基因敲除小鼠技術(shù)

轉(zhuǎn)基因、基因敲入/敲除動物技術(shù)已經(jīng)成為現(xiàn)代生命科學(xué)基礎(chǔ)研究和藥物研發(fā)領(lǐng)域不可或缺的重要技術(shù)，該技術(shù)從上世紀七八十年代誕生以來，已有近四十年的歷史，經(jīng)典技術(shù)如DNA原核顯微注射、胚胎干細胞顯微注射技術(shù)一直以來經(jīng)久不衰，并逐漸從基礎(chǔ)研究實驗室轉(zhuǎn)向商業(yè)模式，成為一項高度標準化的新興產(chǎn)業(yè)

一、技術(shù)介紹與研究進展轉(zhuǎn)基因、基因敲入/敲除動物技術(shù)已經(jīng)成為現(xiàn)代生命科學(xué)基礎(chǔ)研究和藥物研發(fā)領(lǐng)域不可或缺的重要技術(shù)，該技術(shù)從上世紀七八十年代誕生以來，至今已有近四十年的歷史，經(jīng)典技術(shù)如DNA原核顯微注射、胚胎干細胞顯微注射技術(shù)一直以來經(jīng)久不衰，在小鼠模型構(gòu)建方面日趨完善，并且如同剪切酶和抗體等常規(guī)分子生物學(xué)試劑的制備技術(shù)一樣，逐漸從基礎(chǔ)研究實驗室轉(zhuǎn)向商業(yè)模式，成為一項高度標準化的新興產(chǎn)業(yè)，催生了數(shù)以百計的創(chuàng)新藥物和數(shù)以千計的優(yōu)秀文章。盡管如此，傳統(tǒng)技術(shù)仍然存在一些難以克服的缺陷，如步驟繁瑣、周期漫長、成功率低、費用高昂等，而ZFN和TALEN等新技術(shù)的出現(xiàn)，或有可能將這一局面徹底改變。二、同源重組技術(shù)原理基因敲除鼠技術(shù)是上世紀80年代中后期基于DNA同源重組的原理發(fā)展起來的，Capecchi和Smithies在1987年根據(jù)同源重組（homologousrecombination）的原理，首次實現(xiàn)了ES的外源基因的定點整合（targetedintegration），這一技術(shù)稱為"基因打靶"（genetargeting）或"基因敲除"（geneknockout），利用這種ES的顯微注射就可以制作出基因敲出小鼠（KOMice:knockoutmice）;由于這一工作，Capecchi和Smithies于2007年與Evans分享了諾貝爾醫(yī)學(xué)獎。同源重組（homologousrecombination）定義：是指發(fā)生在姐妹染色單體（sisterchromatin)之間或同一染色體上含有同源序列的DNA分子之間或分子之內(nèi)的重新組合。在基因敲除小鼠制作過程中，需要針對目的基因兩端特異性片段設(shè)計帶有相同片段的重組載體，將重組載體導(dǎo)入到胚胎干細胞后外源的重組載體與胚胎干細胞中相同的片段會發(fā)生同源重組，如圖1所示：圖1.基因敲除鼠制作同源重組原理示意圖三、制作流程圖2.基因敲除鼠制作過程示意圖1.Knockout載體設(shè)計與構(gòu)建根據(jù)研究項目具體情況和要求把目的基因和與細胞內(nèi)靶基因特異片段同源的DNA片段都重組到帶有標記基因(如neo基因，TK基因等)的載體上，成為重組的Knockout載體?；蚯萌胄∈笫峭ㄟ^基因打靶，把目的基因序列敲入到小鼠的相應(yīng)基因位點，使用小鼠的表達調(diào)控元件指導(dǎo)目的基因表達。此類基因敲入鼠一般用于藥物的篩選，信號通路的研究等。獲得嵌合體及之后品系純化詳細流程：五、基因敲除其他方法一、ZFN技術(shù)制作基因敲除鼠ZFN能夠識別并結(jié)合指定的基因序列位點，并高效精確地切斷。隨后細胞利用天然的DNA修復(fù)過程來實現(xiàn)DNA的插入、刪除和修改，這樣研究人員就能夠隨心所欲地進行基因組編輯。這在過去是無法想象的，傳統(tǒng)的基因敲除技術(shù)依賴細胞內(nèi)自然發(fā)生的同源重組，其效率只有百萬分之一，而ZFN的基因敲除效率能達到10%。利用這些技術(shù)進行小鼠基因的定點敲除和敲入，可以把時間從一年縮短到幾個月。這項技術(shù)中設(shè)計特異性的ZFN是最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，目前研究者采用計算生物學(xué)方法設(shè)計高特異性的ZFN，但ZFN的脫靶（offtarget），也就是把不該切的地方切了的問題仍是一個挑戰(zhàn)。也正因為這個原因，利用ZFN技術(shù)進行小鼠的基因修飾還無法完全取代傳統(tǒng)技術(shù)。二、TALEN技術(shù)制作基因敲除鼠TALEN技術(shù)是一種嶄新的分子生物學(xué)工具。科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，來自一種植物細菌的TAL蛋白的核酸結(jié)合域的氨基酸序列與其靶位點的核酸序列有恒定的對應(yīng)關(guān)系。利用TAL的序列模塊，可組裝成特異結(jié)合任意DNA序列的模塊化蛋白，從而達到靶向操作內(nèi)源性基因的目的，它克服了ZFN方法不能識別任意目標基因序列，以及識別序列經(jīng)常受上下游序列影響等問題，而具有ZFN相等或更好的靈活性，使基因操作變得更加簡單方便。然而同樣因為脫靶的問題，利用TALEN技術(shù)進行小鼠的基因修飾仍然無法取代傳統(tǒng)技術(shù)。

六、常見問題與解答1.什么是ES細胞顯微注射？答：胚胎干細胞顯微注射是制作基因敲除小鼠的一個最常用的方法。主要過程是將攜帶目的基因的胚胎干細胞注射到小鼠的囊胚腔中獲得嵌合體小鼠。所得嵌合體小鼠的組織，將同時含有來源于囊胚的細胞和胚胎干細胞。嵌合體小鼠必須和野生型小鼠配種以決定遺傳改變的生殖系能否傳遞，這樣可能獲得轉(zhuǎn)基因或打靶基因（來源于胚胎干細胞）穩(wěn)定的生殖系傳遞的小鼠。一般情況下，大約能獲得50%繼承了目的基因的后代。2.嵌合體遺傳學(xué)上用以指不同遺傳性狀嵌合或混雜表現(xiàn)的個體。免疫學(xué)上的涵義則指一個機體身上有兩種或兩種以上染色體組成不同的細胞系同時存在,彼此能夠耐受,不產(chǎn)生排斥反應(yīng),相互間處在嵌合狀態(tài)。在基因敲除鼠中指通過向囊胚注射被外源基因轉(zhuǎn)化了的胚胎干細胞，使得發(fā)育成為的個體中含有不同基因型的細胞，產(chǎn)生的個體也叫嵌合體，即該生物體中嵌合了兩種不同遺傳結(jié)構(gòu)的細胞（一種是基因型被改變了的細胞，另一種是原來的基因型的細胞）。3.條件性敲除的原理？答：Cre-LoxP系統(tǒng)是源于P1噬菌體的一個DNA重組體系,由Cre酶和相應(yīng)的LoxP位點組成,它能導(dǎo)致重組發(fā)生在特定的DNA序列處(LoxP位點),該系統(tǒng)可以將外源基因定點整合到染色體上或?qū)⑻囟―NA片段刪除?；贑re-LoxP的基因打靶要分兩步來進行。首先要在胚胎干細胞的基因組中引入LoxP序列，這一步可以通過打靶載體的設(shè)計和對同源重組子的篩選來實現(xiàn)。下一步通過Cre介導(dǎo)的重組來實現(xiàn)靶基因的遺傳修飾或改變。Cre-LoxP系統(tǒng)既可以在細胞水平上用Cre重組酶表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染中靶細胞，通過識別LoxP位點將抗性標記基因切除，又可以在個體水平上將重組雜合子小鼠與Cre轉(zhuǎn)基因小鼠雜交，篩選子代小鼠就可得到刪除外源標記基因的條件性敲除小鼠。4.如何鑒定和挑選嵌合體？答：動物只有部分組織細胞整合有外源基因，則稱為嵌合體動物。它的鑒定主要根據(jù)毛色去鑒定。注射的ES和囊胚來源不同的小鼠品系。它們的毛色不同。因此可以根據(jù)毛色的嵌合率來鑒定和挑選嵌合體。5.ROSA26與定點插入？答：利用同源重組技術(shù)，把外面的cDNA片段或者其他DNA片段，定點插入到ROSA26位置。ROSA26是一個安全區(qū)域，外源性的基因定點插入這個位點不會影響其他基因的表達。七、行業(yè)領(lǐng)先企業(yè)TaconicFarms,Inc.成立于1952年，是位于紐約哈得孫河谷地區(qū)的一家家族企業(yè)。自成立以來，公司一直是世界上最大的實驗室嚙齒動物供應(yīng)商之一，在持續(xù)生產(chǎn)高品質(zhì)、定義明確的大鼠和小鼠方面擁有良好的口碑。Taconic在轉(zhuǎn)基因小鼠的定制設(shè)計和生產(chǎn)、小鼠和大鼠育種、屏障系統(tǒng)、基因和動物健康方面的專業(yè)經(jīng)驗為利用活體模型開展藥物開發(fā)的研究人員提供支持。Taconic在美國和歐洲設(shè)有六個育種工廠和三個服務(wù)實驗室，員工人數(shù)超過1000名，致力于從事技術(shù)創(chuàng)新。賽業(yè)生物科技是目前國內(nèi)探生網(wǎng)提醒：最大的轉(zhuǎn)