畢赤酵母表達系統(tǒng)

畢赤酵母表達系統(tǒng)前言：所用表達質粒有pPIC3.5K,pAO815用于胞內表達，而pPIC9K用于分泌表達，所有載體均利用AOX1啟動子來誘導高水平表達。抗性選擇：最有效的篩選遺傳霉素抗性及高抗性克隆的程序需要先對HIS+轉化子進行選擇，再進行不同水平遺傳霉素抗性篩選。畢赤菌株表型：畢赤酵母菌GS115及KM71在組氨酸脫氫酶位點（His4）有突變，因而不能合成組氨酸，所有表達質粒都有HIS4基因可與宿主進行互補，通過不含組氨酸的培養(yǎng)基來選擇轉化子。GS115及KM71都可在復合培養(yǎng)基如YPD（YEPD）及含組氨酸的最小培養(yǎng)基中生長。轉化之前，GS115及KM71都不能在最小培養(yǎng)基中生長，因為它們是His-。培養(yǎng)溫度：畢赤酵母生長溫度為28-30度（液體、平板、斜面）。在32度以上誘導生長時，對蛋白表達有害，甚至會導致細胞死亡。貯存：貯存細胞幾周或幾月，用YPD培養(yǎng)基或YPD瓊脂斜面1挑取所需菌株單克隆在YPD平板上劃線生長；2挑取單克隆轉移至YPD進行穿刺培養(yǎng)，30度2天；3細胞在4度可放幾周幾月或幾年，存于一80度1挑取所需菌株單克隆在YPD中過夜培養(yǎng)；2收集細胞，在含15%甘油的YPD中懸浮至終OD600為50-100（大約2.5-5.0X109細胞/ml）；3細胞先用液氮或干冰/酒精浴中冰凍再貯存于-80度。注意：在4度或一80度長期保存后，用之前建議在MM、MD或MGY平板上劃線培養(yǎng)以檢測His+轉化子的表型是否正確及其活力。以質粒pPIC9K，酵母PichiapastorGS115為例說明做法。以質粒pPIC9K，載體pPIC9K酶切為點線性化質粒DNA：建議使用下列方法線性化載體以獲得Mut+及Muts重組子，可能其中一個會比另一個更利于表達多拷貝重組子。如果只想得到Muts重組子，使用KM71菌株。單個十字交換事件可比雙重十字交換更容易、更有效地獲得Muts重組菌（例如：插入AOX1或his4而不是取代AOX1）。如果插入片段含有下列任何限制性位點，見p29-30以替換位點。1如果克隆進Ppic3.5k，線性化時，插入AOX1用SacI（GS115,Mut+或KM71,Muts）;插入HIS4用SalI（GS115,Mut+或KM71,Muts）2如果克隆進pAO815，線性化時，插入HIS4用SalI或StuI（GS115,Mut+或KM71,Muts）注意如果用pAO815載體，插入2個或更多拷貝子會產生SacI酶切位點3如果克隆進Ppic9k，線性化時，插入AOX1用SacI（GS115,Mut+或KM71,Muts）,插入HIS4用SalI（GS115,Mut+或KM71,Muts）。畢赤酵母表達常用溶液及緩沖液的配制1各種母液的配制10*YNB（含有硫酸銨、無氨基酸的13.4%酵母基礎氮源培養(yǎng)基）4°C保存。34g酵母基礎氮源培養(yǎng)基（無硫酸銨）+100g硫酸銨，溶于1000ml水中，過濾除菌。500*B（0.02%生物素Biotin）4C保存。20mg的生物素溶于100ml水中，過濾除菌。100*H（0.4%Histidine組氨酸）4C保存。400mg的L-組氨酸溶于100m^中，（加熱至50C以促進溶解），過濾除菌。10*D（20%Dextrose葡萄糖）200g葡萄糖溶于1000ml水中，滅菌15min或過濾除菌。10*M(5%Methanol甲醇)保存期為2個月。將5ml的甲醇與95ml水混勻，過濾除菌。10*GY(10%Glycerol甘油)。將100m”油和900ml水混勻后，高壓滅菌或過濾除菌。100*AA(0.5%ofeachAminoAcid,各種氨基酸)4°C保存。分別將500mg的L-谷氨酸、L-蛋氨酸、L-賴氨酸、L-亮氨酸和L-異亮氨酸溶于100ml水中，過濾除菌。1M磷酸鉀溶液(potassiumphosphatebuffer,pH6.0)，將1mol/L的K2HPO4溶液132ml與1mol/L的KH2PO4溶液868ml混勻，其pH為6.0，如需調節(jié)pH，則使用磷酸和氫氧化鉀調節(jié)pH。1.2常用溶液及緩沖夜1.2.1堿裂解法抽提質BDNA所用溶液：溶液I：50mmol/Lglucose，100mmol/LEDTA，25mmol/LTris—HCI(pH8.0)溶液II：0.2mol/LNaOH，1%SDS(臨用時配制)溶液III：29.44gKAc，11.5mlAceticacid,加ddH2O至100ml。4C保存。10%甘油(Glycerol)：將100ml甘油和900ml水混勻后，高壓滅菌或過濾除菌。保存期為1年以上。Rnase-H2O：1ulRnase加入1ml滅菌ddH2O。4C保存。TE緩沖液：10mmol/Tris-CI(pH8.0)，lmmol/LEDTA(pH8.0)STE緩沖液：0.1mol/L,10mmol/LTris-HCl(pH8.0),1mmol/LEDTA(pH8.0)SCE緩沖液：1mol/LSorbitol(山梨醇),10mmol/L檸檬酸鈉，10mmol/LEDTA1Mpotassiumphosphatebuffer(pH6.0)：132ml1MK2HPO4,868ml1MKH2PO4.50XTAE瓊脂糖凝膠電泳緩沖液，pH8.0(1L)：242gTris,57.1mlAceticAcid,37.2gEDTA畢赤酵母表達的培養(yǎng)基配制[5]LB(Luria—Bertani)培養(yǎng)基：Tryptonl%,YeastExtract0.5%,NaCll%,PH7.0制作平板時加入2%瓊脂粉。121C高壓滅菌20min。可于室溫保存。用于培養(yǎng)pPICZaA原核宿主菌TOP10F'時可加入Zeocin25ug/ml。LLB(LowSaltLB)培養(yǎng)基：Tryptonl%,YeastExtract0.5%,NaCl0.5%,PH7.0制作平板時加入2%瓊脂粉。121C高壓滅菌20min?？捎谑覝乇４鏀?shù)月。用于培養(yǎng)pPICZaA原核宿主菌TOP10F'時，加入Zeocin25ug/ml，可以4C條件下保存1?2周。YPD(又稱YEPD)YeastExtractPeptoneDextroseMedium(YeastExtractPeptoneDextroseMedium，酵母浸出粉/胰蛋白胨/右旋葡萄糖培養(yǎng)基)：Trypton2%,dextrose(glucose)2%+agar2%,+Zeocin100gg/ml液體YPD培養(yǎng)基可常溫保存；瓊脂YPD平板在4C可保存幾個月。加入Zeocin100ug/ml，成為YPDZ培養(yǎng)基，可以4C條件下保存1?2周。YPDS+Zeocin培養(yǎng)基(YeastExtractPeptoneDextroseMedium):yeastextract1%,peptone2%,dextrose(glucose)2%,sorbitol1M+agar2%+Zeocin100gg/ml不管是液體YPDS培養(yǎng)基還是YPDS+Zeocin培養(yǎng)基，都必須存放4C條件下，有效期1?2周。MGY:MinimalGlycerolMedium(最小甘油培養(yǎng)基)(34%YNB；1%甘油；4*10-5%生物素)。將800ml滅菌水、100ml的10*YNB母液、2ml的500*B母液和100ml的10*GY母液混勻即可，4C保存，保存期為2個月。MGYH:MinimalGlycerolMedium+Histidine(最小甘油培養(yǎng)基+0.004%組氨酸)在1000ml的MGY培養(yǎng)基中加入10ml的100*H母液混勻，4C保存，保存期為2個月。RD:RegenerationDextroseMedium(葡萄糖再生培養(yǎng)基)(含有：1mol/L的山梨醇；2%葡萄糖；1.34%YNB；4*10-5%生物素；0.005%氨基酸)將186g的山梨醇定容至700ml，高壓滅菌；冷卻后于45C水浴；3,將100ml的10*D、100ml的10*YNB；2ml的500*B；10ml的100*AA等母液和88ml無菌水混勻，預熱至45^后，與步驟2的山梨醇溶液混合。4°C保存。RDH:RegenerationDextroseMedium+Histidine（葡萄糖再生培養(yǎng)基+0.004%組氨酸）在RD培養(yǎng)基配制的第三步中，在加入10ml的100*H母液，同時無菌水的體積減少至78ml即可，其余配制方法與RD相同。4C保存。RD及RDH平板的制備將186g的山梨醇和15-20g瓊脂粉定容至700ml，高壓滅菌；冷卻后于60C水??；參照RD/RDH液體培養(yǎng)基配制的步驟4,將100ml的10*D、100ml的10*YNB；2ml的500*B；10ml的100*人人等母液、（10ml的100*H母液）和88（78）ml無菌水混勻，預熱至45C后，與步驟1的山梨醇/瓊脂液混勻；迅速制備平板。4C可保存數(shù)月。RD及RDH的TOP瓊脂的制備（常用于酵母菌的包被）將186g的山梨醇和7.5?10g瓊脂粉定容至700ml，高壓滅菌；冷卻后于60C水??；參照RD/RDH液體培養(yǎng)基配制的步驟4，將100ml的10*D、100ml的10*YNB；2ml的500*B；10ml的100*人人等母液、（10ml的100*H母液）和88（78）ml無菌水混勻，預熱至45C后，與步驟1的山梨醇/瓊脂液混勻；將該TOP瓊脂置于45C水浴冷卻、保溫，備用。MD與MDH:MinimalDextroseMedium+（Histidine）最小葡萄糖培養(yǎng)基+（0.004%組氨酸）（含有：1.34%YNB；；4*10-5%生物素；2%葡萄糖）100ml的10*YNB；2ml的500*B和100ml10*D母液，用800ml的無菌水定容至1000ml即可；如配制MDH，可在上述的MD中加入10ml的100*H即可；如配制平板，可無菌水的滅菌前，加入15?20g的瓊脂。4C可保存數(shù)月。SOC培養(yǎng)基：Tryptonl%,YeastExtract0.5%,NaCl0.05%,Glucose（1mol/L）2%,121C高壓滅菌20min，冷卻后，4C保存主要試驗環(huán)節(jié)的操作3.1酵母菌株的分離純化：接種GS115于5mlYPDM體培養(yǎng)基，30C，200rpm振蕩過夜，涂布YPD平板，30C培養(yǎng)48小時，用YNB基本培養(yǎng)基和含His的補充培養(yǎng)基作點種分離純化，挑選在補充培養(yǎng)基上生長而在基本培養(yǎng)基上不生長的單菌落劃YPD平板，4C保存。pPICZaA原核宿主菌TOP10F’的活化培養(yǎng)TOP10F’做菌種保存在一70C條件下，在進行擴大培養(yǎng)抽提質粒之前，先要進行活化培養(yǎng)。接種TOP10F’于5mlLLB（加入25ug/mlZeocin）中，37C，200rpm，培養(yǎng)16?18h。3.3畢赤酵母表達的試驗方法3.3.1線狀質BDNA的脫磷酸化處理為了防止載體質BDNA的自身環(huán)化，用小牛腸堿性磷酸酶（CIP）處理酶切后的質BDNA，具體操作如下：⑴建立反應體系：線性化的質粒35ul,10xCIPbuffer4ul,CIP1ul,ddH2O5ul,total45ul.⑵在PCR儀上控制反應溫度（加石蠟油封閉）37C15min；50C15min；56C，30min（滅活）。⑶在56C未開始前停止，加AproteinseK，用于滅活CIP，加入試劑如下：反應物45ul,10x5%SDS7ul,10xEDTA（pH8.0）7ul,proteinseK5ul,ddH^O6ul,total70ul.⑷純化使用QIAquickspinkit，按照2.2.3.3步驟進行，20ul滅菌ddH2。洗脫純化產物。進行1%瓊脂糖凝膠電泳，120V，觀察純化結果，并大約估計DNA濃度。E.coliTOP10F’感受態(tài)細胞的制備及轉化⑴取10plTOP10F’菌液，接種于200mlLB液體培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)37C,200rpm，16?18h。取100ul菌液接種于200ml液體LB培養(yǎng)基中。37°C,200rpm,培養(yǎng)16?18h。⑶滅菌500ml離心管，4C,4000rpm,20min得菌體沉淀，棄上清，菌體用10%甘油重懸并洗滌。重復洗滌3次。⑷第三次離心后，棄絕大部分上清，留下約1ml液體用于重懸菌體。⑸從制得的感受態(tài)細胞中，取200ul于滅菌EP管中，加入連接反應產物5ul,混勻不要產生氣泡，在冰上放置5min。⑹將混勻后得200ul菌液移入電擊杯中。⑺使用電擊穿孔儀進行轉化，設置為電壓2500V，時間5ms。⑻電擊后，往電擊杯中加入800glSOC培養(yǎng)基，沖洗出菌體轉移至滅菌1.5mlEP管中。37C，150rpm，輕搖45?60min。⑼取全部均勻涂布于含Zeocin25gg/ml的L18場。。血平板上，待涂布液不在流動，37C培養(yǎng)12?16h。*注：設空載體做對照。3.4畢赤酵母的電轉化方法3.4.1菌體的準備：挑取酵母單菌落接種至含有5mlYPD培養(yǎng)基的50mlH角瓶中，30C250-300r/min培養(yǎng)過夜；取100-500|Jl的培養(yǎng)物接種至含有500ml新鮮培養(yǎng)基的2L三角搖瓶中，28?30C、250-300r/min培養(yǎng)過夜，至OD600達到1.3?1.5；將細胞培養(yǎng)物于4C，1500g離心5min，用500ml的冰預冷的無菌水將菌體沉淀重懸；按步驟3離心，用250ml的冰預冷的無菌水將菌體沉淀重懸；按步驟3離心，用20ml的冰預冷的1mol的山梨醇溶液將菌體沉淀重懸；按步驟3離心，用1ml的冰預冷的1mol的山梨醇溶液將菌體沉淀重懸，其終體積約為1.5ml；備注：可將其分裝為80pl一份的包裝冷凍起來，但會影響其轉化效率（2周之內）。3.4.2電擊轉化：將5~20pg的線性化DNA溶解在5?10叫丁￡溶液中，與80gl的上述步驟6所得的菌體混勻，轉至0.2cm冰預冷的電轉化杯中；將電轉化杯冰浴5min；根據電轉化儀提供的資料，參考其他文獻及多次摸索，確定合適的電壓、電流、電容等參數(shù)，按優(yōu)化的參數(shù)，進行電擊；電擊完畢后，加入1ml冰預冷的山梨醇溶液將菌體混勻，轉至1.5ml的EP管中；將菌體懸液涂布于MD或RDB平板上，每200?600|Jl涂布一塊平板；將平板置于30C培養(yǎng)，直至單個菌落出現(xiàn)。推薦：電壓1.5kV；電容25pF；電阻200Q。電擊時間為4?10msec。3.5Pichia酵母表達直接PCR鑒定重組子的方法3.5.1模板的處理：平板上的菌落長到肉眼可見時（約12小時）；將除了模板之外的其它PCR反應液的組分準備好，并分裝。引物最好使用Kit中已有的檢測專用的引物，或者一條使用載體上的引物，一條使用基因的特異性引物（這樣做可以鑒定非定向克隆的方向）；用半根滅菌的牙簽挑取菌落，在PCR管中涮以下，放入一個滅菌的1.5毫升離心管，對PCR管和1.5毫升離心管編號；PCR擴增，1%agarose電泳；對于PCR擴增顯現(xiàn)特異性條帶的克隆，把置于1.5毫升離心管中的半截牙簽扔到5毫升YPDZ培養(yǎng)基中，30度培養(yǎng)，8—12h后提質粒，酶切鑒定確認。注意：本試驗方法應用在需要挑取的克隆較多（也就是克隆效率低），使用PCR初篩可以使工作量大為降低。PCR反應體系：以TaKaRaTaqDNA聚合酶反應為例：PCR反應條件：初始變性：94°C4min；變性94°C30s，退火50-54°C,30s,延伸72°C30s,34cycles；72°C10min；保存4C。3.6畢赤酵母基因組提取方法⑴接種重組和空質粒轉化子于5mlYPDZ培養(yǎng)基，GS115菌于YPD培養(yǎng)基作對照,30C培養(yǎng)16?18h。⑵室溫下，1500甘離心5-10min收集菌體⑶100ulTE(pH7.0)重懸，加入300ulEDTA(pH8.0),0.07MTris—HCl,3ulg-巰基乙醇，1ulLyticase,37°C水浴30min。⑷10000g離心5?10min,取沉淀，加90ulTE重懸。⑸200ul飽和酚，200ul氯仿，混勻，離心30s，取上層水相。⑹加入兩倍體積無水乙醇以及1/10體積的NaAC,-20C放置30min；⑺10000g離心20min,棄上清；75%乙醇漂洗沉淀一次；⑻干燥后，加入15pl的TE或H2O溶解，-20C備用。3.7Mut+表型重組酵母的誘導表達實驗挑選一單菌落，置于裝有25mlMGY、BMG或BMGY培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，于28-30C250-300rpm培養(yǎng)至OD600=2-6(~16-18h)；室溫下1500?3000g離心5min，收集菌體，用MM、BMM或BMMY重懸菌體，使OD600=1.0左右(約100?200ml)；將步驟2所得的菌液置于1L的搖瓶中，用雙層紗布或粗棉布封口，放置于28-30C250-300rpm的搖床上繼續(xù)生長；每24h向培養(yǎng)基中添加100%甲醇至終濃度為0.5?1.0%；按時間點分別取菌液樣品，取樣量為1ml,置于1.5mlEP管中，最大轉速離心2~3min，分別收集上清和菌體，分析目的蛋白的表達量和菌液最佳收獲時間。時間點一般?。?、6、12、24、36、48、60、72、84和96h；對分泌表達，分離樣品的上清液；對胞內表達，分離樣品的菌體沉淀，帶檢測樣品用液氮或干冰速凍后，于-80C保存?zhèn)溆?；可以用SDS、Western-Blo及活性實驗檢測與鑒定重組蛋白的表達。3.7Muts表型重組酵母的誘導表達實驗挑選一單菌落，置于裝有25mlMGY、BMG或BMGY培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，于28-30°C/250-300rpm培養(yǎng)至OD600=2-6(~16-18h)；室溫下1500?3000g離心5min,收集菌體，用1/5到1/10原培養(yǎng)體積的MM、BMM或BMMY重懸菌體(約10?20ml)；將步驟2所得的菌液置于100ml的搖瓶中，用雙層紗布或粗棉布封口，放置于28-30C250300rpm的搖床上繼續(xù)生長；每24h向培養(yǎng)基中添加100%甲醇至終濃度為0.5?1.0%；按時間點分別取菌液樣品，取樣量為1ml,置于1.5mlEP管中，最大轉速離心2?3min，分別收集上清和菌體，分析目的蛋白的表達量和菌液最佳收獲時間。時間點一般?。?、24、48、72、96和120h；對分泌表達，分離樣品的上清液；對胞內表達，分離樣品的菌體沉淀，帶檢測樣品用液氮或干冰速凍后，于-80°C保存?zhèn)溆茫?,可以用SDS、Western-Blo汲活性實驗檢測與鑒定重組蛋白的表達。試驗的注意事項4.1信號肽識別位點的設計以質粒pPICZaA為例。在利用PCR反應在外源基因兩端引入酶切位點的試驗中。如果質粒pPICZaA雙酶切中丟失了KEX2蛋白酶的酶切位點Lys—Arg,應該在上游中，增加了編碼Lys、Arg的密碼子AAA、AGA。酵母細胞膜中中的KEX2蛋白酶是a-factor信號肽的切割酶，它能有效識別酶切位點Lys—Arg，通過對信號肽的切割使基因表達產物釋放至胞外。4.2PCR產物酶切保護堿基的設計利用PCR轉換酶切位點，通過P3、P4兩引物的擴增在rhEGF的兩端加上XhoI、XbaI的識別位點和5個保護堿基。根據限制性核酸內切酶的工作原理，內切酶首先需要結合到核苷酸序列上，并在上面進行滑行，直至識別到酶切位點，為了能使內切酶有效的結合到序列上以利于其的有效加工。在利用PCR進行酶切位點轉換的時候，通常應在5'端限制酶位點外再加3個保護堿基GC［16］，防止引物合成中因為合成效率和純化問題而導致的酶切位點的殘缺。核苷酸保護堿基之為了保證限制型內切酶的工作效率，在其識別位點的兩側應該保證一定的旁側序列，換言之，識別位點是限制型內切酶識別并特異性切割底物的必要而不充分的條件。鑒于NEB(NewEnglandBiolabs)公司在限制酶領域的總體研究水平和對保護堿基方面的獨到理解，在設計引物時可以參照NEB公司的產品目錄后面的附錄：CleavagetotheendofDNAfragments?行】17］，但是，一些不常用的酶或雖有推薦的保護堿基序列但酶切效率仍不高的酶還是很難設計保護堿基。本次實驗中，根據美國基因動力實驗室文獻的報道［18］；XbaI、NheI和SpeI位點5’端保護堿基須在5個左右才容易被酶切割，以及一些前人的經驗總結，我們在設計引物時在識別位點5’端，設計了5個保護堿基。以保證較高的酶切效率。4.3高保真DNA聚合酶的使用VentDNA聚合酶是從高溫嗜熱菌中分高出的高保真(HighFidelity)耐高溫DNA聚合酶，能糾正DNA擴增中產生的錯誤，而傳統(tǒng)的TaqDNA聚合酶，TthDNA聚合酶及其變體AmpliTaq，KlenTaq等都無3’至5’糾錯功能，因此在擴增時出現(xiàn)堿基錯配的機率為2.1x104。這對于大批量的PCR產物而言，并不是十分嚴重的問題，因為又同樣錯誤的DNA分子僅占全部合成的DNA分子群體的極少一部分。但是，如果KR擴增的DNA片段是用于分子克隆，那么這就是件值得重視的事情，因為此種分子含有一個或數(shù)個錯誤摻入的核苷酸，那么在該克隆中的所有克隆DNA都將帶有同樣的“突變”。將會導致嚴重的后果】19］。具有校正功能的DNA聚合酶還有Pfu，DeepVent,Pwo,UlTma等,Pfu是其中出錯率最低的，比TaqDNA聚合酶低10倍。在本論文中，為了減少hEGF在PCR過程的錯誤擴增，在人工合成hEGF的過程中使用了VentDNA聚合酶。隨著PCR技術的不斷發(fā)展成熟(擴增長度、保證性、產量和特異性等)，質粒構建過程的大多數(shù)細胞內的DNA復制將被PCR這一細胞外的DNA復制所代替，質粒構建效率將有質的飛躍。4.4密碼子的偏好性的原則：酵母菌對外源基因的表達也和外源基因密碼子的選用有關。了解表達系統(tǒng)宿主在密碼子使用上的偏愛性對從翻譯水平分析外源基因表達的規(guī)律有重要意義，也為改造外源基因或改造宿主細胞提供依據［20、21］。4.5線性化及采用電轉化的原因：在pPICZaA-EGF電轉整合入GS115的時候，因為需要比較高的轉染率，我們對其用限制性內切酶SacI進行線性化的處理。細菌內同源重組被認為是重組質粒構建過程的難點。因為未線性化的環(huán)狀質粒之間發(fā)生同源重組的幾率非常低，所以重組轉移載體必須用特定的限制性內切酶進行線性化處理。這種處理的目的：⑴防止隨機插入重組時質粒在功能區(qū)斷開，造成目的基因表達失活；⑵讓同源重組以指定的方式發(fā)生。4.5乙醇沉淀法的問題主要步驟如下：1）酶切體系（80ul）中2倍體積的無水乙醇加1/10體積的PH5.2NaAC,混勻2） -20°C20分鐘沉淀3） 13200rpm，20min，離心后棄上清4） 75%乙醇300ul輕輕洗，同上離心5min,棄上清5） 37度烘箱至無乙醇氣味（或是用搖床的出風口吹出的暖風吹）。6） 20ulddH2O重溶如果想提高轉化效率，可以稍微做一些改進：還是用酚抽一下，去除內切酶；75%乙醇應洗兩遍，盡可能去除鹽離子，防止電轉化杯被擊穿，同時可提高效率；在沉淀時，如用終濃度2.5M的醋酸鈉+2.5倍體積的無水乙醇，可沉淀幾乎所有的DNA，但需要用75%的乙醇認真的洗兩遍。4.6酶切的總結影響重組質粒構建效率的最關鍵步驟在于酶切，不管是否是定向克隆還是非定向克隆。酶切的關鍵在于切干凈，徹底的酶切反應是成功的一半，特別是載體的酶切，尤其是雙酶切。雙酶切一般是先反應低鹽buffer的、后反應高鹽buffer的，如果低鹽buffer的酶在高鹽buffer的酶的反應條件下有低活性（一般來講在NEB的手冊上都有標示），最好就先純化（酚氯仿抽提、乙醇沉淀）過，再進行第二次酶切反應。注意：有相同功能（如：切同一序列，并產生相同末端）的酶，不一定是相同的酶（結構、性質不同）。雙酶切失敗有很多原因，先要看你抽的質粒有沒有問題，你可以用2—3種確定單酶切的酶分別切質粒，如果都只有一條帶就沒問題；再看你的雙酶切的緩沖液是不是合適，如果你的雙酶切條件不對，就會有大小不同的片斷。有時后提供給你的緩沖液的理論值與實際有很大的差別。建議你回頭檢查一下你的質粒超螺旋是不是很好，酶切實在不行的話，就分開來切，順便檢查你的那一個酶，或者那一個酶切有問題。抽提質粒要注意溶液II處理時間不要超過5分鐘，太長會有部分質粒不能復性，而且酶切不動。酶切反應成功的前提是對質粒載體的大致定量，太多的載體用量對酶切效率有負面影響，而太少的質粒載體不能保證實驗的需要。4.7線性化及采用電轉化的原因：在重組質粒電轉整合入酵母的時候，因為需要比較高的轉染率，我們對其用限制性內切酶進行線性化的處理。細菌內同源重組被認為是重組質粒構建過程的難點。因為未線性化的環(huán)狀質粒之間發(fā)生同源重組的幾率非常低，所以重組轉移載體必須用特定的限制性內切酶進行線性化處理。這種處理的目的：⑴防止隨機插入重組時質粒在功能區(qū)斷開，造成目的基因表達失活；⑵讓同源重組以指定的方式發(fā)生。4.8構建分泌型表達載體的必要性外源基因表達產物分泌到酵母細胞外，是表達外源基因的一種理想方式。相當一部分有藥理學作用的蛋白質本身就是分泌蛋白質，在分泌過程中通過一系列細胞器，使蛋白質得以加工、修飾、折疊，形成與天然結構更為相似，具有高度生物活性的蛋白質.外源基因若以非分泌形式表達，不通過分泌途徑，必然會失去一些對蛋白質進一步加工和修飾的機會，從而影響產物的空間結構和生物活性［23］。畢赤酵母自身分泌內源性蛋白很少，誘導培養(yǎng)基皆由小分子物質組成，成分簡單，這為分泌至培養(yǎng)基中的外源基因表達產物純化提供了極大方便，使純化工藝變的簡單易行，有助于4.9如何減少PCR反應中的引物二聚體減少引物形成二聚體的可能性：退火溫度設置不對，導致引物與模板的結合率降低。引物設計不好，很容易形成二聚體。如果碰到這種情況，可以嘗試從以下幾個方面解決：1設計引物的時候首先要熟悉引物設計的一般的原理，參考一些資料，積累經驗。如果條件允許的話，可以用比較靠得住的引物設計軟件驗證我的引物，如果沒問題，則進行下一步。2改變退火溫度一般引物合成后廠家會提供其Tmft，可以根據這個溫度為基準來做溫度實驗。如果你設計的引物里頭有酶切位點和保護堿基，則此方法不行，可以用比較靠得住的引物設計軟件來計算你引物中與模板結合部分的Tm值，然后以此為基準做溫度實驗。也可以根據自己的實際操作經驗來解決問題。3最后建議換一下Taq酶，某些進口的Taq酶太嚴謹，導致引物二聚體的形成，這也是可能的。我們試驗中一直都是使用某國產的Taq酶，效果挺理想。表達經驗甲醇酵母表達系統(tǒng)有不少優(yōu)點，其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表達系統(tǒng)最為人熟知，并廣泛應用于外源蛋白的表達。雖然說酵母表達操作簡單表達量高，但是在實際操作中，并不是每個外源基因都能順利得到高表達的。不少人在操作中會遇到這樣那樣的問題，生物通編者特地收集了部分用戶在使用EasySelectPichiaExpressionSystem這個被譽為最簡單的畢赤酵母表達的經典試劑盒過程中的心得體會。其中XiangYang是來自美國喬治城大學(GeorgetownUniversity)Lombardi癌癥中心(1ombardiCancerCenter)，部分用戶來自國內甲基酵母部分優(yōu)點與真核表達系統(tǒng)比較與原核表達系統(tǒng)比較1.屬于真核表達系統(tǒng)，具有一定的蛋白質翻譯后加工，有利于真核蛋白的表達優(yōu)點-+2.AOX強效啟動子，外源基因產物表達量高，可以達到每升數(shù)克表達產物的水平++++3.酵母培養(yǎng)、轉化、高密度發(fā)酵等操作接近原核生物，遠較真核系統(tǒng)簡單，非常適合大規(guī)模工業(yè)化生產。+++=4.可以誘導表達，也可以分泌表達，便于產物純化。=+5.可以甲醇代替IPTG作為誘導物，部分甲醇酵母更可以甲醇等工業(yè)產物替代葡萄糖作為碳源，生產成本低++++巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)是一種能高效表達重組蛋白的酵母品種，一方面由于其是屬于真核生物，因此表達出來的蛋白可以進行糖基化修飾，另一方面畢赤酵母生長速度快，可以將表達的蛋白分泌到培養(yǎng)基中，方便蛋白純化。畢赤酵母表達載體pPICZ在多克隆位點(MCR)3端帶有his-tag和c-mycepitopes，這些tag有利于常規(guī)檢測和純化，而且在MCR5端引入了alphafactor(a-factor)用以增加表達，并且在表達后a-factor可以自動被切除。在進行克隆的時候，如果你選擇的是EcoRI，那么只需在目標蛋白中增加兩個氨基酸序列即可完成。另外pPICZ系列選用的是Zeocin抗生素作為篩選標記，而誘導表達的載體需要甲醇一一甲醇比一般用于大腸桿菌表達誘導使用的IPTG便宜。第一步一一構建載體pPICZ系列有許多克隆位點可供選擇，同時也有三種讀碼框以便不用的用戶需要。有關是選擇pPIC9K還是pPICZ系列？pPIC9K屬于穿梭質粒，也可以在原核表達，而pPICZ系列比較容易操作，大腸桿菌和畢赤酵母均用抗Zeocin篩選(PIC9K操作麻煩一點，大腸用amp抗性，而畢赤酵母先用His缺陷篩選陽性克隆，再利用G418篩選多拷貝)，而且對于大小合適(30—50KD)的蛋白在產量上是pPIC9K無法比擬的。leslie:要做畢赤酵母表達實驗，首先當然就要了解這個可愛的酵母了（橢圓形，肥嘟嘟的，十分可愛），她和大腸桿菌長得有較大區(qū)別（大腸桿菌是桿狀的），因此在培養(yǎng)的過程中要區(qū)別這兩種菌體，除了氣味，濃度，顏色以外，也可以取樣到顯微鏡中觀測。大家做畢赤表達的時候應該都遇過這種情況吧，表達過程中染菌（我們實驗室曾經污染過各種顏色形狀的細菌，那真是一段可怕的經歷），如果在不知情的情況下繼續(xù)做下去，那可以就是浪費大把的時間了?；臼煜ち水叧嘟湍?，了解了她生長的喜好（多糖偏酸環(huán)境），生長的周期等等情況后，當然更多的精力還是應該花在表達的目的蛋白上，我的表達蛋白有些恐怖，有100KD，本來當然應該放在大腸桿菌中表達，但是為了分泌表達（其實后來發(fā)現(xiàn)大腸桿菌）ET系列分泌表達系列也不錯）和糖基化修飾（主要是這個方面，因為我的蛋白是人源的，表達出來用于酵母雙雜，因此需要有完備的糖基化修飾）。這樣我的DNA片段由于較長，所以在做克隆的時候也要非常小心，需要注意的是：酶切位點不能出現(xiàn)在目的DNA片段中一一如果片段長無法避免，可以采用平末端連接；雖然a-factor可以自動切除，但是在設計表達的時候，如果在N端不能出現(xiàn)任何多余的aa（比如藥物蛋白表達），需要特別留意（說明書上有詳細說明：P13）；有三種不同的讀碼框（對于pPICZa系列來說就是對上a-factoj＞列），在設計克隆的時候要反復確定自己的讀碼框是否正確，這可是致命的問題；無論pPICZ還是pPICZa都有TGA（終止密碼子），但是pPICZ系列沒有ATG（起始密碼子），有人認為酵母啟動子與外源基因的ATG之間的距離越短對于表達的該基因越有利；如果不希望有c-myc和His-tag，可以在基因片段末尾加入終止密碼子；Pichia的密碼子與釀酒酵母的相似，有關基因表達偏好密碼子的問題有人認為沒有必要更換，有人認為一定要換，個人認為以產量為主要目的的可以考慮更換基因密碼子，而如果片段過長就比較麻煩，不過有許多真核保守蛋白其實是和酵母密碼子相似的；克隆菌株需要有recA，endA，試劑盒帶有的TOP10挺好用的（其它像是DH5a都行），但是要注意帶有篩選抗生素Zeocin的培養(yǎng)基要用低鹽培養(yǎng)基（NaCl減半），這主要是因為怕影響到抗生素作用（Zeocin平板要避光保存）；測序引物可以用a血。炊信號引物，也可以用5'AOX1引物；如果需要高量表達，可以考慮做克隆的時候串聯(lián)基因片段進行表達，另外也可以在轉化酵母的時候重復轉化。目的基因中最好不要含有pro-glu-ser-thr這樣的序列，因為這個序列是激活蛋白水解酶的作用底物，會影響表達，另外也不要含有x-phe-x-arg-gln和gln-arg-x-phe-x這樣的序列（x=任何氨基酸），因為這些序列容易受到容酶體的切割，而且目的蛋白末端最好是ala,asp,val,ser這樣的氨基酸。除此之外許多高A+T含量的基因通常會由于提前終止而不能有效轉錄，也需要多加注意。第二步就是將線性化的DNA轉化入Pichia酵母中。XiangYang：EasySelect試劑盒準備了三種菌株：X33,GS115和KM71H。我傾向于選擇X33，因為這個菌株轉化率和表達量相對而言較高，如果你有電轉儀（electroporator），可以嘗試一下。如果沒有的話，EasySelect也準備了化學轉化試劑EasyCompTransformation，但是由于轉化率的緣故，我建議使用電轉儀。leslie：在得到了正確的序列之后就可以準備轉化畢赤酵母了，試劑盒攜帶有的是X-33，GS115和KM71H這三種畢赤酵母（另外常用的還有SMD1168），每種酵母的特點有些不盡相同（Manual上寫的很清楚），其中X-33由于是野生型，因此耐受性比較好，如果擔心轉化率的話可以考慮這種酵母菌，WGS115與X33一樣都是屬于MUT+表現(xiàn)型，也就是說可以在含甲醇的培養(yǎng)基中快速生長，但是據說會對外源基因表達有影響，KM71是MUT-型酵母，在甲醇培養(yǎng)基中生長緩慢，但是也有利于翻譯后加工，比如形成二硫鍵，糖基化等等，另外SMD1168則是基因組中的Pep4基因發(fā)生突變，造成蛋白水解酶活性的喪失，可以保護表達產物免受降解，促進表達量的提高。一般來說，如果是胞內表達，應盡量用Mut一細胞，這樣得到的蛋白產物中醇氧化酶蛋白量較少而目的蛋白量相對較多（約占Pp總分泌蛋白量的30-90%，如人乙酰膽堿酯酶B變異鏈的含量占到90%，使下游純化更易進行。而對于分泌蛋白的表達，無論是甲醇利用慢（Mut-）還是甲醇利用快（Mut+）的細胞都可應用，如在人血清白蛋白（HSA）（為分泌型蛋白）的表達中就看不出兩種類型的細胞之間有什么明顯差別。所以一般手冊都會建議同時在這幾種菌株中進行轉化，這主要是因為不同的基因在不同的酵母菌中可能表達量截然不同，因此在最開始的時候建議多用幾種酵母菌實驗。另外有個保存問題，原始酵母菌一定要保存好，因為酵母在傳代多次后會影響其轉化率和表達量，所以一方面分多管分裝保存于-80°C，另一方面如果出現(xiàn)了轉化或者表達的問題，在其它方面都沒有出錯的前提下可以考慮重新取出新菌液（每次都要涂平板挑菌）。在準備酵母菌的同時也需要準備質粒，由于酵母菌轉化對轉化質粒的要求較高，量也較大（5-10ug），因此許多時候都會用PEG大提質粒，或者用大提試劑盒，總而言之要準備好足夠量的質粒，并且不要忘記也要同時準備空載體以做對照。在轉化前質粒需要進行線性化，這主要是為了增加重組率（EasySelect試劑盒表達量高的一個重要原因也就在于其原理是將目的片段整合到載體上，大大的增加了目的片段的表達）。線性化位點個人認為也會影響到表達量，對于基因片段不大的蛋白可以考慮用幾個線性化位點同時進行轉化篩選，但是如果片段大，就有可能供選擇的機會少，而且也有可能遇上沒有合適的線性化位點的情況，這個時候也不是說不能進行表達，但是準備的質粒就要增加10倍，另外也可以進行部分酶切（即先進行預實驗，掐定時間和酶量保證被切開的質粒有部分是在線性化位點切開而基因片段保存完好）。在線性化之后的質粒就可以酒精沉淀回收了一一中間步驟需要使酶失活，說明書建議是熱失活或者EDTA，個人認為前者比較好，主要是擔心EDTA對于轉化的影響，另外這三種酶失活的溫度都是65C/20min。沉淀回收之后是離心10分鐘，用80%的酒精洗滌后風干，這一步需要多加注意保證風干完全，因為有實驗證明殘留的酒精對于轉化的影響頗大。接下來就是酵母轉化了，這是令許多人頭疼的一步，也是影響實驗決定表達的關鍵步驟。轉化方法有不少，例如電轉，化學轉化，原生質體轉化，其方法的難易程度和轉化率高低呈反向遞減的，也就是說電轉最容易，轉化率較高（但要求有電轉儀），而原生質體最麻煩，而且效果不好（比較傳統(tǒng)），因此不建議使用，EasySelect說明書上這么建議，并且也詳細說明了電轉，化學轉化（EasyComp和LiCl）方法的過程，可以按部就班。需要注意的是：（電轉過程）最好每次都從平板上挑酵母菌，用培養(yǎng)過的酵母放置時間不要超過一個星期；擴大培養(yǎng)的濃度一定要控制好，個人認為不需要OD600達到1.3-1.5，1.0-1.3的就好，這個時候的酵母比較新鮮，轉化率比較高；整個感受態(tài)制作過程中一定要在冰上操作，離心最好也用冷凍離心機，這是影響轉化的關鍵一一為了進一步保證這一點，無菌水可以是冰水混合物，另外山梨醇和電轉杯都要預冷;電轉儀需要預熱，所以準備感受態(tài)的時候就可以把電轉儀打開了，電轉后山梨醇的加入要快，曾有人做實驗證明晚一秒就會降低轉化的數(shù)量級，雖然不一定可信，但是我個人也認為這個過程要快，電轉后可以看看時間，如果時間過短（比如〈4）就可能說明雜質較多，會影響轉化率；轉化后溫育是個增加同源重組，增加存活率的過程，需要注意不要感染了大腸桿菌，再加入培養(yǎng)基30°C搖一段時間，可以取部分涂板（不同濃度抗生素），或者也有人將菌短暫離心,棄去上清，剩余全部涂板以保證轉化率。（化學轉化）如果沒有電轉儀，LiCl轉化是一種可供選擇的方法，轉化率是102到103cfu/ug。主要過程為：取過夜活化培養(yǎng)的菌液按1：1000接種于15ml新鮮的YPD液體培養(yǎng)基，30C培養(yǎng)至OD600達到0.8-1.0；4C，4500rpm離心5分鐘，用8ml冰預冷的無菌水洗滌菌體，傾除洗滌液，用1mL，4C，4500rpm離心5分鐘，沉淀用50pl冰預冷的100mmol/LLiCl懸浮，最后定容至80-90ml。LiCl轉化取適量單鏈畦精DNA（2mg/mL）煮沸5min，立即置于冰上備用，取上述制備好的感受態(tài)細胞12000rpm，離心15s，吸棄LiCl溶液，按順序依次加入50%PEG 240ml1mmol/LLiCl36ml單鏈畦精DNA 25ml線性化質粒DNA10ml（約10mg）用吸頭反復吹打，使細胞沉淀與加入的溶液混勻，30C靜置溫育30min，42C熱擊20-25min，4500rpm離心10min，吸棄轉化液，細胞沉淀加1mlYPD培養(yǎng)基于30C200rpm培養(yǎng)2-4hr，取轉化混合液100ml涂布含100昭/mLZeocinTM的YPDS平板，30C培養(yǎng)2-3天。第三步一一挑克隆篩選XiangYang：在protocol中用了許多篇幅來指導這一步，包括如何去通過平板篩選，觀測生長速率來確定Mut表現(xiàn)型等。這個過程需要3到5天，而我一般只用用了4個小時進行PCR（AOX引物）篩選。leslie:完成轉化后就是克隆鑒定的過程了，包括高拷貝篩選，PCR鑒定和表型鑒定的過程，其中我做的比較多的^CR鑒定（因為比較快），具體過程protocol上說的很清楚，其實也很簡單，就是凍融破菌進行菌落PCR，但是其中許多具體細節(jié)問題也挺讓人頭痛的，第一就是破壁的問題，許多人用PCR方法進行鑒定都無法得到結果，甚至在表達出了以后還是無法得到這張鑒定圖片，主要原因之一就是無法正常釋放酵母基因組，一般通過培養(yǎng)菌然后進行沸水和-20C冷凍循環(huán)過程裂解細胞在目的蛋白片段比較合適的范圍以內是可以得到好的結果的，但是有時候片段過長，模壁就會阻礙擴增，所以我們實驗室會用蝸牛酶（很便宜的酶來的）來幫助溶菌，我看許多實驗室也會這么做，不過加入的時間不同而已，其次也有奢侈的用試劑盒的。第二就是是模板量，個人建議模板真的不要加太多了，按照說明書的上的5ul我覺得還是多了，而且建議總體積不用這么大，當然加入模板的量也與自己培養(yǎng)菌的濃度以及用來凍融的菌數(shù)量有關。其次是假陽性和假陰性結果，在Mut-和Mut+情況是不一樣的，如果用的是5'AOX引物，KM71H會出現(xiàn)3.6kb的片段，而Mut+則會出現(xiàn)AOX1基因原本長度的片段一一大約長2.2kb，因此如果的基因片段長度相似，要注意區(qū)分。建議PCR過程中使用多對引物進行反應，包括自己基因的，a血。炊的，5'AOX的,都可以，反正各種對照多了有利于比較一一當然前提是你不能暈了頭。掉了毛的鴕鳥：巴斯德畢赤酵母包含醇氧化酶-1（AOX1）基因的啟動子的轉錄終止子（5’AOX1和3’AOX1）,他們被多克隆位點分開，外源基因可在此插入，此外，載體中還包含組氨酸脫氫酶基因（HIS4）選擇標記（HIS4區(qū)的整合方式為位點特異性單交換引起的基因插入，整合后使組氨酸缺陷型宿主（his4）恢復野生型.HIS4區(qū)或AOX1區(qū)位點的整合都使轉化子具有HIS4基因，因而可利用表型差異進行篩選，酵母GS115具有組氨醇脫氫酶缺陷型基因his4，可接受含HIS4的載體而具有HIS+表型以篩選轉化子.）及3’AOX1區(qū),當整合型載體轉化受體菌感受態(tài)細胞時，他的5’AOX1和3’AOX1能與染色體上的同源基因重組，從而使整個載體和外源基因插入到受體菌染色體上，在加入甲醇作為唯一碳源的培養(yǎng)基中，外源基因在5’AOX1啟動子的控制下表達.在載體中引入Tn903KanrS因（抗G418）有助于篩選高拷貝轉化子，轉化子的拷貝數(shù)與抗G418的能力有關，通過篩選抗G418能力強的酵母即可獲得高拷貝轉化子.外源基因是以同源重組的方式插入到酵母菌的染色體中,因此不易丟失，多次傳代后酵母仍能穩(wěn)定表達外源蛋白，具有良好的遺傳穩(wěn)定性.第四步——表達XiangYang：將你的克隆在YPD培養(yǎng)基中培育到OD600值達到6.0，就可以離心收菌。用表達培養(yǎng)基（比如BMMY）重懸沉淀，在30°C培育過夜。leslie:篩選鑒定出自己的重組子可以說什么都不能證明，還是要看這一步的酵母表達，有許多人在酵母表達上花費了大量的時間一一不同于大腸桿菌的兩天出結果，一次畢赤酵母的表達就需要起碼一周的時間，篩選了上百上千的克隆，但是仍然是竹籃打水一場空，我個人建議如果在篩選完3批以上就可以放棄這一批轉化的酵母菌，另外調整進行重新轉化。另外剛開始的時候可以用小量表達，可以用5ml:生長慢型，生長快型，陰性對照（空質粒），陽性對照（可以是曾經表達成功的重組子）和沒有進行轉化的酵母菌的單克隆，BMGY中培養(yǎng)到OD值2-6,離心收菌（如果怕污染或者麻煩，可以放置酵母菌一段時間，一半為20-30分鐘，讓菌沉淀下來，小心傾倒去上清培養(yǎng)基獲得菌），轉入BMMY中誘導表達，這些