14色譜分析法(下)

分析化學基礎化學教研室王雷清薄層色譜法-基本原理薄層色譜法

薄層色譜法（TLC）：是將固定相均勻地鋪在光潔的玻璃板、金屬板或塑料板的表面上形成薄板，然后在薄板上進行分離的方法。薄層色譜法和紙色譜法與前面討論的柱色譜法不同，它們均在平面上進行分離，因此，又被稱為平面色譜法。薄層色譜示意圖薄層色譜法薄層色譜法的主要特點：

1．快速

2．靈敏

3．高選擇性

4．簡便

5．顯色方便

6．應用廣泛薄層色譜示意圖薄層色譜法一、基本原理（一）分離原理：

鋪好薄層的玻璃板簡稱為薄板。如將含有A、B兩組分的試樣溶液點在薄板的一端，然后在密封的容器中（色譜槽或色譜缸）用適當?shù)恼归_劑（流動相）展開。由于吸附劑對A、B兩組分有著不同的吸附能力，當展開劑攜帶樣品通過吸附劑時，A、B兩組分就在吸附劑和展開劑之間不斷發(fā)生吸附、解吸附（溶解）、再吸附、再解吸附。薄層色譜示意圖薄層色譜法一、基本原理（一）分離原理：

易被吸附的組分移動得慢一些，而難被吸附組分相對來說移動得快一些。經(jīng)過一段時間后，A、B兩組分的距離逐漸拉開，形成互相分離的兩個斑點。薄層色譜示意圖薄層色譜法（二）比移值與相對比移值1．比移值（Rf）樣品展開后各組分斑點在薄板上的位置可用比移值

Rf來表示。

Rf=原點到斑點中心的距離原點到溶劑前沿的距離

Rf值是薄層色譜法的基本定性參數(shù)。當色譜條件一定時，組分的Rf值是一常數(shù)，其值在0～1之間，可用范圍是0.2～0.8。物質不同，結構和極性各不相同，其Rf值不同。因此，利用Rf值可以對物質進行定性鑒別。溶劑

前沿起始線ABabc溶劑

前沿起始線ABabcAB

Rf值相差越大，分離越好。一般要求分離后組分的Rf值在0.2～0.8之間，各組分的Rf值之差應大于0.05，以防斑點重疊。薄層色譜法薄層色譜法2．相對比移值（Rs）

相對比移值是指試樣中某組分的移動距離與參考物（對照品）移動距離之比，其關系式可以寫成：

Rs=原點到樣品組分斑點中心的距離原點到對照品斑點中心的距離Rs值一般情況下等于1，但也可能<1或>1

影響Rf的主要因素1.展開劑的pH：弱酸和弱堿的離解受pH影響，離解度越大，極性越強，越易分配在極性強的一相；2.溫度：溫度變化會引起分配系數(shù)變化，也可能改變展開劑的組成；

3.展開距離：在相同的條件下，展開距離大，Rf值大；

4.層析缸的飽和程度：未飽和時，Rf值可能增大；

5.共存物質。

薄層色譜法分析化學基礎化學教研室王雷清薄層色譜法-吸附劑和展開劑的選擇薄層色譜法二、吸附劑的選擇

薄層色譜法對所用的吸附劑的要求和柱色譜法所用的吸附劑基本相似，吸附薄層色譜法常用的吸附劑也是硅膠、氧化鋁、硅藻土、聚酰胺、纖維素等，但是薄層色譜法所用的吸附劑要求顆粒更細些。吸附劑的選擇要合適，與流動相、被分離化合物不反應。固定相（吸附劑）的選擇在吸附薄層色譜中，固定相的選擇十分重要。其選擇應從兩個方面考慮：a.被分離物質的性質（如極性、酸堿性、溶解度等）b.吸附劑吸附能力的強弱。若被分離物質極性強，應選擇吸附能力弱的吸附劑；若被分離物質極性弱，應選擇吸附能力強的吸附劑。薄層色譜法薄層色譜法三、展開劑的選擇在吸附薄層色譜中，選擇展開劑的一般原則和吸附柱色譜中選擇流動相的原則相似。即極性大的組分需用極性大的展開劑，極性小的組分需用極性小的展開劑。薄層色譜法中常用的溶劑，按極性由弱到強的順序是：石油醚<環(huán)己烷<二硫化碳<四氯化碳<三氯乙烷<苯<甲苯<二氯甲烷<氯仿<乙醚<乙酸乙酯<丙酮<乙醇<甲醇<吡啶<水。薄層色譜法流動相（展開劑）薄層色譜法中采用單一溶劑或多元混合溶劑作流動相，稱為展開劑。與吸附柱色譜法中選擇流動相的一般規(guī)則相同，展開劑的選用要從被分離試樣組分極性、吸附劑活性和展開劑的極性三個因素綜合考慮。被分離試樣組分極性、吸附劑活性和展開劑極性之間的關系活潑吸附劑（固定相）展開劑（流動相）極性不活潑被分離物質BB’ACC’非極性非極性極性A’ⅤⅠ薄層色譜法吸附劑和展開劑的選擇對于極性較小的被分離試樣組分，應選用活性較強的吸附劑，極性較小的展開劑；對于極性較大的被分離試樣組分，應選用活性較弱的吸附劑，極性較大的展開劑。展開劑成分的選擇：對于容易分離的化合物，用單一溶劑展開優(yōu)點：溶劑簡單，分離重現(xiàn)性好。對于難分離組分，則選用二元、三元、甚至多元溶劑Rf太小——加入強極性展開劑Rf過大——降低展開劑的極性薄層色譜法流動相（展開劑）的選擇

展開劑選擇是否適當是薄層分離的重要條件之一。在吸附薄層色譜中，選擇展開劑主要是由被分離物質的極性、吸附劑的活性以及展開劑本身的極性來決定.在薄層色譜中，一般先選擇單一溶劑作展開劑，但對難分離組分，則需要使用二元、三元甚至多元的溶劑。先用一種極性較小的溶劑為基礎溶劑展開混合物，若展開不好，用極性較大的溶劑與前一溶劑混合，調整極性，再次試驗，直到選出合適的展開劑組合為止。

薄層色譜法優(yōu)化1.占比例較大的溶劑為主要溶劑，可使試樣組分溶解并基本分離。占比例較小的溶劑可進一步調整各組分Rf值，改善分離效果。2.分離酸性或堿性組分時，往往在展開劑中加入少量酸或堿，以防這些組分離解，使這些組分的斑點更加集中和清晰，從而提高分離度。3.當展開劑的粘度太大時，可在展開劑中加入粘度小的溶劑，以降低展開劑粘度，從而提高展開速度。薄層色譜法邊緣效應：展開時薄板邊緣的Rf值高于中部的Rf值的現(xiàn)象。它主要是由于色譜槽中的不飽和狀態(tài)和展開劑在薄板不同部位分配不同而引起的。影響展開的因素有:相對濕度;溶劑蒸汽（a展開室的飽和b預吸附）;溫度；展距。展開劑要接觸到吸附劑下沿，但切勿接觸到樣點。薄層板呈傾斜狀。蓋上蓋子，容器密閉。防止邊緣效應。注意事項分析化學基礎化學教研室王雷清薄層色譜法-操作方法薄層色譜法操作方法:

薄層色譜法的一般操作程序可分為制板、點樣、展開、斑點定位、定性定量分析五個步驟。薄層色譜法操作方法操作方法1.制板2.點樣3.展開4.顯色5.定性和定量分析薄層色譜法薄層色譜法（一）制板常用的薄板類型有：軟板（硅膠H板、氧化鋁板）、硬板（硅膠G板、氧化鋁G板、硅膠CMC-Na板、氧化鋁CMC-Na板)、F板(F254板、F365板)。F板為在吸附劑中加有波長為254nm或365nm的熒光物質。薄層色譜法

1.將一定粒度的吸附劑（固定相，例如硅膠、活性氧化鋁、纖維素等）均勻地涂鋪在表面光潔的玻璃板或塑料平板上，制成薄層板。

薄層色譜法吸附劑就其性質而言，可分為有機吸附劑（如聚酰胺、纖維素和葡聚糖等）和無機吸附劑（如氧化鋁、硅膠、硅藻土、磷酸鈣、磷酸鎂和硅酸鈣鎂等）。最常用的是氧化鋁和硅膠，它們的吸附性能好，適用于多種化合物的分離。常用的吸附劑厚度為0.5～2.5mm，色譜板的尺寸一般為20cm×20cm或20cm×40cm。薄層厚度與薄層板的尺寸限制了PTLC可以分離的樣品量。1.0mm厚的硅膠板最多可上樣5mg／cm2。硅膠是最常用的吸附劑，可用它來分離親脂或親水性物質。薄層色譜法

TLC板可以自己制備，也有預制板出售。自制TLC板的優(yōu)點在于吸附劑的厚度及組成可調節(jié)(最厚可達5mm)，也可以在吸附劑中摻入硝酸銀及緩沖物質。硅膠黏和劑混合平鋪涂鋪器自然干燥一夜105～115℃活化煅石膏或羧甲基纖維素鈉水溶液薄層色譜法注意事項調制時慢慢攪拌，勿使產生氣泡。均勻涂布在玻璃板上，搖動攤平，晾干。使用前放入烘箱內，在105-115℃左右烘干40-50min。冷卻后使用。薄層色譜法（二）點樣

1．樣品溶液的制備溶解樣品的溶劑，盡量避免用水為溶劑。

2．點樣量點樣量的多少與薄層的性能及顯色劑的靈敏度有關。

3．點樣方法薄層色譜法2.把待分析試樣的溶液滴加在薄層板的起始線上（點樣），晾干

薄層板試樣原點

點樣是進行TLC分離的一個最關鍵的步驟。上樣之前薄層板最好先用溶劑展開一次，以減少所需化合物從吸附劑洗脫下來時可能混入的雜質。樣品溶解：上樣前先將樣品溶于少量溶劑，難揮發(fā)性溶劑可引起點樣帶變寬，因此最好選用揮發(fā)性溶劑(如己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、丙酮、氯仿等)，最好用與展開劑極性相似的溶劑，應盡量使點樣后溶劑能迅速揮發(fā)，以減少色斑的擴散。水溶性樣品，可先用少量水使其溶解，再用甲醇或乙醇稀釋定容。薄層色譜法

點樣示意圖反應混合液樣原料樣1-2cm1cm≤點間距≤1.5cm點樣直徑≤2mm薄層色譜法薄層色譜法點樣注意事項a.樣品的濃度應在5％～10％左右。點樣帶應盡可能狹窄，以獲得更好的分離效果。溶解樣品的溶劑要盡量避免用水，因為水溶液斑點容易擴散，且不易揮發(fā)。b.適當?shù)狞c樣量，可使斑點集中，點樣量過大，易拖尾或擴散；點樣量過少，不易檢出。點樣量多少，應視薄層的性能及顯色劑的靈敏度而定，此外還應考慮薄層的厚度。一般是幾微克到幾十微克。c.盡量用小的點樣管，如果有足夠的耐性，最好只用1微升的點樣管。這樣，點的斑點較小，展開的色譜圖分離度好，顏色分明。薄層色譜法（三）展開展開的過程就是混合物分離的過程，它必須在密閉的展開槽（多數(shù)是長方型展開槽）或直立型的單槽色譜缸或雙槽色譜缸中進行。展開方式：近水平展開、上行展開、多次展開、雙向展開等。3.把點有試液的薄層板浸入到作為展開劑的流動相中（不要把試樣點浸入），流動相裝在加蓋的層析缸中，并具有一定飽和的流動相蒸氣壓。

展開示意圖薄層色譜法薄層色譜法展開：

將點好樣的薄板與流動相接觸，使兩相相對運動并帶動樣品組分遷移的過程稱為展開。

一般硬板常用上行法展開。將點樣后的薄板直立于已盛有展開劑的直立形層析槽的凸出處，不接觸底部的展開劑，加蓋飽和，再迅速將薄板置于槽底使之浸入展開劑中展開，直至展開劑上升一段距離（一般約15cm），取出薄板，用鉛筆畫出溶劑前沿位置。薄層色譜法把薄層板放入層析缸中，底端浸入適當溶劑。

薄層色譜法注意事項：（1）色譜槽或色譜缸必須密閉良好：為使色譜槽內展開劑蒸氣飽和并維持不變，應檢查玻璃槽口與蓋的邊緣磨砂處是否嚴實。（2）注意防止邊緣效應：邊緣效應是指同一組分的斑點在同一薄板上出現(xiàn)的兩邊緣部分的Rf值大于中間部分的Rf值的現(xiàn)象。因此，在展開之前，通常將點好樣的薄板置于盛有展開劑的色譜缸內飽和約一刻鐘（此時薄板不得浸入展開劑中）。薄層色譜法（四）斑點定位對于有色物質斑點的定位可在日光下直接觀察測定。而對于無色物質斑點，則必需采用某些輔助方法使其顯色。

方法如下：熒光檢出法化學檢出法碘蒸氣法、水斑點顯示方法、放射顯影法等

顯色與定位展開過程中，組分在兩相之間發(fā)生多次吸附—解吸平衡，吸附牢的組分隨展開劑移動慢，吸附弱的組分隨展開劑移動快，一段時后，組分被分離，各組分在薄層板上形成不同距離的斑點。前沿原點AB薄層色譜法薄層色譜法顯色與定位常見的顯色方法：物理顯色法：①熒光樣品，不少有機物在紫外燈照射下會出現(xiàn)不同的熒光，許多金屬離子與8-羥基喹啉的化合物在紫外線下也會呈現(xiàn)不同色調的熒光；②熒光背景，含熒光劑的薄層板在紫外線照射激發(fā)下背景顯熒光，無熒光性樣品斑點呈暗色。

生化顯色法：一些生化物質對某些微生物的生長具有顯著的促進或抑制作用。

薄層色譜法化學顯色法：

①噴射顯色，采用適宜的顯色劑與樣品組分發(fā)生化學反應生成有色物質；②蒸氣顯色，當薄層板展開后放入氨氣、溴蒸氣、碘蒸氣中直接顯色；③硫酸顯色，用96﹪的硫酸噴射薄板并直接在火焰上或于100℃加熱，有機組分被碳化呈現(xiàn)黑色斑點。

絕大多數(shù)的PTLC吸附劑中含有熒光指示劑，它可幫助確定被分開的、具有紫外吸收化合物的色帶位置。對于沒有紫外吸收的化合物，可采用下列幾種方法定位：薄層色譜法向板上噴灑水(如用于皂苷類化合物)；在板上覆蓋一塊玻璃板，并在板的邊緣噴灑顯色劑；加入一種參照物。5.樣品的收集

在確定色帶位置后，可用刮刀或一與真空收集器相連的管形刮離器將該色帶吸附劑從板上刮下。后一種方法并不適用于敏感的物質，因吸附劑持續(xù)與氣流接觸，所含的純化合物有被氧化的危險。薄層色譜法(五)定性分析

要使測定的條件與文獻規(guī)定的條件完全一致比較困難。通常的方法是用對照法，即在同一塊薄層板上分別點上樣品和對照品進行展開、定位。如果樣品的Rf值與對照品的Rf值相同，即Rs值=1，則可認為該組分與對照品為同一物質。有時為了進一步可靠起見，還應采用多種不同的展開系統(tǒng)進行展開。如果所得到的Rf值與對照品均一致，才可基本認定是同一物質。

薄層色譜法影響Rf值的主要外部因素：

1．吸附劑的性質吸附劑的種類和活度對物質的Rf值有較大影響。

2．展開劑的性質展開劑的極性直接影響物質的移動距離和速度，故對Rf值影響很大。

3．展開時的溫度一般講，溫度對吸附色譜的Rf值影響不大，但對分配色譜則直接影響分離效果。

薄層色譜法（六）定量分析

薄層色譜法的定量分析采用儀器直接測定較為方便、準確。但也有其它一些簡易的定量或半定量的方法。

1．目視比較法

2．斑點洗脫法

3．薄層掃描法分析化學基礎化學教研室王雷清紙色譜法紙色譜法一、色譜原理紙色譜法(PC)是以濾紙作為載體的色譜法。分離原理屬于分配色譜的范疇。固定相一般為紙纖維上吸附的水，流動相為與水不相混溶的有機溶劑。紙色譜和薄層色譜都屬于平面色譜，其操