上海市臨檢中心 PCR培訓(xùn)課件 12.分子檢測標準物質(zhì)和質(zhì)控品（王雪亮）

分子檢測標準物質(zhì)和質(zhì)控品簡介上海市臨床檢驗中心王雪亮涉及疾病種類分子檢測技術(shù).

熒光原位雜交.

直接雜交.

基因芯片.

微流控芯片.

高分辨率溶解曲線.

質(zhì)譜技術(shù)PCR雜交測序構(gòu)象.

普通PCR法.

熒光PCR法.

數(shù)字PCR法.

Sanger測序.

二代測序.

三代測序分子檢測現(xiàn)狀6000050000400003000020000100000TestedGenesYearLabsTests20122013201420152016201718139542946148150396625151038134272526732621487265424936574073162071641620122013Labs2014201520162017TestedGenesTests/gtr/#testEGFR檢測錯誤率4035302520151050EGFR樣本不同醫(yī)院不同試劑不同批號不同時間檢測結(jié)果不一致！檢測結(jié)果間缺乏可比性！原因：分子診斷標準物質(zhì)、質(zhì)控品缺乏！標準物質(zhì)

定義：是一種已經(jīng)確定了具有一個或多個足夠均勻且穩(wěn)定的特性值（如特定的DNA/RNA分子序列或特定DNA/RNA豐度）的物質(zhì)或材料，已被確定其符合測量過程的預(yù)期用途。

用途：用以校準測量儀器和裝置、評價測量分析方法、給材料賦值、考核人員操作技術(shù)水平、質(zhì)量控制等。分子檢測標準物質(zhì)提供者

國外機構(gòu)：英國國家生物制品檢定所（NIBSC，從屬于WHO）、美國國家標準技術(shù)研究所（NIST）、歐盟標準物質(zhì)和測量研究（IRMM）、美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）、美國疾病預(yù)防與控制中心（CDC）、IRMM/IFCC等

國內(nèi)機構(gòu)：中國藥品生物制品研究院（NICPNP）、衛(wèi)生部臨床檢驗中心（NCCL）

國際標準物質(zhì)分級：可分為第一、第二和第三等三個登記。一級標準物質(zhì)數(shù)量有限，可使用10-20年，為凍干品形式。一級標準物質(zhì)可用來校準第二和第三級標準物質(zhì)。

國內(nèi)標準物質(zhì)分級：一級（國家級）和二級（部門級）標準物質(zhì)核酸類國家參考品（cFDA）核酸類國家參考品（cFDA）HIV1RNA耐藥核酸檢測試劑國家參考品HIV1RNA檢測定量試劑國家參考品寨卡病毒核酸檢測國家參考品高通量測序外周血胎兒染色體

非整倍體國家參考品HBVDNA核酸定量檢測試劑國家參考品HCVRNA核酸檢測試劑國家參考品HPV-L1

參考品測序儀性能評價用脫氧核糖核酸國家參考品新一代H7N9禽流感病毒核酸參考品淋球菌（NGH）DNA核酸檢測試劑國家參考品扎伊爾型埃博拉病毒核酸檢測試劑國家參考品甲型流感病毒核酸檢測試劑國家參考品乙型流感病毒核酸檢測試劑國家參考品甲型H1N1流感病毒核酸檢測試劑國家參考品EGFR突變HPVDNA全基因組參考品UU

DNA

核酸檢測試劑國家參考品地貧

核酸檢測試劑國家參考品結(jié)核分枝桿菌PCR試劑參考品結(jié)核分枝桿菌異煙肼耐藥基因檢測參考品結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥基因檢測參考品標準物質(zhì)的作用

標準物質(zhì)在保證產(chǎn)品質(zhì)量與檢驗結(jié)果的一致性方面具有以下重要作用

產(chǎn)品標準制定：標準物質(zhì)在產(chǎn)品標準制定、驗證與實施方面具有重要作用

量值傳遞：可用于試劑廠家、進行相關(guān)檢測的實驗室的量值傳遞或量值溯源

企業(yè)試劑生產(chǎn)質(zhì)量控制：標準物質(zhì)可高效與高質(zhì)量的保證產(chǎn)品生產(chǎn)過程的原材料檢驗、生產(chǎn)流程控制、產(chǎn)品質(zhì)量評價的質(zhì)量控制

認證機構(gòu)：校準儀器、驗證檢測方法、檢測準確度的評估

實驗室內(nèi)部質(zhì)量控制：可作為質(zhì)控品，用于實驗室內(nèi)部質(zhì)量控制用途

不同實驗室室間質(zhì)量評價

試劑盒性能評估和控制測試方法：如可作為ISO15189實驗室試劑盒性能評價和測試方法學(xué)驗證用質(zhì)

控

品定義：用于體外診斷的質(zhì)量控制物質(zhì)，是一種旨在用于醫(yī)學(xué)檢測系統(tǒng)中使用的物質(zhì)、材料等。目的：是評價或驗證測量精密度或由于試劑或分析儀器的變化導(dǎo)致的分析偏差等。用途：用于室內(nèi)質(zhì)量控制、室間質(zhì)量評價等。專家指出采用已知弱陽性和陰性質(zhì)控品進行室內(nèi)質(zhì)量控制是保證檢測質(zhì)量的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，其監(jiān)控的是實驗室測定的最重要的性能指標，即重復(fù)性，并決定了當批實驗測定是否有效，報告能否發(fā)出，是對實驗室測定的即時性評價。李金明等，涉及基因擴增的個體化醫(yī)學(xué)檢測質(zhì)量保證的重要性,2012,35(11),963-96612質(zhì)控品的種類?

根據(jù)有無測定值可分為定值質(zhì)控品和非定值質(zhì)控品。?

根據(jù)質(zhì)控品的物理性狀不同分為凍干質(zhì)控品、液體質(zhì)控品和固體質(zhì)控品。質(zhì)控品特性

基質(zhì)效應(yīng)小

質(zhì)控結(jié)果能真實反映性能

提高不同系統(tǒng)間質(zhì)控結(jié)果可比性

穩(wěn)定性好，有效期長

質(zhì)控參數(shù)可長期使用

避免由于質(zhì)控品問題導(dǎo)致的假陰性

監(jiān)測反應(yīng)全過程

已知靶值或預(yù)期結(jié)果

定量測定：陽性（高、低濃度）、陰性

定性測定：陽性（接近測定下限）、陰性

價格便宜

生物安全性常用質(zhì)控品類型?

臨床樣本?

細胞系?

人工制備樣本

基因組DNA

質(zhì)粒

假病毒顆粒

基因編輯

計算機模擬數(shù)據(jù)臨

床

樣

本臨

床

樣

本HCV臨床樣本作為質(zhì)控品鄧演超等，國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志,2013,

34(3):271-273組織樣本作為分子病理質(zhì)控品Dequeker

EM

etal,

JMolDiagn,

2016,

18(2):205-14.臨

床

樣

本優(yōu)點：缺點：?

來源有限

真實樣本

評價整個分析過程

包含所需基因序列?

生物傳染性?

可能存在異質(zhì)性最優(yōu)樣本臨床樣本制備質(zhì)控品注意事項

制備方法應(yīng)規(guī)范，制定相關(guān)的SOP文件

應(yīng)經(jīng)過質(zhì)量檢驗，保證與預(yù)期結(jié)果相符。細

胞

系Meissner

JD,

JGen

Virol.

1999Jul;80(NAMALWA細胞用于EBV檢測CYP2C19不同基因型王雪亮等,檢驗醫(yī)學(xué),

2015,30(11):

1078-1082LinGetal,

PLoSOne,2015,10(7):e0134174.細

胞

系缺點：優(yōu)點：?

細胞株有限

模擬真實樣本，穩(wěn)定性好

評價整個分析過程

生物安全性實用樣本

易于制備，成本低人工合成樣本——基因組DNA

經(jīng)驗證的臨床樣本

已知基因突變的細胞系24人工合成樣本——基因組DNA優(yōu)點：缺點：?

非“真實”樣本

有已知的突變位點

樣本均一

可再生?

不能監(jiān)測提取過程?

可能發(fā)生基因重排或丟失人工合成樣本——質(zhì)粒EklundC,

etal,2012,J.Clin.Microbiol,50:2289–2298.人工合成樣本——質(zhì)粒優(yōu)點：缺點：?

非“真實”樣本

明確的基因序列

易于生產(chǎn)，價格便宜?

不能監(jiān)測提取過程

無感染性

穩(wěn)定性好人工合成樣本——假病毒顆粒Pasloske

BL

et

al.,JClinMicrobiol.

1998

Dec;

36(12):3590-4.人工合成樣本——假病毒顆粒優(yōu)點：缺點：?

專利保護，價格昂貴

明確的基因序列

監(jiān)測反應(yīng)全過程

生物安全性?

表面結(jié)構(gòu)不同，不能

穩(wěn)定性好充分模擬真實病毒目前現(xiàn)狀？?

分子診斷項目快速增長?

新的技術(shù)發(fā)展（如NGS、數(shù)字PCR等）引入新的檢測項目但是……對于絕大多數(shù)分子診斷項目，現(xiàn)在還不能提供陽性質(zhì)控品（經(jīng)過確認的更是少之又少?。├纾耗野岳w維癥(CF)基因檢測

信息收集自35個美國臨床檢測實驗室所有臨床實驗室開展至少美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)院（ACMG）推薦的23個CF等位基因所有臨床實驗室鑒定102個不同的CF等位基因

僅有42個等位基因有相應(yīng)的細胞系60個等位基因還沒有可用的細胞！專家指出盡管少部分分子檢測項目已有質(zhì)控物質(zhì)，但是大部分的分子檢測項目還是缺乏有效的質(zhì)控物質(zhì)。其次，現(xiàn)在的多元質(zhì)控物質(zhì)商品的開發(fā)也不夠成熟。實驗室更愿使用免費的患者標本或者根本不進行質(zhì)量控制，只有罕見突變才勉強花錢購買質(zhì)控品。王治國等，分子診斷質(zhì)量控制面臨的問題，2012，6(30)，466-4670官方機構(gòu)-WHO/官方機構(gòu)-GeT-RM官

方

機

構(gòu)——其他American

Type

Culture

Collection/Coriell

CellRepositories/EuropeanCollection

ofCellCultures.uk/German

Collection

ofMicroorganisms

andCell

Cultureshttps://www.dsmz.de/Japanese

Collection

ofResearchBioresourceshttp://cellbank.nibiohn.go.jp/english/RikenBioresource

Centerhttp://en.brc.riken.jp/36商業(yè)化公司

Acrometrix

QiagenMarseille/cn//

InVivoScribe

AdvancedBiotechnologies//

LGCStandards

Diagnostic

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LifeSciences//default.aspx

Hologic(Third

Wave

Technologies)

Asuragen/en//質(zhì)控品的使用

陽性質(zhì)控（避免假陰性結(jié)果）

定性檢測：接近方法測定下限濃度

定量檢測：

測定線性范圍內(nèi)的高、低濃度

陰性質(zhì)控（避免假陽性結(jié)果）

擴增產(chǎn)物的污染、樣本間交叉污染、試劑污染等質(zhì)控品使用的注意事項

突變/基因型：帶入其中1~2種突變或基因型較弱陽性樣本及野生型樣本，在一定時間內(nèi)將所有已有質(zhì)控品突變（基因型）全部輪到

隨機