上海市臨檢中心 PCR人員上崗培訓(xùn)班 課件3、PCR 質(zhì)量控制2016.3.21 肖艷群

分子診斷質(zhì)量管理基本內(nèi)容和要求上海市臨床檢驗中心肖艷群質(zhì)量管理內(nèi)涵

質(zhì)量管理就是建立一個體系，使在實驗的全過程中所有影響實驗結(jié)果的環(huán)節(jié)都處于受控狀態(tài)，保證每個環(huán)節(jié)的協(xié)調(diào)和統(tǒng)一，確保實驗結(jié)果始終可靠分子診斷質(zhì)量管理要求制定依據(jù)

《醫(yī)療機構(gòu)臨床實驗室管理辦法》（衛(wèi)醫(yī)發(fā)[2006]73號）

《醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增檢驗實驗室管理辦法》（衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)[2010]194號）

醫(yī)學(xué)實驗室質(zhì)量和能力認可準則

ISO15189(CNAS-CL02)

醫(yī)學(xué)實驗室質(zhì)量和能力認可準則在分子診斷領(lǐng)域的應(yīng)用說明（CNAS-CL36）

醫(yī)學(xué)實驗室質(zhì)量和能力認可準則在組織病理學(xué)檢查領(lǐng)域的應(yīng)用說明（CNAS-CL37）基本內(nèi)容

質(zhì)量管理體系

人員

實驗室設(shè)置、環(huán)境和設(shè)施

設(shè)備與材料

實驗室信息系統(tǒng)

分析前質(zhì)量控制

分析過程質(zhì)量控制

分析后質(zhì)量控制一、質(zhì)量管理體系

分子診斷實驗室管理

質(zhì)量管理體系建立

文件和記錄管理分子診斷實驗室管理要求

醫(yī)療機構(gòu)對臨床基因擴增檢驗實驗室應(yīng)當(dāng)集中設(shè)置，統(tǒng)一管理

以科研為目的的分子檢測項目,不得向臨床出具檢驗報告,不得向病人收取任何費用質(zhì)量管理體系建立

作用?

建立并保持質(zhì)量管理體系有效運行的重要基礎(chǔ)?

規(guī)范各項工作，保證工作質(zhì)量

內(nèi)容：質(zhì)量手冊、程序文件、操作規(guī)程、記錄注意：適合自身實際情況，可操作性寫你所做的、做你所寫的、記你所做的質(zhì)量管理體系建立

編制實驗室管理文件，應(yīng)包括但不限于以下文件或程序1.組織和人員管理方面的文件，應(yīng)包括實驗室各類人員的崗位職責(zé)、崗位培訓(xùn)、繼續(xù)教育以及定期考核2.

環(huán)境、設(shè)施及安全管理3.

儀器、設(shè)備的采購、驗收、使用、維修、校準4.

檢驗試劑及其他相關(guān)消耗品的采購、驗收、保管、領(lǐng)用及使用5.

樣品的采集、運送、接收、處理及保存6.

檢驗方法的選擇、確認或驗證7.

檢驗項目及儀器設(shè)備標(biāo)準操作程序的建立和管理8.

檢驗結(jié)果質(zhì)量保證9.

檢驗報告管理的規(guī)定。其中包括結(jié)果的發(fā)放方式，報告的格式和內(nèi)容，以及有關(guān)保護患者隱私的規(guī)定10.

記錄的管理文件或程序，其中應(yīng)包括記錄的修改、保存及期限等要求11.

對差錯事故及不符合工作的糾正及預(yù)防措施12.

對服務(wù)對象投訴處理

實驗室所有的文件、程序應(yīng)完整、清晰，現(xiàn)行有效記錄管理

原始記錄和質(zhì)量記錄應(yīng)完整、清晰，電子記錄應(yīng)定期備份。實驗室所有質(zhì)量管理記錄均應(yīng)按相關(guān)規(guī)定保存注：質(zhì)量管理記錄，應(yīng)包括但不限于標(biāo)本接收、標(biāo)本儲存、標(biāo)本處理、儀器和試劑及耗材使用情況、校準、室內(nèi)質(zhì)控、室間質(zhì)評、檢驗結(jié)果、報告發(fā)放等內(nèi)容

無儀器打印結(jié)果的檢驗項目應(yīng)有原始記錄，記錄信息至少應(yīng)包括檢測日期、方法、試劑品牌、批號、有效期、檢驗結(jié)果、檢驗者注：凝膠圖像和斑點雜交原始記錄可通過掃描、拍照等方式保留二、人員要求

實驗室技術(shù)人員?

實驗室至少應(yīng)有2名有臨床基因擴增檢驗技術(shù)上崗證的本單位技術(shù)人員?

開展遺傳性疾病或基于組織、細胞等分子病理并出具診斷報告的實驗室，至少應(yīng)有1名具備出具相關(guān)診斷報告資質(zhì)的本單位醫(yī)師?

新進人員應(yīng)完成崗前培訓(xùn)和能力評估培訓(xùn)與效果評估

分子診斷實驗室應(yīng)有相應(yīng)的學(xué)習(xí)培訓(xùn)制度、計劃和記錄

定期（每12個月至少一次）對學(xué)習(xí)培訓(xùn)效果進行評估注1：工作人員的培訓(xùn)應(yīng)包括與其提供服務(wù)相關(guān)的、本實驗室質(zhì)量保證和質(zhì)量管理方面的專門培訓(xùn)注2：

a)計劃制定應(yīng)有針對性b)員工培訓(xùn)和能力評審以新進人員或轉(zhuǎn)崗人員為重點c)培訓(xùn)形式可以多樣：外出培訓(xùn)、科、組內(nèi)部培訓(xùn)、自學(xué)、交流等d)培訓(xùn)效果評估形式：考試、操作、通過培訓(xùn)解決問題、通過培訓(xùn)對自身能力和工作能力的提高e)培訓(xùn)記錄：可包括培訓(xùn)通知、培訓(xùn)課件、培訓(xùn)照片、簽到表、效果評價證據(jù)能力評估方式

直接觀察常規(guī)工作過程和程序，包括所有使用的安全操作

直接觀察設(shè)備維護和功能檢查

監(jiān)控檢驗結(jié)果的記錄和報告過程、核查工作記錄（實驗室原始記錄、質(zhì)控記錄、定標(biāo)記錄、試劑、使用記錄、儀器保養(yǎng)維護記錄、儀器維修記錄等）

評估解決問題的技能

使用特殊材料執(zhí)行一個給定程序（盲樣檢測、留樣再測）人員管理

應(yīng)建立分子診斷技術(shù)人員相關(guān)的教育背景、專業(yè)資格、培訓(xùn)、經(jīng)歷及能力記錄檔案，內(nèi)容包括：a)證書或執(zhí)照復(fù)印件b)教育或以前的工作資料c)職務(wù)說明d)繼續(xù)教育記錄e)能力評估等三、實驗室設(shè)置、設(shè)施與環(huán)境

普通PCR實驗室設(shè)置原則上分為四個區(qū)：試劑準備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴增區(qū)、產(chǎn)物分析區(qū)?

如使用全自動擴增分析儀，后兩區(qū)可合并?

如使用核酸提取、擴增和產(chǎn)物分析一體化的全自動分析系統(tǒng)，后三區(qū)可合并?

具體實驗室分區(qū)應(yīng)根據(jù)其所使用的技術(shù)平臺及檢驗項目和工作量而定

新一代測序技術(shù)實驗室設(shè)置原則：工作有序、互不干擾、防止污染、報告及時普通PCR實驗室產(chǎn)物分析區(qū)緩沖區(qū)擴增區(qū)緩沖區(qū)標(biāo)本制備區(qū)

試劑準備區(qū)緩沖區(qū)緩沖區(qū)工作流向注意事項：各區(qū)有獨立的緩沖區(qū)各區(qū)都有水池各區(qū)有獨立的通風(fēng)系統(tǒng)（建議有窗戶的房間為PCR實驗室）標(biāo)本制備區(qū)有沖眼器和生物安全柜產(chǎn)前篩查與產(chǎn)前診斷（全基因組低拷貝測序技術(shù)）測序區(qū)文庫擴增與檢測區(qū)標(biāo)本與文庫制備區(qū)試劑準備區(qū)緩沖區(qū)緩沖區(qū)緩沖區(qū)緩沖區(qū)工作流向

標(biāo)本與文庫制備區(qū)：血漿分離、DNA提取、末段修復(fù)與純化、家“A”與純化、接頭連接與純化

文庫擴增與檢測區(qū)：PCR擴增與純化、文庫濃度檢測、pooling

、pooling后文庫定量

測序區(qū)：測序前準備（乳液PCR及磁珠富集）、測序上機、信息分析、報告審核及發(fā)放植入前胚胎遺傳學(xué)診斷（全基因組低拷貝測序）電泳區(qū)緩沖區(qū)測序區(qū)文庫檢測區(qū)緩沖區(qū)擴增一區(qū)緩沖區(qū)WGA制備區(qū)試劑準備區(qū)緩沖區(qū)緩沖區(qū)緩沖區(qū)工作流向WGA制備區(qū)：全基因組擴增電泳區(qū)：DNA檢測及結(jié)果反饋、DNA打斷擴增一區(qū)：末端修復(fù)及純化、加“A”與純化、接頭連接與純化、pooling

、缺口平移文庫檢測：測序區(qū)：擴增前準備（乳液PCR及磁珠富集）、測序儀上機數(shù)據(jù)分析、報告發(fā)放遺傳病診斷+腫瘤診斷與治療（雜交捕獲測序技術(shù)+Sanger測序驗證）電泳區(qū)測序區(qū)

文庫檢測區(qū)

文庫擴增區(qū)

雜交鋪獲區(qū)

DNA打斷區(qū)

標(biāo)本與文

試劑準備（擴增二區(qū)（擴增一區(qū)）庫制備區(qū)區(qū)緩沖區(qū)緩沖區(qū)緩沖區(qū)緩沖區(qū)緩沖區(qū)緩沖區(qū)緩沖區(qū)緩沖區(qū)標(biāo)本與文庫制備區(qū)：DNA提取及檢測、純化測OD、末端修復(fù)與純化、加“A”與純化、Adapter連接與純化雜交捕獲區(qū)：Pre-Captured-PCR與純化

、OD值檢測及pooling、雜交、洗脫與純化文庫擴增與檢測區(qū)：Post-Captured-PCR與純化、Pooling及文庫定量檢測測序區(qū)：測序前準備（C-Bot制備)、測序儀上機數(shù)據(jù)分析、結(jié)果解讀、Sanger驗證、報告發(fā)放Sanger測序驗證標(biāo)本與文庫制備區(qū)：DNA提取與檢測、目的片段PCR反應(yīng)準備擴增一區(qū)：目的片段擴增與純化、測序PCR前準備電泳區(qū)：電泳擴增二區(qū)：測序PCR擴增與純化測序儀上機、結(jié)果分析與解讀、報告發(fā)放高通量測序?qū)嶒炇以O(shè)計注意事項

電泳區(qū)：DNA提取、DNA純化后大小檢定等步驟需用電泳，單獨成區(qū)，但不同的檢測項目可共用

測序區(qū)：應(yīng)根據(jù)使用儀器要求設(shè)定溫、濕度（一般為恒溫恒濕實驗室，2小時內(nèi)溫度波動不超過2℃）

分區(qū)設(shè)置可根據(jù)自動化儀器設(shè)備做適當(dāng)區(qū)間整合

無創(chuàng)產(chǎn)前篩查實驗室，應(yīng)血漿提取為胎兒微量DNA，為防止污染，不能與其他項目的標(biāo)本制備區(qū)共用

其他：實驗室通風(fēng)、生物安全柜等要求參照普通PCR實驗室實驗室設(shè)置、設(shè)施與環(huán)境

實驗室有足夠的空間保證：標(biāo)本處置符合分析前、后樣本分區(qū)放置、儀器放置符合維修和操作要求、打印檢驗報告時交叉污染的控制

標(biāo)本接收區(qū)建議放在四個區(qū)域以外的房間

開展基于組織的分子病理項目宜有獨立的切片制備和前處理（脫蠟、水化）區(qū)域

。脫蠟、水化應(yīng)在通風(fēng)設(shè)施中進行實驗室設(shè)置、設(shè)施與環(huán)境

各工作區(qū)域應(yīng)有明確的標(biāo)記

進入和使用實驗室各區(qū)域應(yīng)有明確的限制和措施，防止患者和其他非相關(guān)人員的隨意進出

實驗室應(yīng)根據(jù)所用儀器和檢測過程對環(huán)境溫、濕度的要求，規(guī)定實驗室溫、濕度允許范圍，有效實施監(jiān)控，并有記錄

不同的實驗區(qū)域應(yīng)有其各自的清潔用具以防止交叉污染實驗室工作要求

進入各工作區(qū)域應(yīng)按照單一方向進行

不同工作區(qū)域內(nèi)的設(shè)備、物品不得混用

不同的工作區(qū)域宜使用不同的工作服，工作人員離開各工作區(qū)域時不得將工作服帶出

工作結(jié)束后，必須立即對工作區(qū)進行消毒?？墒褂每梢苿幼贤鉄粼诠ぷ魍瓿珊笳{(diào)至實驗臺上60～90cm內(nèi)照射

實驗室的清潔應(yīng)當(dāng)按試劑貯存和準備區(qū)→標(biāo)本制備區(qū)→擴增區(qū)→擴增產(chǎn)物分析區(qū)的方向進行

有消毒和清潔相關(guān)的記錄實驗室工作要求

實驗室所有操作應(yīng)符合《實驗室生物安全通用要求》

標(biāo)本處理需在生物安全柜內(nèi)進行，對具有潛在傳染危險性的材料，必須在生物安全柜內(nèi)開蓋

所有經(jīng)過檢測的反應(yīng)管不得在擴增區(qū)打開

凝膠電泳、雜交、測序等應(yīng)在產(chǎn)物分析區(qū)進行，應(yīng)注意此區(qū)擴增產(chǎn)物的污染

實驗室應(yīng)嚴格管理實驗標(biāo)本，醫(yī)療廢棄物應(yīng)按《醫(yī)療廢棄物管理條例》進行管理四、設(shè)備與材料

實驗室必須有合適、充分、質(zhì)量可靠的儀器、設(shè)備、試劑、耗材、輔助品，適用于各類型、各種工作量的需求，以保證檢驗質(zhì)量

實驗室所使用的儀器、商品試劑、耗材、輔助品必須符合國家相關(guān)規(guī)定儀器：必須三證齊全試劑：必須CFDA批準（高通量測序試點單位可在限定范圍內(nèi)開展LDT，藥監(jiān)認可？）儀器要求

各類儀器設(shè)備均有專人保管，制定維護保養(yǎng)計劃，比對/校準程序，編制年度校準、檢定計劃，并有執(zhí)行記錄。??維護保養(yǎng)計劃應(yīng)有維護參數(shù)、維護周期，如何維護等（含氯消毒液腐蝕作用應(yīng)注意，75%乙醇）校準計劃中應(yīng)有校準儀器、校準單位、校準周期、校準參數(shù)、校準符合要求的判斷標(biāo)準

維護、比對/校準的頻度應(yīng)參照國家計量部門或制造廠商的要求進行，廠商沒有規(guī)定的則每年至少進行一次。應(yīng)有正規(guī)的校準報告儀器校準

需對加樣系統(tǒng)、溫控系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)進行校準

需校準/檢定儀器：擴增儀、雜交儀、生物安全柜、高速冷凍離心機、恒溫金屬浴、移液器、溫度計、溫濕度計等，開展分子病理項目需定期對切片機、撈片水浴槽進行校準

有合格的校準或檢定報告（保留校準原始記錄）關(guān)注：校準參數(shù)是否齊全、校準量程是否覆蓋常用檢測量程、校準結(jié)果是否符合檢測要求校準設(shè)備舉例校準設(shè)備校準周期一年校準單位校準參數(shù)判斷標(biāo)準相關(guān)標(biāo)準溫控系統(tǒng)(溫濕度計、溫度計、雜交儀)計量院/比對

溫度、濕度（檢測過程涉及）加樣系統(tǒng)（移液器）1年計量院/通過認

允許誤差、測量重復(fù)

JJG646-2006性（檢測過程涉及常用量程）證的廠家光路部分、背景熒光、檢測系統(tǒng)（擴增儀等）1年1年1年廠家/計量院

溫控部分（溫度準確度、均一性、溫度升降速率）產(chǎn)品說明書有資質(zhì)的第三

高效過濾器完整性、方機構(gòu)生物安全柜流入氣流流速、下降

產(chǎn)品說明書氣流流速、氣流模式高速冷凍離心機廠家/計量院溫度、轉(zhuǎn)速相關(guān)標(biāo)準校準、比對

新購設(shè)備在使用前都應(yīng)校準

內(nèi)部校準應(yīng)符合CNAS-CL31《內(nèi)部校準要求》，人員資質(zhì)、環(huán)境要求、測量不確定度

內(nèi)部比對記錄信息最少應(yīng)包括：比對設(shè)備編號、用于比對設(shè)備的校準信息（校準日期、校準有效期、校準單位）、比對時間、標(biāo)準設(shè)備、實測數(shù)據(jù)、比對設(shè)備實測數(shù)據(jù)、判斷標(biāo)準、結(jié)論、比對人、比對日期、

科室負責(zé)人。設(shè)備出現(xiàn)故障時處理措施

應(yīng)立即停止使用，并加上明顯標(biāo)識

修復(fù)的設(shè)備如影響儀器性能，必須經(jīng)校準、檢定（驗證）或檢測滿足要求后方能再次投入使用???可校準的項目實施校準質(zhì)控品檢測結(jié)果在允許范圍內(nèi)與其他儀器的檢測結(jié)果比較（5個樣本，覆蓋測量范圍，至少4個樣本測量結(jié)果偏移<±7.5%

）?使用留樣再測結(jié)果進行判別(5個樣本，覆蓋測量范圍，至少4個樣本測量結(jié)果偏移<±7.5%

）

實驗室應(yīng)檢查由于上述缺陷對以前所進行的檢測工作的影響，并記錄相關(guān)分析、處理意見耗材、試劑要求

檢驗試劑和一次性耗材有專人保管，應(yīng)在有效期內(nèi)使用，并按其規(guī)定的保存要求存放

實驗室應(yīng)對關(guān)鍵耗材、不同批號試劑進行驗收??外觀檢查：包裝完整性、溫度要求、有效期等性能驗證：不同批號試劑間的差異、重要耗材的抑制物（如使用不含抑制物免檢，但應(yīng)有注明）a)定性檢驗試劑：選擇陰性和弱陽性的樣品，結(jié)果符合預(yù)期b)定量檢驗試劑：5個舊批號試劑檢測過的樣品，覆蓋測量區(qū)間（包括陰性、臨界值、低值、中值和高值），至少4個樣品測量結(jié)果偏倚<±7.5%，其中陰性和臨界值樣品必須符合預(yù)期）c)耗材的抑制物驗收：參照試劑方法和要求五、實驗室信息系統(tǒng)

建立信息系統(tǒng)管理制度，制訂計算機（辦公用除外）和計算機網(wǎng)絡(luò)使用權(quán)限、登陸密碼、維護的規(guī)定，有計算機安全保密和病毒防范的要求，并定期備份計算機數(shù)據(jù)，保證信息安全和完整。

包括標(biāo)本接收、報告發(fā)放流程六、分析前質(zhì)量控制

ISO/IEC

15189對于分析前程序的明確定義：按照時間順序，從臨床醫(yī)生開出醫(yī)囑開始，到分析檢驗程序時終止的步驟，包括檢驗申請、患者的準備、原始樣品的采集、運送到實驗室并在實驗室進行傳輸

這個過程大部分工作都是醫(yī)生、護士、護工等在實驗室以外完成的分析前主要環(huán)節(jié)

確保患者樣品的采集方法正確

在采集過程中確保樣品和信息的完整和準確性

在檢測前和檢測后的樣品的運輸和儲存過程符合規(guī)范

患者樣品處理（例如核酸提?。┓弦?guī)范分析前質(zhì)量要求

實驗室應(yīng)有各類患者準備、標(biāo)本采集、運送、接收（或拒收）、保存和安全處置的具體要求和操作規(guī)程

標(biāo)本應(yīng)正確采集并符合檢測要求，特別注意分泌物、痰液、腫瘤組織等樣品留取的注意事項

標(biāo)本運送應(yīng)符合相關(guān)時間、溫度和生物安全的要求，并進行有效監(jiān)控

標(biāo)本接收時有接收時間和狀態(tài)記錄分析前質(zhì)量要求

標(biāo)本拒收原因要明確，并有記錄

定期分析標(biāo)本拒收原因，有切實可行的整改措施

基于組織/細胞形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)的分子檢測項目應(yīng)由專業(yè)人員進行樣品質(zhì)量評估，確認樣品是否滿足檢測要求

標(biāo)本檢測全過程包括核酸提取、擴增、產(chǎn)物分析、保存等應(yīng)能溯源，分子病理檢測項目在檢測過程中應(yīng)以病理號作為原始標(biāo)本、取材標(biāo)本（包埋盒）、蠟塊或切片的唯一性標(biāo)識

標(biāo)本應(yīng)按相關(guān)規(guī)定保存，并進行監(jiān)控和記錄影響因素

標(biāo)本采集時間

標(biāo)本類型和采集量

標(biāo)本運輸和保存

標(biāo)本質(zhì)量的評價標(biāo)本采集時間

血清（漿）：無特殊要求

用于產(chǎn)前診斷等標(biāo)本采集時間應(yīng)遵循相關(guān)技術(shù)指南要求標(biāo)本采集類型及采集量

標(biāo)本類型的選擇應(yīng)考慮到不影響檢測結(jié)果的準確性以及采集樣本的可能風(fēng)險

標(biāo)本采集量應(yīng)根據(jù)所測病原體而定，一般來說，如果樣本的量對病原體培養(yǎng)夠用的話，則其量亦足以用于核酸提取及其后的擴增檢測注意：樣本采集量需考慮到實驗室本身的需求以及復(fù)核實驗所需量

基于組織/細胞的分子病理項目參照相關(guān)診治指南標(biāo)本運送

實驗室應(yīng)根據(jù)待測靶核酸的特性，對各種臨床標(biāo)本的運送條件（溫度、時間）作出相應(yīng)規(guī)定?

靶核酸為DNA的標(biāo)本，可室溫下運送，建議采集后8h內(nèi)送至實驗室?

靶核酸為RNA的標(biāo)本，10

min可室溫運送，如所需時間較長，則應(yīng)在加冰條件下運送，建議采集后4h內(nèi)送至實驗室?

冰凍組織樣本最好保證其在運送過程中不發(fā)生融化?

石蠟包埋組織可室溫下運送標(biāo)本保存

靶核酸(尤其是RNA)易受核酸酶的作用而迅速降解，因此標(biāo)本的保存對于核酸擴增測定的有效性極為重要?

靶核酸為DNA的標(biāo)本，2-8℃保存72h,靶核酸為RNA的標(biāo)本應(yīng)-20℃保存。長期保存均應(yīng)凍存-70℃?

純化后的DNA，可在TE緩沖液中2-8℃保存1年

,-20℃可長期保存純化后的RNA應(yīng)于TE緩沖液中-70℃保存?

石蠟包埋組織可在2-8℃長期保存標(biāo)本接收、驗收、拒收

接收的標(biāo)本應(yīng)收集在原始容器中，不能接受從其他檢測如生化、免疫檢驗等分出來的標(biāo)本，因其有較大的發(fā)生標(biāo)本間污染的可能性

組織標(biāo)本應(yīng)由有經(jīng)驗的工作人員進行病理標(biāo)本評估，腫瘤細胞所占比例應(yīng)達到所用檢測方法的要求

標(biāo)本拒收標(biāo)準：容器破損、量不夠、時間不符合要求、重度溶血、重度脂血、評估質(zhì)量不合格標(biāo)本七、分析過程質(zhì)量控制

檢驗項目開展

檢驗方法的確認與驗證

制定和執(zhí)行檢驗項目標(biāo)準操作規(guī)程

建立質(zhì)量控制程序

檢驗結(jié)果的可比性檢驗項目開展

臨床需求

臨床價值

檢驗周期（TAT）檢驗方法學(xué)驗證

應(yīng)制定方法學(xué)驗證操作規(guī)程，對新開項目或?qū)υ许椖康膬x器、試劑、方法更新時應(yīng)進行方法學(xué)驗證，并滿足驗證試驗的要求并有相應(yīng)的實驗記錄?

定性檢測項目分析性能驗證內(nèi)容至少應(yīng)包括：精密度和符合率?

定量檢測項目分析性能驗證內(nèi)容至少應(yīng)包括：精密度、正確度、線性范圍、檢出限方法學(xué)驗證注意事項

熟悉驗證系統(tǒng)

質(zhì)控在控，數(shù)據(jù)才可用

實驗方案設(shè)計：標(biāo)本選擇（標(biāo)本數(shù)量、濃度、不同基因型）試驗周期、比對方法的選擇、結(jié)果統(tǒng)計和評價實驗室應(yīng)獨立完成性能驗證試驗，充分了解驗證系統(tǒng)的檢測性能驗證的最低要求定量檢測

至少應(yīng)驗證精密度、正確度、測量區(qū)間（線性）、檢出限；⒈

精密度驗證

選取2個濃度，其中一個應(yīng)盡可能選擇臨床決定水平的濃度?？擅刻鞙y定3次，連續(xù)5天。結(jié)果應(yīng)符合廠商聲稱的指標(biāo)。⒉

正確度

可采用下列方式之一a、與參考方法比對b、測定參考物質(zhì)c、與公認或主流方法比對⒊

測量區(qū)間

至少采用廠商聲明測量區(qū)間內(nèi)的5個濃度進行檢測。⒋

參考范圍

至少檢測20例表觀正常人。檢出限定性檢測

至少應(yīng)驗證重復(fù)性和符合率⒈

重復(fù)性

采用弱陽性和陰性樣本各一份（陽性樣本獲取有困難時可使用質(zhì)控品），每天檢測3次，連續(xù)測量5天，符合率>90%。⒉

符合率

可采用下列方法之一a、標(biāo)準血清盤b、臨床診斷明確的陰性和陽性樣本各10份c、與公認或主流方法比對操作規(guī)程

臨床實驗室開展的每個項目均應(yīng)有操作規(guī)程且現(xiàn)行有效，標(biāo)準操作規(guī)程至少應(yīng)包含下列內(nèi)容：（1）項目名稱、檢驗方法名稱；（2）方法學(xué)原理；（3）試劑品牌、代號、包裝規(guī)格、內(nèi)含物；（4）儀器品牌、型號；（5）具體操作步驟（包括主要的儀器測定參數(shù)）；（6）質(zhì)控品使用方法、使用水平和頻率、質(zhì)控規(guī)則；（7）操作性能概要，如精密度、正確度、線性范圍、可報告范圍、靈敏度、特異性、方法的局限性（如干擾物質(zhì)等）、操作注意事項；（8）參考值或參考范圍；（9）臨床意義；（10）病人準備、標(biāo)本要求；（11）參考文獻；（12）編寫者和日期；（13）科主任對每個項目操作規(guī)程的簽字認可，確定生效日期。

編寫各類儀器設(shè)備的操作規(guī)程，操作規(guī)程中應(yīng)有儀器使用、維護保養(yǎng)、校準等內(nèi)容；儀器設(shè)備和檢驗項目的簡易操作卡應(yīng)與正式操作規(guī)程保持一致。質(zhì)控要求

編寫室內(nèi)質(zhì)控和室間質(zhì)評的操作規(guī)程，以監(jiān)控和評價分析過程的質(zhì)量

凡出具臨床檢測報告的項目均應(yīng)開展室內(nèi)質(zhì)控

凡出具臨床檢測報告的項目均應(yīng)參加室間質(zhì)評室內(nèi)質(zhì)控

目的

監(jiān)測和控制實驗室常規(guī)工作的精密度，即實驗室測定的批內(nèi)和批間重復(fù)性

IQC結(jié)果決定了實驗室即時測定結(jié)果的可靠性和有效性質(zhì)控品來源及使用

來源:第三方、試劑盒自帶、自制

品種：臨床標(biāo)本、人工合成

使用:?

凍干質(zhì)控品復(fù)溶時，要確保所用溶劑的質(zhì)量、所加溶劑的量要準確、應(yīng)輕輕搖勻，切忌劇烈振搖?

避免反復(fù)凍融

室內(nèi)質(zhì)控最好監(jiān)控核酸提取、擴增、產(chǎn)物分析等標(biāo)本檢測全過程

基于組織的分子病理陰性質(zhì)控宜能監(jiān)測包括切片在內(nèi)的全過程質(zhì)控品設(shè)置、數(shù)量

定性檢測：每次實驗應(yīng)設(shè)置1份陰性、1份弱陽性和/或陽性質(zhì)控品。如為基因突變、基因多態(tài)性或基因型檢測，則應(yīng)包括最能反映檢測情況的突變或基因型樣品，每批檢測的質(zhì)控品至少應(yīng)有一種基因突變或基因型，并建議在一定周期內(nèi)涵蓋所有的基因型

定量檢測：每次實驗室應(yīng)應(yīng)使用相應(yīng)濃度的質(zhì)控品和1份陰性質(zhì)控品

弱陽性/陽性質(zhì)控品作用：監(jiān)測核酸提取和擴增的有效性

陰性質(zhì)控品作用：監(jiān)控核酸提取過程中是否發(fā)生污染、試劑是否存在污染質(zhì)控品位置

室內(nèi)質(zhì)控品在擴增儀中的排列順序：不宜固定位置,盡可能監(jiān)測每一個孔擴增有效性

板上雜交和膜上斑點印跡雜交的質(zhì)控：陽性和陰性質(zhì)控應(yīng)該在同一板或膜上與病人標(biāo)本平行進行分析，這可排除不同反應(yīng)中因使用不同雜交條件所致的對結(jié)果的錯誤解釋質(zhì)控品均值建立

暫定均值的建立：20d內(nèi)得到20個數(shù)值，或至少在5d內(nèi)，每天不少于4次重復(fù)檢測獲得20個數(shù)值。對數(shù)據(jù)進行離群值檢驗（剔除超過3s外的數(shù)據(jù)），計算出均值，作為暫定均值

常規(guī)均值的建立：以最初20個數(shù)據(jù)和三至五個月在控數(shù)據(jù)匯集的所有數(shù)據(jù)計算的累積平均數(shù)作為質(zhì)控品有效期內(nèi)的常規(guī)均值，并以此作為以后室內(nèi)質(zhì)控圖的均值

若使用定值質(zhì)控品，均值必須在實驗室內(nèi)使用本室現(xiàn)行的檢測系統(tǒng)進行確定，質(zhì)控品說明書上的原有標(biāo)定值只能作參考常用質(zhì)控規(guī)則的符號、定義及作用符

號定義作用12S一個質(zhì)控測定值超出±2s控制限一個質(zhì)控測定值超出±3s控制限警告13S22SR4S隨機誤差系統(tǒng)誤差隨機誤差兩個連續(xù)的質(zhì)控測定值同時超出+2s或－2s控制限x同一批測定中，兩個不同濃度質(zhì)控物的測定值之間的差值超出4s控制限41S四個連續(xù)的質(zhì)控測定值同時超出+1s或－1s控制限系統(tǒng)誤差系統(tǒng)誤差系統(tǒng)誤差7T7個連續(xù)的質(zhì)控測定值同時呈現(xiàn)一個向上或向下的趨勢變化10X十個連續(xù)的質(zhì)控測定值同時處于均值的同一側(cè)失控處理

及時查找原因，采取糾正措施

填寫失控原因分析報告失控原因分析

陽性質(zhì)控樣本常見的失控原因?

核酸提取中隨機誤差：如提取過程核酸丟失、有機溶劑去除不徹底、標(biāo)本中擴增抑制物殘留等?

儀器問題：如擴增儀孔間溫度不均一性、孔內(nèi)溫度與所示溫度不一致性等?

試劑問題：如Taq酶和/或逆轉(zhuǎn)錄酶失活、探針純度標(biāo)記效率、核酸提取試劑效率等失控原因分析

陰性質(zhì)控樣本常見的失控原因?

標(biāo)本核酸提取過程中發(fā)生的標(biāo)本間的交叉污染：實驗室的以前擴增產(chǎn)物的污染、標(biāo)本間的交叉污染、強陽性標(biāo)本氣溶膠經(jīng)加樣器導(dǎo)致污染、強陽性標(biāo)本經(jīng)操作者手導(dǎo)致污染、

翻蓋離心管在較高溫度溫育時蓋子崩開?

擴增產(chǎn)物污染預(yù)防措施

避免基因擴增檢驗假陽性結(jié)果的措施?????嚴格的實驗室分區(qū)使用帶“濾芯”的吸頭使用防“污染”（含UNG）的PCR試劑設(shè)立“陰性”質(zhì)控（與標(biāo)本同時處理）臨床“假陽性”問題：病原微生物如結(jié)核桿菌經(jīng)藥物治療后已死亡，但PCR仍可為陽性，故治療結(jié)束后至少兩周內(nèi)不宜做PCR檢測

避免基因擴增檢驗假陰性結(jié)果的措施?避免由于來自于標(biāo)本的血紅蛋白、肝素、某些激素或來自標(biāo)本處理中的去垢劑、有機溶劑的抑制作用的措施：純化核酸；標(biāo)本重復(fù)雙份測定；稀釋標(biāo)本?定期對擴增儀的溫度控制和加熱模塊中熱傳導(dǎo)的一致性進行檢查和校準操作注意事項

在試劑準備區(qū)配置反應(yīng)混合液，先將dNTP、引物、酶和緩沖液混合后，再分裝

配制反應(yīng)體系時，應(yīng)注意移液器使用方法，所有液體都要緩慢加至管底，不要加至管壁，所有液體混勻要用振蕩器進行，不能用移液器吹打，反應(yīng)體系配制完畢后低速離心數(shù)秒，避免產(chǎn)生氣泡

分裝的試劑注意冷藏，防止酶試劑失活及有機大分子降解

優(yōu)先選擇含UNG的試劑盒

試劑經(jīng)充分溶解后混勻，離心后再開蓋，保持試劑均勻性

擴增管、樣品處理管及吸頭等實驗用品，均需高壓滅菌

標(biāo)本處理應(yīng)在標(biāo)本制備區(qū)生物安全柜內(nèi)進行，實驗前應(yīng)打開風(fēng)機5-10min，待柜內(nèi)空氣凈化并氣流穩(wěn)定后再進行實驗操作

為防止標(biāo)本間交叉污染，在打開離心管前宜短暫離心操作注意事項

棄上清提取方法，離心時應(yīng)注意離心管方向，吸棄上清時不要碰到沉淀部分，以免造成提取效率降低

標(biāo)本處理嚴格按照試劑說明書進行操作，應(yīng)做到處理時間充分，保證標(biāo)本中的DNA或RNA完全釋放

將提取的核酸加到反應(yīng)體系中后，應(yīng)將純化好的剩余核酸樣本凍存，以免在擴增檢測時出現(xiàn)意外需要重新檢測。在結(jié)果確定后再將這些樣本按生物污染廢棄物進行處理

在判斷結(jié)果時，應(yīng)先對擴增的熒光信號作出定性判斷，然后再進行定量分析，避免一些非特異熒光信號對結(jié)果分析的干擾

擴增后的擴增管不能在擴增及產(chǎn)物分析區(qū)打開處理，應(yīng)用一次性手套包好遠離PCR實驗室的洗滌間消毒處理

工作結(jié)束后，必須立即對各工作區(qū)進行清潔PCR質(zhì)控其它要求

必要時，被檢基因組核酸（DNA和/或RNA）濃度應(yīng)符合制造商規(guī)定的要求

實驗結(jié)果有效性判斷標(biāo)準?

標(biāo)準曲線平滑均勻，斜率、截距和/或相關(guān)系數(shù)、內(nèi)標(biāo)等參數(shù)的數(shù)值允許變化范圍均應(yīng)在試劑制造商推薦的范圍