3`→5`外切活性發(fā)揮生物學活性的條件：（1）DNA模板（可以是單鏈或雙鏈）（2）帶有3`-端游離羥基(3'-OH)的引物鏈（3）底物和激活劑應用:缺口平移法(nicktranslation)標記DNA探針注:對雙鏈DNA，當有dNTPs存在時，3`→5`降解活性會

被5`→3`方向的聚合活性所抑制。第72頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月第73頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月缺口DNaseIDNA聚合酶IDNA聚合酶IdNTP*缺口缺口平移法制備DNA分子探針第74頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月2.Klenow聚合酶Klenow聚合酶即大腸桿菌DNA聚合酶I大片段（klenowfragment)活性:具有5'3’聚合酶活性和3'5’外切酶活性.

(失去了5'3'外切酶活性）用途：第75頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月第76頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月從棲熱水生菌（Thermusaquaticus）分離，最適溫度75℃-80℃。特點：熱穩(wěn)定性70℃反應2h殘留活性為原來的90%；93℃反應2h殘留活性為原來的60%；94℃反應2h殘留活性為原來的40%?；钚裕壕哂?'3’聚合酶活性和5'3'外切酶活性.

(無3'5’外切酶活性）應用：（1）DNA序列測定（2）PCR：對DNA的特定片段進行體外擴增3.TaqDNA聚合酶第77頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月4.T4DNA聚合酶T4-DNA酶的基本特性：與klenow聚合酶一樣，但是3`→5`

的核酸外切酶活性要強200倍。有3`→5`的核酸外切酶活性和5`→3的DNA聚合酶活性在無dNTP時，可以從任何3`-OH端外切在只有一種dNTP時，外切至互補核苷酸在四種dNTP均存在時，聚合酶活性占主導地位第78頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月切割3'凸出末端補平5'凸出末端DNA3'端標記第79頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月5.T7DNA聚合酶活性:5`→3`聚合酶活性；3`→5`外切酶活性，無5`→3`外切酶活性特點:與T4DNA聚合酶相似，3`→5`外切酶活性更強，為klenow聚合酶的1000倍，并具有極佳的連續(xù)合成能力,不受DNA二級結構的影響。應用：（1）用于長模板DNA的引物延伸反應；（2）通過單純的延伸或取代合成途徑標記DNA的3`末端；（3）使雙鏈DNA的5`或3`突出末端變成平末端測序酶：化學方法修飾的T7DNA聚合酶，無外切酶活性，修飾后聚合酶活性增加3倍。更適合序列分析。第80頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月逆轉錄酶(reversetranscriptase)：又稱為RNA指導的DNA聚合酶?；钚裕壕?`→3`聚合酶活性和RNaseH活性。聚合作用所需模板可以是RNA或DNA，引物是帶3`-OH的RNA或DNA。6.逆轉錄酶AMV反轉錄酶(禽類骨髓細胞瘤病毒)：具反轉錄酶活性，強RNaseH活性。反應溫度42℃，最適pH8.3。小片段cDNA的反轉錄；M-MLV反轉錄酶(小鼠白血病病毒)：具反轉錄酶活性，弱RNaseH活性，以RNA-DNA為底物的5’-3’外切酶活性。反應溫度37℃，42℃時迅速失活，最適pH7.6。反轉錄的cDNA片段可達5kb。第81頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月反轉錄實驗：去除DNA（DNase消化）RNA變性（65℃5min立即冰浴）引物結合（polyA\隨機引物\特異引物）cDNA合成（42℃）bufferdNTP反轉錄酶可加RNase抑制劑第82頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月第四節(jié)修飾酶一、堿性磷酸酶功能：

催化核酸脫去5`-磷酸基團，使DNA或RNA片段5`-P末端轉換成5`-OH末端。來源：有兩種，分別來自于大腸桿菌和小牛腸道，前

者叫bacterialalkalinephosphatase(BAP);后

者叫calfintestinalalkalinephosphatase(CIAP)第83頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月主要用途：在用32P標記DNA5’端之前，去除5'端的磷酸；在DNA重組技術中，去除DNA片段5'磷酸，防止載體的自身環(huán)化。第84頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月二、T4多核苷酸激酶1.來源T4polynucleotidekinase由T4噬菌體的pseT基因編碼。從T4感染大腸桿菌細胞中分離出來。多種哺乳動物細胞中也發(fā)現(xiàn)這種酶。2.功能催化磷酸從ATP轉給雙鏈或單鏈DNA或RNA的5’-OH端。不論5’-OH端突出與否。3.多核苷酸激酶的用途DNA5’-OH端磷酸化、標記DNA的5’端使缺失5`-P末端的DNA發(fā)生磷酸化作用第85頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月三、末端轉移酶是末端脫氧核苷酸轉移酶（terminaldeoxynucleotidyltansferase,TdT）的簡稱，來自于小牛胸腺組織，在DNA分子的3'-OH端增加一個或多個脫氧核苷酸特點①5’3’DNA聚合酶活性②不需要模板！③底物可以是單鏈DNA、3’-OH突出的雙鏈DNA、

平末端在Co2+代替Mg2+下也可以。④隨機添加dNTPs。如果只有一種dNTP，就添

加上同聚物。第86頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月

用途：

(1)主要用于給外源DNA片段和及載體分子加上互

補同聚物尾巴；

(2)標記DNA片段的3`末端。第87頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月四、核酸酶1.S1核酸酶來源：來源于稻谷曲霉（Aspergillusoryzae）功能：是一種高度單鏈特異的核酸內(nèi)