ELISA的原理及分類(lèi)完整版資料

ELISA的原理及分類(lèi)50年代的免疫熒光（IFA）和60年代的放射免疫(RIA)分析技術(shù)之后，在70年代初期又建立了用酶來(lái)標(biāo)記抗原或抗體的分析技術(shù)。由于酶的高效生物催化作用，一個(gè)酶分子在數(shù)分鐘內(nèi)可以催化幾十幾百個(gè)底物分子發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生了放大作用，使得原來(lái)極其微乎其微的抗原或抗體在數(shù)分鐘后就可被識(shí)別出來(lái)，這種技術(shù)被稱為酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法?，F(xiàn)已成功地應(yīng)用于多種病原微生物所引起的傳染病、寄生蟲(chóng)病及非傳染病等方面的免疫診斷。ELISA的基本原理酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA）概念：以酶作為標(biāo)記指示物、以抗原抗體免疫反應(yīng)為基礎(chǔ)的固相吸附測(cè)定方法。三個(gè)方面：固相支持物包被的抗原或抗體酶標(biāo)記的抗體或抗原和酶反應(yīng)底物

1.抗原(antigen，Ag)

一個(gè)完整的抗原應(yīng)包括兩方面的免疫性能：①免疫原性(immunogenicity):誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生免疫應(yīng)答的能力，具有這種能力的物質(zhì)稱為免疫原(immunogen)；②免疫反應(yīng)性(immunoreactivity):抗原與抗體或致敏淋巴細(xì)胞發(fā)生特異性結(jié)合的能力。2.抗原的基本理化特性——?大于Ab或者TCR的抗原結(jié)合部位 ?無(wú)機(jī)物不能成為抗原；?分子量太?。ㄈ鐚?duì)氨基苯甲酸，DNP）的有機(jī)物不能成為抗原；?蛋白質(zhì)是最主要、最常見(jiàn)的抗原；?多糖、脂肪、核苷酸等有機(jī)大分子能被B細(xì)胞和gd-T細(xì)胞所識(shí)別。

3.最大特性：免疫應(yīng)答的特異性

某一特定抗原只能刺激機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)該特定抗原的細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答；

某一特定抗原只能與其相應(yīng)的特異抗體或致敏淋巴細(xì)胞產(chǎn)生結(jié)合反應(yīng)。4.抗原抗體的結(jié)合:

實(shí)質(zhì)上只發(fā)生在抗原的抗原決定簇與抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)之間。由抗原決定簇和抗體分子超變區(qū)之間空間結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)性決定的。

抗體分子N端可變區(qū)形成3nm×1.5nm×0.7nm的槽溝，只有與其空間結(jié)構(gòu)互補(bǔ)的抗原決定簇才能如楔狀嵌入。

由于兩者在化學(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型上呈互補(bǔ)關(guān)系，所以抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性。

抗體1抗體2抗體3例如：乙肝病毒中的HBsAg誘導(dǎo)機(jī)體的免疫應(yīng)答產(chǎn)生只針對(duì)病毒表面抗原成分的抗體，HBeAg和HBcAg也可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，雖然這兩種也來(lái)源于同一病毒，但表面抗原僅與其相應(yīng)的抗體結(jié)合，而不與另外兩種抗體反應(yīng)。

抗原抗體反應(yīng)的這種特異性使免疫測(cè)定能在非常復(fù)雜的蛋白質(zhì)化合物（例如血清）中測(cè)定某一特定的物質(zhì)，而不需先分離待檢物。但是這種特異性也不是絕對(duì)的。交叉反應(yīng)(crossreaction)當(dāng)兩種不同的抗原物質(zhì)具有部分相同或類(lèi)似結(jié)構(gòu)的抗原決定簇，則可與彼此相應(yīng)的抗體反應(yīng)，從而在抗原抗體反應(yīng)中可出現(xiàn)交叉反應(yīng)。

例如：絨毛膜促性腺激素（hCG）和黃體生成激素（LH）均由α和β兩個(gè)亞單位組成，其結(jié)構(gòu)的不同處在β亞單位，而兩者的α亞單位是同類(lèi)的。用hCG免疫動(dòng)物所得的抗血清中含有抗α-hCG和抗β-hCG兩種抗體，抗α-hCG抗體將與LH中的α酶位發(fā)生交叉反應(yīng)。在臨床檢驗(yàn)中，如用抗hCG抗血清作為妊娠診斷試劑檢定尿液中hCG，只能用于hCG濃度較高的試驗(yàn)，否則婦女生理性排泄入尿液中的微量LH將與之發(fā)生交叉反應(yīng)。因此在作為早孕診斷（敏感度應(yīng)達(dá)到50mIu/mlhCG）的實(shí)際中必須應(yīng)用只對(duì)hCG特異的抗β-hCG，以避免與其它激素的交叉反應(yīng)的發(fā)生。1.用于免疫測(cè)定方法建立的抗原----ELISA方法純化抗原：如HBsAg

從體液，組織或病原體培養(yǎng)物等中采用物理化學(xué)方法：超速離心，過(guò)濾層析，電泳分離等分離獲得。注：純化抗原的純度對(duì)相應(yīng)的免疫測(cè)定方法的特異性有較大的影響合成抗原（多肽片段）如HCV

缺乏完整的立體構(gòu)型決定簇，導(dǎo)致抗體的漏檢?；蚬こ炭乖璈BcAg,HBeAg和HCV

早期：多為病原體的部分抗原，導(dǎo)致敏感性上缺陷。融合蛋白：對(duì)抗原的生物學(xué)和免疫學(xué)特性能最大程度的保留，工業(yè)化大量生產(chǎn)，沒(méi)有提純抗原存在的傳染危險(xiǎn)性?？乖诸?lèi)2.干擾免疫測(cè)定的抗原多為機(jī)體內(nèi)源性抗原異嗜性抗原：不同種屬的動(dòng)物/植物和微生物細(xì)胞表面上的共同抗原，廣泛的交叉性，故影響免疫測(cè)定的特異性。免疫球蛋白：免疫應(yīng)答的產(chǎn)物?抗體最常見(jiàn)的類(lèi)風(fēng)濕因子（RF），可于變性的IgG發(fā)生特異的結(jié)合，在ELISA引起非特異性反應(yīng)?？贵w—分類(lèi)在感染或疫苗接種以后，最先出現(xiàn)的抗體是IgM；血內(nèi)含量低、半衰期短、出現(xiàn)早、消失快、組織穿透力弱，故其保護(hù)作用實(shí)際上常不如IgG。在抗原的反復(fù)刺激下，可通過(guò)Ig基因的類(lèi)轉(zhuǎn)換而轉(zhuǎn)向IgG合成IgG是再次免疫應(yīng)答的主要抗體；合成速度快、分解慢、半衰期長(zhǎng)?？勺鞅Ｗo(hù)性抗體。IgGIgAIgDIgMIgAIgE多為機(jī)體內(nèi)源性抗原基因工程抗原HBcAg,HBeAg和HCV再加入特異抗原，與固相上捕獲的IgM抗體結(jié)合包被的抗原或抗體這種雙位點(diǎn)夾心法具有很高的特異性。原理：利用酶標(biāo)記的抗抗體（抗人免疫球蛋白抗體）以檢測(cè)與固相抗原結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法。保存血清自采集時(shí)就應(yīng)注意無(wú)菌操作類(lèi)風(fēng)濕因子（RF，IgM類(lèi)）及其他非特異性IgM的干擾非特異性IgM在第一步溫育中，可與特異性IgM競(jìng)爭(zhēng)與固相抗體結(jié)合，所以影響測(cè)定的靈敏度。因此在使用一步法試劑測(cè)定標(biāo)本中含量可異常增高的物質(zhì)（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）時(shí)，應(yīng)注意可測(cè)范圍的最高值。醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中均以血清作為檢測(cè)標(biāo)本洗滌的方式：某些ELISA儀器配有特殊的自動(dòng)洗滌儀抗原(antigen，Ag)血清標(biāo)本可按常規(guī)方法采集，應(yīng)注意避免溶血，紅細(xì)胞溶解時(shí)會(huì)釋放出具有過(guò)氧化物酶活性的物質(zhì)，以HRP為標(biāo)記的ELISA測(cè)定中，溶血標(biāo)本可能會(huì)增加非特異性顯色。制備抗體的發(fā)展技術(shù)：多克隆抗體：免疫動(dòng)物后從血清中所得?？乖ǔ６加性S多的抗原決定簇，所得抗體為針對(duì)這些所有抗原決定簇的抗體混合物?？贵w的親和力和特異性相對(duì)低于單克隆抗體。單克隆抗體：雜交瘤技術(shù)缺點(diǎn)：結(jié)合的單一性，產(chǎn)生假陰性混合單克隆抗體：雜交瘤技術(shù)雙特異性單克隆抗體或多抗：雜交瘤技術(shù)基因工程抗體：基因工程技術(shù)HRP的色原底物--反應(yīng)形式：氧化還原底物的氧化作用?！狾PD（鄰苯二胺）1.原理：在HRP的作用下，由過(guò)氧化氫（H2O2）氧化而聚合成2，2‘-二氨基偶氮苯（DAB）顯色在pH5.0左右時(shí)，DAB在波長(zhǎng)450nm處有廣范圍的最大吸收。2.由于不穩(wěn)定性，在試劑盒中，OPD均以片劑或粉劑供應(yīng)，臨用前溶解。3.缺點(diǎn)：對(duì)機(jī)體具有致突變作用。

—TMB（四甲基聯(lián)苯胺）

1.優(yōu)于OPD2.原理：在HRP的作用下，由過(guò)氧化氫（H2O2）氧化合成聯(lián)苯醌，在波長(zhǎng)450nm處有最大消光系數(shù)。3.A液和B液：一種為T(mén)MB溶液，一種為一定濃度的過(guò)氧化氫溶液。4.如發(fā)現(xiàn)底物A和（或）B出現(xiàn)顏色，或二者各取一滴混合后顯色，說(shuō)明該試劑盒的底物溶液已變質(zhì)或已受污染，必須廢棄。顯色和終止反應(yīng)TMB（無(wú)色）

TMB陽(yáng)離子根（藍(lán)色）

聯(lián)苯醌（黃色）

λmax=370和650nmλmax=450nmHRPHRP酸性固相支持物及抗原抗體的固相化一般有聚苯乙烯、聚氯乙稀、硝酸纖維素膜等。多用聚苯乙烯塑料---好的光透性和蛋白吸附能力、易加工、價(jià)格低廉。1.聚苯乙烯的主鏈結(jié)構(gòu)為碳鏈，側(cè)鏈為非極性集團(tuán)，表面成疏水性。2.抗體或抗原蛋白被動(dòng)吸附于固相時(shí)，疏水鍵是其吸附于聚苯乙烯等疏水性固相表面的主要作用力。3.缺點(diǎn)：孔間變異較大，重復(fù)性差。改善ELISA測(cè)定的重復(fù)性：間接非共價(jià)吸附方法－－proteinA、抗IgG或鏈霉親和素等作為中介物而吸附于固相上。共價(jià)吸附法－－化學(xué)交聯(lián)試劑如戊二醛法，在其作用下抗體或抗原的活性基團(tuán)與固相反應(yīng)形成共價(jià)鍵而成。ELISA載體的形狀主要有三種：微量滴定板、小珠和小試管。以微量滴定板最為常用，專(zhuān)用于EILSA的產(chǎn)品稱為ELISA板，國(guó)際上標(biāo)準(zhǔn)的微量滴定板為8×12的96孔式。已有多種自動(dòng)化儀器用于微量滴定板型的ELISA檢測(cè)，包括加樣、洗滌、保溫、比色等步驟，對(duì)操作的標(biāo)準(zhǔn)化極為有利。聚苯乙烯經(jīng)射線照射后，其吸附性能特別是對(duì)免疫球蛋白的吸附性能增加良好的ELISA板應(yīng)該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間、同一板各孔之間性能相近。ELISA基本原理1.抗原抗體反應(yīng)在固相支持物上進(jìn)行；2.反應(yīng)結(jié)果的判斷以酶與其底物作用后的顯色或產(chǎn)生熒光或發(fā)光反應(yīng)為準(zhǔn)則；3.顯色強(qiáng)度產(chǎn)生熒光或發(fā)光反應(yīng)與臨床標(biāo)本中待測(cè)物的濃度成正比或反比關(guān)系。國(guó)內(nèi)試劑盒均以酶的顯色反應(yīng)來(lái)完成測(cè)定。酶學(xué)ELISA基本原理1.抗原或抗體的固相化抗原或抗體能以物理性地吸附于固相載體表面，并保持其免疫學(xué)活性；2.抗原或抗體的酶標(biāo)記抗原或抗體可通過(guò)共價(jià)鍵與酶連接形成酶結(jié)合物，而此種酶結(jié)合物仍能保持其免疫學(xué)和酶學(xué)活性；

3.酶結(jié)合物與相應(yīng)抗原或抗體結(jié)合后，可根據(jù)加入底物的顏色反應(yīng)來(lái)判定是否有免疫反應(yīng)的存在，而且顏色反應(yīng)的深淺是與標(biāo)本中相應(yīng)抗原或抗體的量成正比例的，因此，可以按底物顯色的程度顯示試驗(yàn)結(jié)果。ELISA試劑盒包含以下各組分：

1.已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）；

2.酶標(biāo)記的抗原或抗體（結(jié)合物）；

3.酶的底物；

4.陰性對(duì)照品和陽(yáng)性對(duì)照品（定性測(cè)定中），參考標(biāo)準(zhǔn)品和控制血清（定量測(cè)定中）；

5.結(jié)合物及標(biāo)本的稀釋液；

6.洗滌液；

7.酶反應(yīng)終止液。在測(cè)定時(shí)受檢標(biāo)本（測(cè)定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開(kāi)。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，也通過(guò)反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時(shí)固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。靈敏度和特異性由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測(cè)定方法達(dá)到很高的敏感度。特異性：1.抗原與相應(yīng)的抗體的結(jié)合具有高度特異性2.酶標(biāo)記物與相應(yīng)抗原或抗體結(jié)合具有高度特異性3.酶的催化具有高度特異性臨床ELISA測(cè)定的常用模式一、檢測(cè)抗原：（1）雙抗體夾心法測(cè)抗原雙抗體夾心法適用于測(cè)定二價(jià)或二價(jià)以上的大分子抗原，適用于檢驗(yàn)各種蛋白質(zhì)等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。但不適用于測(cè)定半抗原及小分子單價(jià)抗原，因其不能形成兩位點(diǎn)夾心?？贵w的來(lái)源為多克隆抗體即抗血清時(shí)，包被和酶標(biāo)用的抗體最好分別取自不同種屬的動(dòng)物。應(yīng)用單克隆抗體，一般選擇兩個(gè)針對(duì)抗原上不同決定簇的單抗，分別用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物。這種雙位點(diǎn)夾心法具有很高的特異性。兩步法雙抗體夾心法測(cè)抗原酶標(biāo)抗體固相抗體待測(cè)抗原EE溫育洗板溫育洗板溫育兩步法中抗原抗體遵循下述規(guī)律1.Ab＋AgAb·Ag（復(fù)合物）2.Ab·Ag＋Ab*Ab·Ag·Ab*（復(fù)合物）隨著待測(cè)抗原濃度的增加，顯色程度也逐步加深，當(dāng)抗原濃度增加到一定程度時(shí)，反應(yīng)顯色達(dá)到平臺(tái)，不再加深，呈S形變化曲線吸光度抗原兩步法ELISA抗原濃度與顯色變化的反應(yīng)曲線圖臨床工作中多采用一步法將待測(cè)樣本和酶標(biāo)抗體同時(shí)加入，從而僅有一步溫育和洗板過(guò)程，即為通常所說(shuō)的“一步法”。EEE溫育洗板溫育固相抗體待測(cè)抗原酶標(biāo)抗體一步法測(cè)定時(shí)結(jié)合形式Ab＋Ag＋Ab*Ab·Ag·Ab*---aAb·Ag---bAg·Ab*---cAb*·Ag·Ab*---d

a為最后測(cè)定結(jié)果的顯色之源，當(dāng)待測(cè)種抗原濃度增加時(shí)，無(wú)疑會(huì)使b，c和d復(fù)合物增加，從而消耗有限的Ab*，使a復(fù)合物相應(yīng)減少，顯色降低，吸光度對(duì)抗原濃度的變化曲線呈鐘形。鉤狀效應(yīng)抗原濃度與顯色變化的反應(yīng)曲線為鐘形曲線測(cè)定顯色隨著待測(cè)標(biāo)本中抗原濃度的增加升高至一定程度后，測(cè)定吸光度即隨抗原濃度的增加而開(kāi)始下降直至不顯色，出現(xiàn)假陰性結(jié)果。一步法抗原濃度與顯色變化的反應(yīng)曲線抗原吸光度因此在使用一步法試劑測(cè)定標(biāo)本中含量可異常增高的物質(zhì)（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）時(shí)，應(yīng)注意可測(cè)范圍的最高值。用高親和力的單克隆抗體制備此類(lèi)試劑可削弱鉤狀效應(yīng)。如包被使用一種單抗，酶標(biāo)記使用另一種單抗，同時(shí)充分混勻反應(yīng)液，并適當(dāng)延長(zhǎng)反應(yīng)溫育時(shí)間，則可使b,c和d復(fù)合物減少至最低程度，大大減輕鉤狀效應(yīng)。

測(cè)定標(biāo)本中HBeAg時(shí)

多克隆抗－HBe包被反應(yīng)板

加入代測(cè)標(biāo)本，同時(shí)加入單克隆抗－HBe－HRP

形成抗－HBe－HBeAg－抗－HBe－HRP復(fù)合物

加入TMB低物顯色反應(yīng)

測(cè)OD值測(cè)定HBsAg時(shí)：?jiǎn)慰寺】梗璈Bs包被反應(yīng)板加入待測(cè)標(biāo)本，同時(shí)加入多克隆抗－HBs－HRP形成抗－HBs－HBsAg－抗HBs-HRP復(fù)合物加入TMB低物產(chǎn)生顯色反應(yīng)測(cè)OD值類(lèi)風(fēng)濕因子（RF）的干擾RF是一種自身抗體，多為IgM型，能和多種動(dòng)物IgG的Fc段結(jié)合。用作雙抗體夾心法檢測(cè)的血清標(biāo)本中如含有RF，它可充當(dāng)抗原成份，同時(shí)與固相抗體和酶標(biāo)抗體結(jié)合，表現(xiàn)出假陽(yáng)性反應(yīng)。2.改良雙抗體夾心法

特異性抗體a包被于固相載體洗滌加入含有欲測(cè)抗原之待檢樣品孵育洗滌再加一次未標(biāo)記的特異性抗體b孵育洗滌再加酶標(biāo)記抗b抗體，孵育洗滌加底物顯色進(jìn)行測(cè)定注：加入的抗體b于第一次包被于固相載體上的特異性抗體a對(duì)被測(cè)抗原來(lái)說(shuō)都是特異性的，但不是用同種動(dòng)物免疫制備的，否則可出現(xiàn)非特異性反應(yīng)。

這種方法與雙抗體夾心法不同之處是多加了一層抗體。因此，放大的倍數(shù)更高，故比雙抗體夾心法更加靈敏。同時(shí)避免標(biāo)記特異性抗體，而另一優(yōu)點(diǎn)是只要標(biāo)記一種抗抗體，即可達(dá)到多種應(yīng)用。3.競(jìng)爭(zhēng)抑制法測(cè)抗原

適用于小分子抗原或半抗原測(cè)定如地高辛、茶堿等藥物以及T3、T4及睪酮等激素，因其只有一個(gè)抗原決定簇，無(wú)法使用雙抗體夾心法測(cè)定，只能采用競(jìng)爭(zhēng)抑制法測(cè)定。原理：是標(biāo)本中的抗原和一定量的酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)與固相抗體結(jié)合。標(biāo)本中抗原量含量愈多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗原愈少，最后的顯色也愈淺。固相抗體EEE酶標(biāo)抗原待測(cè)抗原E底物E顯色反應(yīng)（弱）固相抗體EEE酶標(biāo)抗原底物顯色反應(yīng)（強(qiáng)）EEEEEE競(jìng)爭(zhēng)法ELISA測(cè)小分子抗原測(cè)定模式缺點(diǎn)：1.小分子酶結(jié)合物制備上不如抗體酶結(jié)合物簡(jiǎn)便2.純化困難，結(jié)合小分子的酶與游離酶之間難分離。雙抗體夾心競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法測(cè)定小分子抗原，測(cè)定的靈敏度和特異性均有所提高。雙抗體夾心競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法測(cè)定小分子抗原二或多聚體小分子待測(cè)抗原酶標(biāo)抗體EEEE溫育洗板溫育二、檢測(cè)抗體間接法測(cè)抗體

間接法是檢測(cè)抗體常用的方法。原理：利用酶標(biāo)記的抗抗體（抗人免疫球蛋白抗體）以檢測(cè)與固相抗原結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法。目前應(yīng)用最多的是抗HCV、抗HIV以及梅毒螺旋體抗體等檢測(cè)。酶標(biāo)抗體固相抗原待測(cè)抗體EE間接法測(cè)抗體影響因素1.嚴(yán)格講所測(cè)定的僅為抗體的IgG類(lèi)，不涉及IgM和IgA類(lèi)，這是有酶標(biāo)二抗體決定的。2.間接法成功的關(guān)鍵在于抗原的純度。一般為基因工程重組抗原，如HCV的NS3,NS4,NS5,HIV的GP41和GP120等。3另一種干擾因素為正常血清中所含的高濃度的非特異性IgG。病人血清中受檢的特異性IgG只占總IgG中的一小部分。IgG的吸附性很強(qiáng)，非特異IgG可直接吸附到固相載體上，有時(shí)也可吸附到包被抗原的表面。在檢測(cè)過(guò)程中標(biāo)本須先行稀釋?zhuān)员苊膺^(guò)高的陰性本底影響結(jié)果的判斷。

2.雙抗原夾心法測(cè)抗體

反應(yīng)模式與雙抗體夾心法類(lèi)似。原理：用特異性抗原進(jìn)行包被和制備酶結(jié)合物，以檢測(cè)相應(yīng)的抗體。與間接法測(cè)抗體的不同之處為以酶標(biāo)抗原代替酶標(biāo)抗抗體。此法中受檢標(biāo)本不需稀釋?zhuān)芍苯佑糜跍y(cè)定，因此其敏感度相對(duì)高于間接法。乙肝標(biāo)志物中抗HBs的檢測(cè)常采用本法。雙抗原夾心法測(cè)抗體也可采用“一步法”。由于機(jī)體產(chǎn)生抗體IgG的滴度有限，因而不會(huì)產(chǎn)生“鉤狀效應(yīng)”。固相抗原EE待測(cè)抗體酶標(biāo)抗原溫育洗板EE溫育EE測(cè)定HBsAb時(shí)采用純化的HBsAg包被反應(yīng)板加入待測(cè)標(biāo)本，同時(shí)加入HBsAg-HRP形成HBsAg-抗－HBs-HBsAg-HRP復(fù)合物加入TMB低物顯色測(cè)OD值3.競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗體

當(dāng)抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時(shí)，可用此法檢測(cè)特異性抗體。其原理為標(biāo)本中的抗體和一定量的酶標(biāo)抗體競(jìng)爭(zhēng)與固相抗原結(jié)合。標(biāo)本中抗體量越多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗體愈少，因此陽(yáng)性反應(yīng)呈色淺于陰性反應(yīng)。如抗原為高純度的，可直接包被固相。競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗－HBe采用多克隆抗－HBe、基因工程重組HBeAg包被反應(yīng)板，加入待測(cè)標(biāo)本，同時(shí)加入單克隆抗－HBe-HRP，與抗原形成競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，如待測(cè)標(biāo)本中抗抗－Hbe含量高，則抗－HBe-HRP與HbeAg結(jié)合少，加入TMB顯色時(shí)低物顯色淡，反之顯色深。加入底物顯色測(cè)OD值（1）雙抗體夾心法測(cè)抗原在臨床檢驗(yàn)中，如用抗hCG抗血清作為妊娠診斷試劑檢定尿液中hCG，只能用于hCG濃度較高的試驗(yàn)，否則婦女生理性排泄入尿液中的微量LH將與之發(fā)生交叉反應(yīng)。但不適用于測(cè)定半抗原及小分子單價(jià)抗原，因其不能形成兩位點(diǎn)夾心。雙抗體夾心競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法測(cè)定小分子抗原同時(shí)避免標(biāo)記特異性抗體，而另一優(yōu)點(diǎn)是只要標(biāo)記一種抗抗體，即可達(dá)到多種應(yīng)用。此法常用于病毒性感染的早期診斷。加入TMB低物顯色?蛋白質(zhì)是最主要、最常見(jiàn)的抗原；形成HBsAg-抗－HBs-HBsAg-HRP復(fù)合物洗滌時(shí)設(shè)法加大水流量或加大水壓，讓水流沖擊板孔表面，洗滌效果更佳。Ab＋Ag＋Ab*Ab·Ag·Ab*---a在定量測(cè)定中，加入底物后的反應(yīng)溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。0左右時(shí)，DAB在波長(zhǎng)450nm處有廣范圍的最大吸收。4.捕獲包被法測(cè)抗體

如抗原中會(huì)有干擾物質(zhì)，直接包被不易成功，可采用捕獲包被法，即先包被與固相抗原相應(yīng)的抗體，然后加入抗原，形成固相抗原。在臨床檢驗(yàn)中測(cè)定抗體IgM時(shí)多采用捕獲包被法。原理：先用抗人IgM抗體包被固相，以捕獲血清標(biāo)本中的IgM（其中包括針對(duì)抗原的特異性IgM抗體和非特異性的IgM）。然后加入抗原，此抗原僅與特異性IgM相結(jié)合。繼而加酶標(biāo)記針對(duì)抗原的特異性抗體。再與底物作用，呈色即與標(biāo)本中的IgM成正相關(guān)。此法常用于病毒性感染的早期診斷。急性甲型肝炎的診斷的血清抗-HAV的IgM檢測(cè)、急性乙型肝炎病毒感染的血清抗HBcIgM檢測(cè)和TORRCH系列的IgM檢測(cè)等。

抗人IgMμ鏈作為固相抗體加入待測(cè)標(biāo)本IgM類(lèi)抗體被固相捕獲再加入特異抗原，與固相上捕獲的IgM抗體結(jié)合加入酶標(biāo)抗特異抗原的抗體加入底物顯色測(cè)OD值戌型肝炎病毒（HEV）IgM抗體檢測(cè)

鼠抗人IgMμ鏈作為固相抗體

加入待測(cè)標(biāo)本IgM類(lèi)抗體固相捕獲加入HRP標(biāo)記的HEV抗原

形成包被二抗-IgM抗體-酶標(biāo)抗原復(fù)合物加入底物顯色測(cè)OD值甲型肝炎病毒（HAV）IgM抗體檢測(cè)鼠抗人IgMμ鏈作為固相抗體

加入待測(cè)標(biāo)本IgM類(lèi)抗體固相捕獲加入HRP標(biāo)記的HAV抗原

形成包被二抗-IgM抗體-酶標(biāo)抗原復(fù)合物加入底物顯色測(cè)OD值

也有用間接法ELISA測(cè)IgM抗體如用抗原包被的間接法直接測(cè)定IgM抗體，因標(biāo)本中一般同時(shí)存在較高濃度的IgG抗體，部分特異IgG抗體將與IgM抗體競(jìng)爭(zhēng)與固相的抗原結(jié)合，干擾IgM抗體的檢測(cè)。必須先將標(biāo)本A蛋白或抗IgG抗體處理，以除去IgG的干擾。類(lèi)風(fēng)濕因子（RF，IgM類(lèi)）及其他非特異性IgM的干擾1.RF由于能與固相的抗人μ鏈抗體結(jié)合，并可與隨后加入的酶標(biāo)抗體（動(dòng)物IgG)反應(yīng)，導(dǎo)致假陽(yáng)性反應(yīng)。

2.非特異性IgM在第一步溫育中，可與特異性IgM競(jìng)爭(zhēng)與固相抗體結(jié)合，所以影響測(cè)定的靈敏度。因此需對(duì)樣本進(jìn)行稀釋。影響測(cè)定結(jié)果的標(biāo)本因素標(biāo)本采集可用作ELISA測(cè)定的標(biāo)本十分廣泛，體液（如血清）、分泌物（唾液）和排泄物（如尿液、糞便）等均可作標(biāo)本以測(cè)定其中某種抗體或抗原成份。

醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中均以血清作為檢測(cè)標(biāo)本血清標(biāo)本可按常規(guī)方法采集，應(yīng)注意避免溶血，紅細(xì)胞溶解時(shí)會(huì)釋放出具有過(guò)氧化物酶活性的物質(zhì)，以HRP為標(biāo)記的ELISA測(cè)定中，溶血標(biāo)本可能會(huì)增加非特異性顯色。

如有細(xì)菌污染，菌體中可能含有內(nèi)源性HRP，也會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性反如在冰箱中保存過(guò)久，其中的可發(fā)生聚合，在間接法ELISA中可使本底加深。一般說(shuō)來(lái)，在5天內(nèi)測(cè)定的血清標(biāo)本可放置于4℃，超過(guò)一周測(cè)定的需低溫冰存。

凍結(jié)血清融解后，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，應(yīng)充分混勻，宜輕緩，避免氣泡，可上下顛倒混和，不要在混勻器上強(qiáng)烈振蕩?；鞚峄蛴谐恋淼难鍢?biāo)本應(yīng)先離心或過(guò)濾，澄清后再檢測(cè)反復(fù)凍融會(huì)使抗體效價(jià)跌落，所以測(cè)抗體的血清標(biāo)本如需保存作多次檢測(cè)，宜少量分裝冰存。保存血清自采集時(shí)就應(yīng)注意無(wú)菌操作2.試劑的準(zhǔn)備從冰箱中拿出即用，有可能影響后面溫育時(shí)間不夠，導(dǎo)致對(duì)一些若陽(yáng)性的標(biāo)本的檢測(cè)出現(xiàn)假陰性。洗板液稀釋時(shí)所用的蒸餾水或去離子水應(yīng)保證質(zhì)量。3.加樣

在ELISA中一般有3次加樣步聚，即加標(biāo)本，加酶結(jié)合物，加底物。加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。加