基因?qū)嶒?yàn)診斷培訓(xùn)班 臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)標(biāo)本的采集、運(yùn)送、保存及核酸提取

臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)標(biāo)本的采集、運(yùn)送、保存及核酸提取天津市第一中心醫(yī)院檢驗(yàn)科

穆紅天津市第一中心醫(yī)院P

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.標(biāo)本的采集，運(yùn)送及保存是實(shí)驗(yàn)開始的第一步，也是實(shí)驗(yàn)?zāi)芊癯晒Φ年P(guān)鍵之一。因此有必要對(duì)標(biāo)本的采集，運(yùn)送及保存進(jìn)行規(guī)定，并積極與臨床相關(guān)科室進(jìn)行溝通交流以確保此項(xiàng)規(guī)定的準(zhǔn)確無(wú)誤的實(shí)施。天津市第一中心醫(yī)院P

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.標(biāo)本采集?標(biāo)本采集時(shí)間對(duì)擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果的影響?標(biāo)本采集部位的準(zhǔn)備；標(biāo)本的類型和采集量?采樣及運(yùn)送容器?標(biāo)本采集中的防污染天津市第一中心醫(yī)院P

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.?采樣質(zhì)量的評(píng)價(jià)——標(biāo)本的拒收范圍ü

經(jīng)查對(duì)標(biāo)本的病人姓名、年齡、性別、檢測(cè)號(hào)及項(xiàng)目不符者ü

采集的標(biāo)本將嚴(yán)重影響檢測(cè)結(jié)果血量不足，未正確使用抗凝劑ü

嚴(yán)重溶血，脂血，黃疸病人應(yīng)盡可能要求病人重取如不行應(yīng)在化驗(yàn)單標(biāo)本性狀欄中如實(shí)填寫：溶血，脂血，黃疸以明示病人及醫(yī)生ü

來(lái)歷不明標(biāo)本天津市第一中心醫(yī)院P

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.常見標(biāo)本的處理和保存?

血清（漿）標(biāo)本用于DNA檢測(cè)的標(biāo)本（如HB

V）按一般血清標(biāo)本處理對(duì)結(jié)果影響不大，但對(duì)于RNA檢測(cè)的標(biāo)本（如HC

V）應(yīng)盡快（2小時(shí)內(nèi)）分離血清（漿）短期（15天內(nèi)）可于-

20℃保存，長(zhǎng)期保存-

70℃以下?

全血標(biāo)本EDTA、枸櫞酸鹽抗凝；DNA檢測(cè)，4℃短期保存；R

NA檢測(cè)，盡快提取?

外周血單個(gè)核細(xì)胞淋巴細(xì)胞分離液；紅細(xì)胞裂解液得到單個(gè)核細(xì)胞；保存于-

70

℃以下天津市第一中心醫(yī)院P

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.?痰標(biāo)本常用于結(jié)核桿菌的檢測(cè)的痰標(biāo)本，由于痰標(biāo)本中含有大量粘蛋白和雜質(zhì)，故在核酸提取前，需對(duì)標(biāo)本進(jìn)行初步處理，即用1mol

/

LNa

OH液化。需注意的是，液化時(shí)不能加熱，液化時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)。液化標(biāo)本如不立即用于核酸提取，可保存于-

70℃以下。此外，如用于非結(jié)核桿菌如肺炎支原體的P

CR檢測(cè)，痰標(biāo)本只能室溫懸浮于生理鹽水中，充分振蕩混勻，促使大塊粘狀物下沉，取上清離心，所得到的沉淀物即可用于核酸提取。天津市第一中心醫(yī)院P

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.?其他標(biāo)本ü

棉拭子：將棉拭子置于適量生理鹽水中，充分震蕩洗滌后，室溫靜置5-

10分鐘，待大塊物下沉后，取上清立即離心，其后的沉淀即可用于DNA的提取。如不立即用于核酸提取，則需要保存-

70℃以下ü

膿液：

粘稠的膿液可采用痰標(biāo)本的處理模式，水樣的膿液則直接離心，沉淀即可用于DNA提取。沉淀標(biāo)本-

70℃保存ü

體液：臨床體液標(biāo)本包括胸水，腹水，腦脊液，尿液等，可按水樣標(biāo)本的方式離心取沉淀后，提取核酸ü

組織：石蠟切片用于核酸提取，需先用辛烷或二甲苯脫蠟，再用蛋白酶K消化后即可進(jìn)行DNA提取天津市第一中心醫(yī)院P

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.標(biāo)本中P

CR抑制物的影響?

來(lái)源üü內(nèi)源性：免疫球蛋白；蛋白酶；離子；多糖等外源性：肝素抗凝劑；手套滑石粉；采樣器材上的抑制劑?

作用機(jī)制üüü干擾核酸提取過(guò)程中的細(xì)胞裂解降解或包裹核酸熱穩(wěn)定的DNA聚合酶的失活天津市第一中心醫(yī)院P

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.核酸提取?目的üüü純化樣本中的核酸，除去雜質(zhì)使待擴(kuò)增的靶序列暴露及核酸模板得到濃縮有利于評(píng)價(jià)擴(kuò)增體系的靈感度?方法üüüü生化方法免疫學(xué)方法物理方法生理學(xué)方法天津市第一中心醫(yī)院P

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.DNA提取的經(jīng)典方法臨床標(biāo)本經(jīng)前處理后↓加入蛋白酶K緩沖液↓56℃溫育1h↓加入等體積飽和酚，充分振蕩混勻↓12000r/min，離心5min↓取水相，加入等體積氯仿↓混勻，

12000r/min，離心2min↓取水相，加入1/10體積的3mol/LNaAc和2倍體積的無(wú)水乙醇↓-20℃30min或過(guò)夜↓12000r/min，離心10min↓棄上清，用預(yù)冷75%乙醇洗3次↓干燥↓取20ul

TE或無(wú)菌去離子水懸浮↓4℃?zhèn)溆锰旖蚴械谝恢行尼t(yī)院P

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.R

NA的提取u器皿處理及溶液的準(zhǔn)備1%焦碳酸二乙酯(

DEP

C)

是RNas

e的強(qiáng)烈抑制劑；

DEP

C有致癌性u(píng)RNas

e污染的控制手是RNas

e污染最主要的潛在來(lái)源uR

NA提取方法???表面活性劑加蛋白酶K，氯仿-

酚抽提法胍鹽提取結(jié)合氯仿-

酚抽提法胍鹽提取結(jié)合玻璃粉、二氧化硅等顆粒懸浮吸附法天津市第一中心醫(yī)院P

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.異硫氰酸胍結(jié)合氯仿-

酚抽提R

NA法200ul血清（漿）↓加入500ul裂解液混勻↓加入50ulNaAc、500ul飽和酚：氯仿：異戊醇↓混勻，冰浴10min4℃12000r/min，離心5min↓取上層水相再用氯仿-異戊醇抽提1次↓加入1/10體積NaAc溶液、2.5體積無(wú)水乙醇↓冰浴30-60min4℃14000r/min，離心10min↓棄上清沉淀用75%乙醇洗1次↓烘干或真空干燥用10ul

DEPC處理水溶解，加入2U

RNasin↓-20℃保存?zhèn)溆锰旖蚴械谝恢行尼t(yī)院P

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.微量全血核酸提取方法抗凝全血（10-

100ul

）↓u1991年加入等體積6mol

/

L

NaI↓旋轉(zhuǎn)10-

20mi

n加入等體積氯仿-

異戊醇↓旋轉(zhuǎn)10-

20sLopa

r

ev提出使用NaI

的微量血提取離心5

mi

n，取出水相↓法,30mi

n完成,每毫升血可提取40-50ug核酸加入0.6體積異丙醇↓混勻，3mi

n后離心用37%異丙醇洗滌核酸沉淀物↓用10-

100ul

TE緩沖液溶解沉淀天津市第一中心醫(yī)院P

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.DNA、R

NA的濃度和純度測(cè)定紫外分光光度法測(cè)定時(shí)將樣品作適度的稀釋，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，記錄280nm和260nm的吸光度。280nm為蛋白吸收峰，260nm為核酸吸收峰。其中260nm處吸光度數(shù)用來(lái)計(jì)算樣品的核酸濃度。天津市第一中心醫(yī)院P

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.臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)的應(yīng)用及意義天津市第一中心醫(yī)院P

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.熒光P

CR檢測(cè)乙肝病毒DNA的臨床意義?

HBV病毒特點(diǎn)üüüHB

V屬嗜肝DNA病毒科，部分雙鏈DNA，3200堿基對(duì)目前分為A-

H八個(gè)基因型我國(guó)高感染率,

約1.

3億人感染?

HBV檢測(cè)üüü病原體抗原、抗體核酸?

1970年Dane在電鏡下發(fā)現(xiàn)完整病毒顆粒ü

Dane顆?！胁《竞诵抹?/p>

小球形顆?！缓胁《竞诵抹?/p>

管狀顆粒-

-

不含有病毒核心天津市第一中心醫(yī)院P

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.乙型肝炎病毒的傳播途徑?血液傳播：比如輸血過(guò)程中被感染?醫(yī)源性傳播：就醫(yī)的過(guò)程中被感染，因此要特別注意注射、接種、紋身等使用的各種醫(yī)療器具?母嬰傳播：乙肝免疫球蛋白可以有效的陰止乙肝母嬰或父嬰的傳播，有效率可達(dá)百分之九十?性傳播天津市第一中心醫(yī)院P

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.HBV

DNA定量測(cè)定?血液及血液制品的安全性檢測(cè)?未明原因有肝炎癥狀患者的HBV感染確認(rèn)或排除?HB

V感染者病毒復(fù)制水平的判斷?抗病毒藥物治療療效檢測(cè)?肝移植患者手術(shù)前后檢測(cè)天津市第一中心醫(yī)院P

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.乙肝表面抗原陽(yáng)性而HB

V-

DNA陰性，原因有：?病毒數(shù)量少，低于P

CR檢測(cè)下限?HBV_

DNA整合到人染色體上，經(jīng)肝活檢P

CR可為陽(yáng)性。不能排除病毒已清除，處于低水平的復(fù)制，仍然有傳染性?有可能是基因變異。乙肝表面抗體陽(yáng)性的患者仍然有部分可檢出HB

V-

DNA，可能為乙肝病毒變異引起天津市第一中心醫(yī)院P

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.乙肝病毒變異?

乙肝病毒變異是由抗病毒藥物或患者存在天然變異株所致，對(duì)指導(dǎo)臨床合理使用抗病毒藥物有著重要意義?

不同亞型的HB

V感染的臨床病程和對(duì)治療的反應(yīng)都存在著一定的差異?

肝硬化患者多為C基因型

,

B基因型與低年齡組肝癌的進(jìn)展有關(guān),檢測(cè)乙型肝炎病毒基因分型，對(duì)預(yù)后及抗病毒療效具有實(shí)際臨床意義天津市第一中心醫(yī)院P

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.熒光P

CR檢測(cè)丙肝病毒R

NA的臨床意義?HC

V病毒特點(diǎn)ü

1989年美國(guó)科學(xué)家邁克爾·侯頓等利用分子克隆技術(shù)發(fā)現(xiàn)了該病毒ü

黃病毒科;

球形;

單鏈RNA

9600個(gè)核苷酸ü

為變異率高不均一病毒株;

分為6個(gè)型和68個(gè)亞型?HC

V檢測(cè)üü病原體抗體ü核酸天津市第一中心醫(yī)院P

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.?丙型肝炎病毒的傳播途徑ü

血液及血制品傳播ü

生活密切接觸傳播:

如日常生活中共用剃須刀、牙刷等極易引起丙肝傳播ü

性傳播ü

母嬰傳播：若母親為丙肝患者，嬰兒感染丙肝的幾率約為10％ü

昆蟲叮咬傳播：有關(guān)資料顯示，蚊子細(xì)胞能結(jié)合復(fù)制丙肝病毒天津市第一中心醫(yī)院P

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.HCV

R

NA定量測(cè)定血清HC

V-

R

NA是感染、傳染、病毒復(fù)制的指標(biāo)，能直接代表病毒血癥水平。HC

V感染是輸血后肝炎的主要病因之一，可導(dǎo)致慢性肝炎、肝硬變，并與肝細(xì)胞癌的發(fā)生有關(guān)。HC

V抗體陽(yáng)性代表機(jī)體受到過(guò)HC

V的感染，可在病毒清除后仍長(zhǎng)時(shí)間存在，有報(bào)道說(shuō)該時(shí)間可長(zhǎng)達(dá)9年，因此無(wú)法準(zhǔn)確判別HC

V抗體陽(yáng)性是否有病毒血癥。而

HC

V-

R

NA是丙型肝炎的確診指標(biāo)。天津市第一中心醫(yī)院P

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.?

血液及血液制品的安全性檢測(cè)?

HC

V感染診斷的指標(biāo)?

判斷抗病毒治療的效果天津市第一中心醫(yī)院P

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.熒光定量P

CR檢測(cè)HC

MV-

DNA的意義?HCMV病毒特點(diǎn)皰疹病毒科;

雙鏈DNA基因全長(zhǎng)235-

240kb?HCMV檢測(cè)病原體抗體核酸天津市第一中心醫(yī)院P

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.HCMV感染途徑ü

先天性感染（宮內(nèi)感染）ü

獲得性感染（圍產(chǎn)期感染）ü

產(chǎn)后，乳汁中可分泌病毒ü

與排毒者長(zhǎng)期接觸，可經(jīng)唾液、尿、眼淚等傳播ü

性傳播天津市第一中心醫(yī)院P

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.HCMV

DNA定量測(cè)定?優(yōu)生優(yōu)育üü孕婦羊水HCMV

DNA檢測(cè)——是否現(xiàn)癥感染新生兒、幼小嬰兒HCMV-

I

gM陰性，而熒光探針定量P

CR陽(yáng)性，這是由于新生兒和嬰兒產(chǎn)生抗體的能力較弱，而不能檢出天津市第一中心醫(yī)院P

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.HCMV

DNA定量測(cè)定?器官移植、抗腫瘤治療病人HCMV感染的檢測(cè)對(duì)于免疫系統(tǒng)受到損傷的人群，HCMV

DNA是一個(gè)常用的監(jiān)測(cè)指標(biāo)，有助于臨床相應(yīng)治療措施的及時(shí)采取，避免嚴(yán)重后果的發(fā)生?抗病毒治療藥物療效的監(jiān)測(cè)通過(guò)連續(xù)監(jiān)測(cè)巨細(xì)胞病毒的含量變化可以了解病毒的復(fù)制狀況，從而為疾病的早期診斷與藥物療效觀察提供了更為直接的病原學(xué)依據(jù)天津市第一中心醫(yī)院P

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.熒光P

CR檢測(cè)結(jié)核桿菌的臨床意義?結(jié)核桿菌病菌特點(diǎn)ü

1887年德國(guó)科學(xué)家科赫發(fā)現(xiàn)；分為人型、牛型、鳥型、鼠型結(jié)核分支桿菌。對(duì)人有致病性的主要是人型ü

培養(yǎng)15-

20小時(shí)一代，2-

4周看到培養(yǎng)基上的菌落。抗菌治療后需6-

8周或20周才出現(xiàn)菌落ü

基因序列長(zhǎng)4411532bp天津市第一中心醫(yī)院P

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.?檢測(cè)標(biāo)本ü痰液ü活檢組織培養(yǎng)物腦脊液üü?涂片鏡檢10000-

100000菌/

ml?培養(yǎng)10-

100個(gè)活菌天津市第一中心醫(yī)院P

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.結(jié)核桿菌

DNA定量測(cè)定快速診斷肺結(jié)核結(jié)核桿菌菌血癥淋巴結(jié)核結(jié)核性腦膜炎結(jié)核性胸腹膜炎天津市第一中心醫(yī)院P

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.?

治療監(jiān)測(cè)定期檢測(cè)可評(píng)價(jià)抗結(jié)核藥物的療效天津市第一中心醫(yī)院P

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.熒光P

CR技術(shù)檢測(cè)E

B病毒的臨床意義?EB病毒特點(diǎn)1964年Eps

t

ei

n和Bar

r

培養(yǎng)成功；屬皰疹病毒科雙鏈DNA；基因組長(zhǎng)170000-

175000bp?傳播途徑無(wú)明顯癥狀｛唾液；輸血輕癥咽炎初次感染——幼兒時(shí)期上呼吸道感染終身攜帶病毒天津市第一中心醫(yī)院P

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.｛50%傳染性單核細(xì)胞增多癥感染B淋巴細(xì)胞原發(fā)感染——青年期全身感染終身潛伏在人體淋巴組織｛傳染性單核細(xì)胞增多癥淋巴癌與E

B病毒感染有關(guān)的疾病鼻咽癌何杰金氏癌慢性疲勞綜合癥天津市第一中心醫(yī)院P

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.E

BV

DNA定量測(cè)定?早期診斷E

B病毒急性感染引起的傳染性單核細(xì)胞增多癥，可在感染的早期明確病因?鼻咽癌治療監(jiān)測(cè)準(zhǔn)確及時(shí)地反映E

B病毒DNA的量，可作為鼻咽癌治療后預(yù)后、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的監(jiān)測(cè)指標(biāo)天津市第一中心醫(yī)院P

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.熒光P

CR技術(shù)檢測(cè)沙眼衣原體的臨床意義衣原體特點(diǎn)雙鏈DNA；基因組長(zhǎng)1.

5kb；比病毒大，比細(xì)菌小，呈球形｛沙眼生物變種—14個(gè)血清型三個(gè)生物變種

性病淋巴肉芽腫變種L

GV—4個(gè)血清型，人是天然宿主鼠生物變種—鼠是天然宿主，不侵犯人，與鼠肺炎有關(guān)天津市第一中心醫(yī)院P

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.?傳播途徑——性傳播疾病陰道、尿道感染子宮內(nèi)膜、輸卵管感染盆腔感染導(dǎo)致不孕u與人乳頭瘤病毒及人類免疫缺陷病毒感染有關(guān)?CT檢測(cè)üü涂片培養(yǎng)ü血清學(xué)試驗(yàn)核酸ü天津市第一中心醫(yī)院P

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.CT

DNA定量測(cè)定檢測(cè)陽(yáng)性——排除以下因素后可確診為CT感染ü藥物治療期間，已死亡的病原體也可檢出，應(yīng)停藥2周后進(jìn)行檢測(cè)，必要時(shí)應(yīng)用培養(yǎng)方法確診標(biāo)本運(yùn)送和操作應(yīng)嚴(yán)格按規(guī)程進(jìn)行，避免假陽(yáng)性ü檢測(cè)陰性——排除以下因素后可確診為無(wú)CT感染ü排除P

CR抑制物導(dǎo)致的假陰性ü排除耐藥引起基因突變導(dǎo)致的擴(kuò)增失敗天津市第一中心醫(yī)院P

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.熒光P

CR技術(shù)檢測(cè)解脲支原體的臨床意義?解脲支原體病菌特點(diǎn)ü

原核微生物；人類泌尿生殖道常見的共生微生物ü

雙鏈DNA；全長(zhǎng)200萬(wàn)-300萬(wàn)bpü

14個(gè)標(biāo)準(zhǔn)血清型，兩大生物群?傳播途徑——性傳播疾病üüü新生兒由母親生殖道分娩時(shí)感染成年男性感染部位在尿道黏膜女性感染部位在宮頸天津市第一中心醫(yī)院P

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DNA定量測(cè)定?解脲支原體所致疾病最常見的為非淋球菌性尿道炎，占非細(xì)菌性尿道炎的60%。實(shí)驗(yàn)室診斷最好的方法是分離培養(yǎng)、P

CR檢測(cè)?解脲支原體和沙眼衣原體是引起男女不孕不育的重要原因之一。熒光定量-

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CR技術(shù)用于診斷引起不孕不育的解脲支原體或沙眼衣原體泌尿生殖道感染是安全可靠的天津市第一中心醫(yī)院P

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DNA定量測(cè)定?在臨床標(biāo)本檢測(cè)到解脲支原體并不能確定是攜帶狀態(tài)還是感染狀態(tài),具體須結(jié)合患者臨床癥狀及其相關(guān)性病病原體的檢測(cè)來(lái)綜合判斷,臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對(duì)P

CR檢測(cè)結(jié)果做出適當(dāng)?shù)慕忉屘旖蚴械谝恢行尼t(yī)院P

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.熒光P

CR檢測(cè)淋球菌的臨床意義?淋球菌病菌特點(diǎn)üü革蘭氏陰性雙球菌

；人類是淋球菌唯一的自然宿主淋球病的致病機(jī)理復(fù)雜，其毒力與菌毛、莢膜、脂多糖和外膜蛋白的某些成份有關(guān)?傳播途徑——性傳播疾病üüü男性發(fā)生尿道炎女性引起尿道炎和子宮頸炎胎兒可經(jīng)產(chǎn)道感染造成新生兒淋病性急性結(jié)膜炎天津市第一中心醫(yī)院P

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DNA定量測(cè)定?P

CR方法可解決快速診斷；無(wú)癥狀攜帶者的檢測(cè)?對(duì)分離培養(yǎng)菌株的進(jìn)一步鑒定?抗生素治療的療效監(jiān)測(cè)?分子流行病學(xué)研究?疑似淋球菌感染的鑒別診斷天津市第一中心醫(yī)院P

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.熒光P

CR檢測(cè)HP

V的臨床意義?HP

V病毒特點(diǎn)HP

V呈球形；雙鏈DNA；基因組長(zhǎng)8000bp100多種基因型，33%與生殖道損傷有關(guān)?傳播途徑直接或間接接觸污染物性傳播低危型：HPV6、11——生殖道尖銳濕疣高危型：HPV16、18——宮頸癌