14色譜分析法(下)

分析化學(xué)基礎(chǔ)化學(xué)教研室王雷清薄層色譜法-基本原理薄層色譜法

薄層色譜法（TLC）：是將固定相均勻地鋪在光潔的玻璃板、金屬板或塑料板的表面上形成薄板，然后在薄板上進(jìn)行分離的方法。薄層色譜法和紙色譜法與前面討論的柱色譜法不同，它們均在平面上進(jìn)行分離，因此，又被稱為平面色譜法。薄層色譜示意圖薄層色譜法薄層色譜法的主要特點(diǎn)：

1．快速

2．靈敏

3．高選擇性

4．簡(jiǎn)便

5．顯色方便

6．應(yīng)用廣泛薄層色譜示意圖薄層色譜法一、基本原理（一）分離原理：

鋪好薄層的玻璃板簡(jiǎn)稱為薄板。如將含有A、B兩組分的試樣溶液點(diǎn)在薄板的一端，然后在密封的容器中（色譜槽或色譜缸）用適當(dāng)?shù)恼归_(kāi)劑（流動(dòng)相）展開(kāi)。由于吸附劑對(duì)A、B兩組分有著不同的吸附能力，當(dāng)展開(kāi)劑攜帶樣品通過(guò)吸附劑時(shí)，A、B兩組分就在吸附劑和展開(kāi)劑之間不斷發(fā)生吸附、解吸附（溶解）、再吸附、再解吸附。薄層色譜示意圖薄層色譜法一、基本原理（一）分離原理：

易被吸附的組分移動(dòng)得慢一些，而難被吸附組分相對(duì)來(lái)說(shuō)移動(dòng)得快一些。經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后，A、B兩組分的距離逐漸拉開(kāi)，形成互相分離的兩個(gè)斑點(diǎn)。薄層色譜示意圖薄層色譜法（二）比移值與相對(duì)比移值1．比移值（Rf）樣品展開(kāi)后各組分斑點(diǎn)在薄板上的位置可用比移值

Rf來(lái)表示。

Rf=原點(diǎn)到斑點(diǎn)中心的距離原點(diǎn)到溶劑前沿的距離

Rf值是薄層色譜法的基本定性參數(shù)。當(dāng)色譜條件一定時(shí)，組分的Rf值是一常數(shù)，其值在0～1之間，可用范圍是0.2～0.8。物質(zhì)不同，結(jié)構(gòu)和極性各不相同，其Rf值不同。因此，利用Rf值可以對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性鑒別。溶劑

前沿起始線ABabc溶劑

前沿起始線ABabcAB

Rf值相差越大，分離越好。一般要求分離后組分的Rf值在0.2～0.8之間，各組分的Rf值之差應(yīng)大于0.05，以防斑點(diǎn)重疊。薄層色譜法薄層色譜法2．相對(duì)比移值（Rs）

相對(duì)比移值是指試樣中某組分的移動(dòng)距離與參考物（對(duì)照品）移動(dòng)距離之比，其關(guān)系式可以寫(xiě)成：

Rs=原點(diǎn)到樣品組分斑點(diǎn)中心的距離原點(diǎn)到對(duì)照品斑點(diǎn)中心的距離Rs值一般情況下等于1，但也可能<1或>1

影響Rf的主要因素1.展開(kāi)劑的pH：弱酸和弱堿的離解受pH影響，離解度越大，極性越強(qiáng)，越易分配在極性強(qiáng)的一相；2.溫度：溫度變化會(huì)引起分配系數(shù)變化，也可能改變展開(kāi)劑的組成；

3.展開(kāi)距離：在相同的條件下，展開(kāi)距離大，Rf值大；

4.層析缸的飽和程度：未飽和時(shí)，Rf值可能增大；

5.共存物質(zhì)。

薄層色譜法分析化學(xué)基礎(chǔ)化學(xué)教研室王雷清薄層色譜法-吸附劑和展開(kāi)劑的選擇薄層色譜法二、吸附劑的選擇

薄層色譜法對(duì)所用的吸附劑的要求和柱色譜法所用的吸附劑基本相似，吸附薄層色譜法常用的吸附劑也是硅膠、氧化鋁、硅藻土、聚酰胺、纖維素等，但是薄層色譜法所用的吸附劑要求顆粒更細(xì)些。吸附劑的選擇要合適，與流動(dòng)相、被分離化合物不反應(yīng)。固定相（吸附劑）的選擇在吸附薄層色譜中，固定相的選擇十分重要。其選擇應(yīng)從兩個(gè)方面考慮：a.被分離物質(zhì)的性質(zhì)（如極性、酸堿性、溶解度等）b.吸附劑吸附能力的強(qiáng)弱。若被分離物質(zhì)極性強(qiáng)，應(yīng)選擇吸附能力弱的吸附劑；若被分離物質(zhì)極性弱，應(yīng)選擇吸附能力強(qiáng)的吸附劑。薄層色譜法薄層色譜法三、展開(kāi)劑的選擇在吸附薄層色譜中，選擇展開(kāi)劑的一般原則和吸附柱色譜中選擇流動(dòng)相的原則相似。即極性大的組分需用極性大的展開(kāi)劑，極性小的組分需用極性小的展開(kāi)劑。薄層色譜法中常用的溶劑，按極性由弱到強(qiáng)的順序是：石油醚<環(huán)己烷<二硫化碳<四氯化碳<三氯乙烷<苯<甲苯<二氯甲烷<氯仿<乙醚<乙酸乙酯<丙酮<乙醇<甲醇<吡啶<水。薄層色譜法流動(dòng)相（展開(kāi)劑）薄層色譜法中采用單一溶劑或多元混合溶劑作流動(dòng)相，稱為展開(kāi)劑。與吸附柱色譜法中選擇流動(dòng)相的一般規(guī)則相同，展開(kāi)劑的選用要從被分離試樣組分極性、吸附劑活性和展開(kāi)劑的極性三個(gè)因素綜合考慮。被分離試樣組分極性、吸附劑活性和展開(kāi)劑極性之間的關(guān)系活潑吸附劑（固定相）展開(kāi)劑（流動(dòng)相）極性不活潑被分離物質(zhì)BB’ACC’非極性非極性極性A’ⅤⅠ薄層色譜法吸附劑和展開(kāi)劑的選擇對(duì)于極性較小的被分離試樣組分，應(yīng)選用活性較強(qiáng)的吸附劑，極性較小的展開(kāi)劑；對(duì)于極性較大的被分離試樣組分，應(yīng)選用活性較弱的吸附劑，極性較大的展開(kāi)劑。展開(kāi)劑成分的選擇：對(duì)于容易分離的化合物，用單一溶劑展開(kāi)優(yōu)點(diǎn)：溶劑簡(jiǎn)單，分離重現(xiàn)性好。對(duì)于難分離組分，則選用二元、三元、甚至多元溶劑Rf太小——加入強(qiáng)極性展開(kāi)劑Rf過(guò)大——降低展開(kāi)劑的極性薄層色譜法流動(dòng)相（展開(kāi)劑）的選擇

展開(kāi)劑選擇是否適當(dāng)是薄層分離的重要條件之一。在吸附薄層色譜中，選擇展開(kāi)劑主要是由被分離物質(zhì)的極性、吸附劑的活性以及展開(kāi)劑本身的極性來(lái)決定.在薄層色譜中，一般先選擇單一溶劑作展開(kāi)劑，但對(duì)難分離組分，則需要使用二元、三元甚至多元的溶劑。先用一種極性較小的溶劑為基礎(chǔ)溶劑展開(kāi)混合物，若展開(kāi)不好，用極性較大的溶劑與前一溶劑混合，調(diào)整極性，再次試驗(yàn)，直到選出合適的展開(kāi)劑組合為止。

薄層色譜法優(yōu)化1.占比例較大的溶劑為主要溶劑，可使試樣組分溶解并基本分離。占比例較小的溶劑可進(jìn)一步調(diào)整各組分Rf值，改善分離效果。2.分離酸性或堿性組分時(shí)，往往在展開(kāi)劑中加入少量酸或堿，以防這些組分離解，使這些組分的斑點(diǎn)更加集中和清晰，從而提高分離度。3.當(dāng)展開(kāi)劑的粘度太大時(shí)，可在展開(kāi)劑中加入粘度小的溶劑，以降低展開(kāi)劑粘度，從而提高展開(kāi)速度。薄層色譜法邊緣效應(yīng)：展開(kāi)時(shí)薄板邊緣的Rf值高于中部的Rf值的現(xiàn)象。它主要是由于色譜槽中的不飽和狀態(tài)和展開(kāi)劑在薄板不同部位分配不同而引起的。影響展開(kāi)的因素有:相對(duì)濕度;溶劑蒸汽（a展開(kāi)室的飽和b預(yù)吸附）;溫度；展距。展開(kāi)劑要接觸到吸附劑下沿，但切勿接觸到樣點(diǎn)。薄層板呈傾斜狀。蓋上蓋子，容器密閉。防止邊緣效應(yīng)。注意事項(xiàng)分析化學(xué)基礎(chǔ)化學(xué)教研室王雷清薄層色譜法-操作方法薄層色譜法操作方法:

薄層色譜法的一般操作程序可分為制板、點(diǎn)樣、展開(kāi)、斑點(diǎn)定位、定性定量分析五個(gè)步驟。薄層色譜法操作方法操作方法1.制板2.點(diǎn)樣3.展開(kāi)4.顯色5.定性和定量分析薄層色譜法薄層色譜法（一）制板常用的薄板類型有：軟板（硅膠H板、氧化鋁板）、硬板（硅膠G板、氧化鋁G板、硅膠CMC-Na板、氧化鋁CMC-Na板)、F板(F254板、F365板)。F板為在吸附劑中加有波長(zhǎng)為254nm或365nm的熒光物質(zhì)。薄層色譜法

1.將一定粒度的吸附劑（固定相，例如硅膠、活性氧化鋁、纖維素等）均勻地涂鋪在表面光潔的玻璃板或塑料平板上，制成薄層板。

薄層色譜法吸附劑就其性質(zhì)而言，可分為有機(jī)吸附劑（如聚酰胺、纖維素和葡聚糖等）和無(wú)機(jī)吸附劑（如氧化鋁、硅膠、硅藻土、磷酸鈣、磷酸鎂和硅酸鈣鎂等）。最常用的是氧化鋁和硅膠，它們的吸附性能好，適用于多種化合物的分離。常用的吸附劑厚度為0.5～2.5mm，色譜板的尺寸一般為20cm×20cm或20cm×40cm。薄層厚度與薄層板的尺寸限制了PTLC可以分離的樣品量。1.0mm厚的硅膠板最多可上樣5mg／cm2。硅膠是最常用的吸附劑，可用它來(lái)分離親脂或親水性物質(zhì)。薄層色譜法

TLC板可以自己制備，也有預(yù)制板出售。自制TLC板的優(yōu)點(diǎn)在于吸附劑的厚度及組成可調(diào)節(jié)(最厚可達(dá)5mm)，也可以在吸附劑中摻入硝酸銀及緩沖物質(zhì)。硅膠黏和劑混合平鋪涂鋪器自然干燥一夜105～115℃活化煅石膏或羧甲基纖維素鈉水溶液薄層色譜法注意事項(xiàng)調(diào)制時(shí)慢慢攪拌，勿使產(chǎn)生氣泡。均勻涂布在玻璃板上，搖動(dòng)攤平，晾干。使用前放入烘箱內(nèi)，在105-115℃左右烘干40-50min。冷卻后使用。薄層色譜法（二）點(diǎn)樣

1．樣品溶液的制備溶解樣品的溶劑，盡量避免用水為溶劑。

2．點(diǎn)樣量點(diǎn)樣量的多少與薄層的性能及顯色劑的靈敏度有關(guān)。

3．點(diǎn)樣方法薄層色譜法2.把待分析試樣的溶液滴加在薄層板的起始線上（點(diǎn)樣），晾干

薄層板試樣原點(diǎn)

點(diǎn)樣是進(jìn)行TLC分離的一個(gè)最關(guān)鍵的步驟。上樣之前薄層板最好先用溶劑展開(kāi)一次，以減少所需化合物從吸附劑洗脫下來(lái)時(shí)可能混入的雜質(zhì)。樣品溶解：上樣前先將樣品溶于少量溶劑，難揮發(fā)性溶劑可引起點(diǎn)樣帶變寬，因此最好選用揮發(fā)性溶劑(如己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、丙酮、氯仿等)，最好用與展開(kāi)劑極性相似的溶劑，應(yīng)盡量使點(diǎn)樣后溶劑能迅速揮發(fā)，以減少色斑的擴(kuò)散。水溶性樣品，可先用少量水使其溶解，再用甲醇或乙醇稀釋定容。薄層色譜法

點(diǎn)樣示意圖反應(yīng)混合液樣原料樣1-2cm1cm≤點(diǎn)間距≤1.5cm點(diǎn)樣直徑≤2mm薄層色譜法薄層色譜法點(diǎn)樣注意事項(xiàng)a.樣品的濃度應(yīng)在5％～10％左右。點(diǎn)樣帶應(yīng)盡可能狹窄，以獲得更好的分離效果。溶解樣品的溶劑要盡量避免用水，因?yàn)樗芤喊唿c(diǎn)容易擴(kuò)散，且不易揮發(fā)。b.適當(dāng)?shù)狞c(diǎn)樣量，可使斑點(diǎn)集中，點(diǎn)樣量過(guò)大，易拖尾或擴(kuò)散；點(diǎn)樣量過(guò)少，不易檢出。點(diǎn)樣量多少，應(yīng)視薄層的性能及顯色劑的靈敏度而定，此外還應(yīng)考慮薄層的厚度。一般是幾微克到幾十微克。c.盡量用小的點(diǎn)樣管，如果有足夠的耐性，最好只用1微升的點(diǎn)樣管。這樣，點(diǎn)的斑點(diǎn)較小，展開(kāi)的色譜圖分離度好，顏色分明。薄層色譜法（三）展開(kāi)展開(kāi)的過(guò)程就是混合物分離的過(guò)程，它必須在密閉的展開(kāi)槽（多數(shù)是長(zhǎng)方型展開(kāi)槽）或直立型的單槽色譜缸或雙槽色譜缸中進(jìn)行。展開(kāi)方式：近水平展開(kāi)、上行展開(kāi)、多次展開(kāi)、雙向展開(kāi)等。3.把點(diǎn)有試液的薄層板浸入到作為展開(kāi)劑的流動(dòng)相中（不要把試樣點(diǎn)浸入），流動(dòng)相裝在加蓋的層析缸中，并具有一定飽和的流動(dòng)相蒸氣壓。

展開(kāi)示意圖薄層色譜法薄層色譜法展開(kāi)：

將點(diǎn)好樣的薄板與流動(dòng)相接觸，使兩相相對(duì)運(yùn)動(dòng)并帶動(dòng)樣品組分遷移的過(guò)程稱為展開(kāi)。

一般硬板常用上行法展開(kāi)。將點(diǎn)樣后的薄板直立于已盛有展開(kāi)劑的直立形層析槽的凸出處，不接觸底部的展開(kāi)劑，加蓋飽和，再迅速將薄板置于槽底使之浸入展開(kāi)劑中展開(kāi)，直至展開(kāi)劑上升一段距離（一般約15cm），取出薄板，用鉛筆畫(huà)出溶劑前沿位置。薄層色譜法把薄層板放入層析缸中，底端浸入適當(dāng)溶劑。

薄層色譜法注意事項(xiàng)：（1）色譜槽或色譜缸必須密閉良好：為使色譜槽內(nèi)展開(kāi)劑蒸氣飽和并維持不變，應(yīng)檢查玻璃槽口與蓋的邊緣磨砂處是否嚴(yán)實(shí)。（2）注意防止邊緣效應(yīng)：邊緣效應(yīng)是指同一組分的斑點(diǎn)在同一薄板上出現(xiàn)的兩邊緣部分的Rf值大于中間部分的Rf值的現(xiàn)象。因此，在展開(kāi)之前，通常將點(diǎn)好樣的薄板置于盛有展開(kāi)劑的色譜缸內(nèi)飽和約一刻鐘（此時(shí)薄板不得浸入展開(kāi)劑中）。薄層色譜法（四）斑點(diǎn)定位對(duì)于有色物質(zhì)斑點(diǎn)的定位可在日光下直接觀察測(cè)定。而對(duì)于無(wú)色物質(zhì)斑點(diǎn)，則必需采用某些輔助方法使其顯色。

方法如下：熒光檢出法化學(xué)檢出法碘蒸氣法、水斑點(diǎn)顯示方法、放射顯影法等

顯色與定位展開(kāi)過(guò)程中，組分在兩相之間發(fā)生多次吸附—解吸平衡，吸附牢的組分隨展開(kāi)劑移動(dòng)慢，吸附弱的組分隨展開(kāi)劑移動(dòng)快，一段時(shí)后，組分被分離，各組分在薄層板上形成不同距離的斑點(diǎn)。前沿原點(diǎn)AB薄層色譜法薄層色譜法顯色與定位常見(jiàn)的顯色方法：物理顯色法：①熒光樣品，不少有機(jī)物在紫外燈照射下會(huì)出現(xiàn)不同的熒光，許多金屬離子與8-羥基喹啉的化合物在紫外線下也會(huì)呈現(xiàn)不同色調(diào)的熒光；②熒光背景，含熒光劑的薄層板在紫外線照射激發(fā)下背景顯熒光，無(wú)熒光性樣品斑點(diǎn)呈暗色。

生化顯色法：一些生化物質(zhì)對(duì)某些微生物的生長(zhǎng)具有顯著的促進(jìn)或抑制作用。

薄層色譜法化學(xué)顯色法：

①噴射顯色，采用適宜的顯色劑與樣品組分發(fā)生化學(xué)反應(yīng)生成有色物質(zhì)；②蒸氣顯色，當(dāng)薄層板展開(kāi)后放入氨氣、溴蒸氣、碘蒸氣中直接顯色；③硫酸顯色，用96﹪的硫酸噴射薄板并直接在火焰上或于100℃加熱，有機(jī)組分被碳化呈現(xiàn)黑色斑點(diǎn)。

絕大多數(shù)的PTLC吸附劑中含有熒光指示劑，它可幫助確定被分開(kāi)的、具有紫外吸收化合物的色帶位置。對(duì)于沒(méi)有紫外吸收的化合物，可采用下列幾種方法定位：薄層色譜法向板上噴灑水(如用于皂苷類化合物)；在板上覆蓋一塊玻璃板，并在板的邊緣噴灑顯色劑；加入一種參照物。5.樣品的收集

在確定色帶位置后，可用刮刀或一與真空收集器相連的管形刮離器將該色帶吸附劑從板上刮下。后一種方法并不適用于敏感的物質(zhì)，因吸附劑持續(xù)與氣流接觸，所含的純化合物有被氧化的危險(xiǎn)。薄層色譜法(五)定性分析

要使測(cè)定的條件與文獻(xiàn)規(guī)定的條件完全一致比較困難。通常的方法是用對(duì)照法，即在同一塊薄層板上分別點(diǎn)上樣品和對(duì)照品進(jìn)行展開(kāi)、定位。如果樣品的Rf值與對(duì)照品的Rf值相同，即Rs值=1，則可認(rèn)為該組分與對(duì)照品為同一物質(zhì)。有時(shí)為了進(jìn)一步可靠起見(jiàn)，還應(yīng)采用多種不同的展開(kāi)系統(tǒng)進(jìn)行展開(kāi)。如果所得到的Rf值與對(duì)照品均一致，才可基本認(rèn)定是同一物質(zhì)。

薄層色譜法影響Rf值的主要外部因素：

1．吸附劑的性質(zhì)吸附劑的種類和活度對(duì)物質(zhì)的Rf值有較大影響。

2．展開(kāi)劑的性質(zhì)展開(kāi)劑的極性直接影響物質(zhì)的移動(dòng)距離和速度，故對(duì)Rf值影響很大。

3．展開(kāi)時(shí)的溫度一般講，溫度對(duì)吸附色譜的Rf值影響不大，但對(duì)分配色譜則直接影響分離效果。

薄層色譜法（六）定量分析

薄層色譜法的定量分析采用儀器直接測(cè)定較為方便、準(zhǔn)確。但也有其它一些簡(jiǎn)易的定量或半定量的方法。

1．目視比較法

2．斑點(diǎn)洗脫法

3．薄層掃描法分析化學(xué)基礎(chǔ)化學(xué)教研室王雷清紙色譜法紙色譜法一、色譜原理紙色譜法(PC)是以濾紙作為載體的色譜法。分離原理屬于分配色譜的范疇。固定相一般為紙纖維上吸附的水，流動(dòng)相為與水不相混溶的有機(jī)溶劑。紙色譜和薄層色譜都屬于平面色譜，其操