昆蟲病原細菌

關(guān)于昆蟲病原細菌第1頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月

昆蟲受細菌感染而引起的疾病稱之為細菌病，細菌病的共同特征是當昆蟲被細菌感染以后，都不再活動，食欲減退，以后口腔與肛門有排泄物排出等現(xiàn)象。大多數(shù)的病原菌侵入昆蟲體腔后，常常引起感染而引起敗血癥。死后的蟲體顏色加深，迅速變?yōu)楹稚蚝谏?，蟲體大都軟化腐爛，失去原形，內(nèi)部組織亦可能因潰爛而呈粘著性，一般還帶有臭味。昆蟲的細菌病通稱為軟化病。軟化病都具有傳染性，在任何地區(qū)、任何時期都易發(fā)生流行。第2頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月一、昆蟲病原細菌的主要類群

一、專性病原細菌

金龜子乳狀病病原細菌

二、兼性芽孢細菌

蘇云金桿菌、蠟質(zhì)桿菌

三、潛能無芽孢病原細菌

包括假單孢菌科曲銅綠極毛桿菌、螢光極毛桿菌和腸桿菌科的氣桿菌、變形桿菌等

四、兼性無芽孢病原細菌

粘質(zhì)賽氏桿菌

第3頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月微生物殺蟲病原細菌應(yīng)該具備基本的屬性：

(1)毒力高菌劑毒力足以壓倒害蟲的抗病力，能夠穩(wěn)定可靠地使害蟲發(fā)病致死。(2)穩(wěn)定性菌劑不致因受自然環(huán)境影響(如日光、干燥等)、人工處理、懸浮劑、載體、貯藏、不同施藥方式等而減低殺蟲效力．(3)殘效期長，并有在害蟲種群中自然傳播的能力。(4)作用迅速。(5)有選擇性即對防治對象劇毒，而對植物、益蟲以及哺乳動物等無毒。(6)可以大規(guī)模生產(chǎn)，經(jīng)濟安全第4頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月

蘇云金桿菌（Bacillusthuringiensis簡稱B.t）是具有伴孢晶體和外毒素的細菌，能殺死許多種鱗翅目、膜翅目、雙翅目和鞘翅目的昆蟲，如危害松樹的松毛蟲，危害國槐、楊、柳、樺、云杉、松樹和多種灌木的槐尺蠖、春尺蠖、云杉尺蠖、柳毒蛾、楊小舟蛾、黑點葉蜂、松葉蜂、天幕毛蟲等。二、蘇云金桿菌第5頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月第6頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月蘇云金芽孢桿菌第7頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月

本病病原細菌屬真細菌目，芽孢桿菌科，芽孢桿菌屬。學(xué)名蘇云金芽孢桿菌（Bacillusthuringiensissubsp.sottoIshiwatas）。蘇云金桿菌的發(fā)現(xiàn)有上百年的歷史，最初日本人石渡（Ishiwata）在1901年從病蠶尸體中分離出一株所謂卒倒細菌（sottobacteria）。按現(xiàn)在的分類系統(tǒng)，石渡當時所分離出來的菌株，應(yīng)該是蘇云金桿菌猝倒變種（B.thuringiensisVar.sotto)，屬血清型4a,4b。

1、發(fā)現(xiàn)史第8頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月1911年昆蟲病理學(xué)家Berliner在德國蘇云金Thutingn的一個面粉廠的地中海粉斑螟Anagastaruchniela患病幼蟲中又分離到這種產(chǎn)伴孢晶體的芽孢桿菌，1915年定名為蘇云金芽孢桿菌，一般稱蘇云金桿菌。他指明蘇云金桿菌含有伴胞晶體(ParasporalCrystal)，但未曾說明蘇云金桿菌的孢晶體有殺蟲作用。Berliner所定名的蘇云金桿菌按現(xiàn)在的分類系統(tǒng)，應(yīng)該是蘇云金桿菌蘇云金變種(B.thuringiensisVar.thuringiensis)，屬血清型１。第9頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月

從1920年到1950年這一段時期內(nèi)，有許多人曾用蘇云金桿菌進行防治害蟲的田間試驗。到了50年代才發(fā)現(xiàn)蘇云金桿菌殺蟲的活性。

1956年Angus證實殺蟲活性物質(zhì)位于伴孢晶體之中。他將伴孢晶體與孢子分開之后，單獨伴孢晶體仍然存在殺蟲活性。經(jīng)過多次反復(fù)研究，有關(guān)科學(xué)家都認識蘇云金桿菌的殺蟲譜主要是鱗翅目昆蟲幼蟲，部分菌株對雙翅目或鞘翅目昆蟲幼蟲有毒性，還有一些菌株或亞種的毒力還未得到證明。但鱗翅目昆蟲中對此病原體也并非具有同樣的敏感性，宿主昆蟲不同，蘇云金桿菌變種品系不同，試驗條件不同等因素，所得的結(jié)果不一。第10頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月1957年，美國商品制劑Thuricide出現(xiàn)，蘇云金桿菌的使用范圍和面積得到很快的擴大

第11頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月在世界各地及我國許多地方陸續(xù)分離到蘇云金桿菌的新亞種，目前已知的有45個血清型約60個亞種。由于蘇云金桿菌及其亞種作為細菌農(nóng)藥而被重視和廣泛研究。卒倒桿菌有營養(yǎng)菌體、孢子囊及芽孢等幾種形態(tài)，能產(chǎn)生α、β、γ—外毒素及δ—內(nèi)毒素等多種毒素。第12頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月2、形態(tài)和生物學(xué)特性

三個發(fā)育階段

1．營養(yǎng)體呈桿狀，兩端鈍圓，較為粗壯，與蠟質(zhì)桿菌近似，營養(yǎng)體在芽孢出現(xiàn)前先停止繁殖，細胞質(zhì)濃縮，出現(xiàn)液泡和微粒，并逐漸形成芽孢和伴孢晶體。此時繁殖快、代謝旺盛，適于用作接種材料。第13頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月第14頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月2．芽孢囊當菌體成長老熟時，其一端斜生一個橢圓形的芽孢，另一端同時出現(xiàn)菱形(或其他形狀)的晶體即伴孢晶體,此時為芽孢囊階段。

3．芽孢和伴孢晶體的釋放芽孢囊到一定時間后破裂，釋放出游離的芽孢和伴孢晶體。

能產(chǎn)生伴孢晶體并對某些昆蟲有毒是蘇云金桿菌區(qū)別于蠟質(zhì)桿菌的主要特征。

第15頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月蘇云金桿菌的生理生化反應(yīng)是:引起牛乳凝固，在葡萄糖、果糖、甘油、可溶性淀粉麥芽糖、海藻二糖中產(chǎn)酸，不產(chǎn)生吲哚，對甲基紅正反應(yīng)，乙酰甲基甲醇(V-P反應(yīng))正反應(yīng)(多數(shù)變種)，還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，不還原硫酸鹽為硫化物，磷酸脂酶產(chǎn)生無紅色顆粒出現(xiàn)。

第16頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月病原的幾種形態(tài)（一）營養(yǎng)菌體桿狀，端部圓形。大小為2.2~4.0×1.0~1.3μm。周生鞭毛，鞭毛有特異抗原性，可作為血清型分類的依據(jù)。以二裂法繁殖，往往多個菌體連成鏈狀。革蘭氏呈陽性反應(yīng)。在平面培養(yǎng)基上形成圓形菌落，邊緣整齊，乳白色，有光澤。生長最適溫度為28—32℃，高限40—45℃，低限10—15℃，適宜于中性ph范圍。能利用葡萄糖、海藻糖等作碳源，并能產(chǎn)生酸；能使牛乳凝固及明膠分解；具γ—外毒素使卵黃瓊脂培養(yǎng)基液化。根據(jù)其生理生化反應(yīng)可作為分類和識別亞種的依據(jù)。第17頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）孢子囊營養(yǎng)菌體生長到一定時間后，受營養(yǎng)或環(huán)境因素的影響，能形成孢子囊。此時，發(fā)生許多細胞學(xué)和生物化學(xué)的變化，菌體先合成孢外酶（即γ—外毒素），分泌于菌體外，可能有助于菌體分解和吸收某些形成孢子囊所必須的物質(zhì)。其后，在孢子囊的一端形成芽孢。同時，在另一端形成蛋白結(jié)晶，叫伴孢晶體（即δ—內(nèi)毒素）。不久，孢子囊溶解而將它們釋放出來。和伴孢晶體形成期細菌形態(tài)所發(fā)生的變化可劃分為如下幾個階段：首先是兩個染色質(zhì)凝集和形成相當寬的軸絲，位于細胞中央（Ⅰ），接著染色軸絲分離，其中之一移至細胞的一端，在中體的參與下發(fā)生細胞膜陷入，完成前芽孢隔膜（Ⅱ）。前芽孢隔膜延伸將芽孢包圍，芽孢從母細胞質(zhì)中游離出來（Ⅲ）。其后，在芽孢周圍形成皮層、孢子殼及外膜，芽孢成熟（Ⅳ—Ⅵ）。在第Ⅲ期的初期，于細胞的另一端開始形成蛋白結(jié)晶，即伴孢晶體，并逐漸增大，在前芽孢游離時期接近成熟。伴孢晶體和芽孢成熟后，孢子囊溶解而將它們釋放出來。第18頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月（三）芽孢是菌體的休眠階段，呈圓筒形或卵圓形，大小為1.5×1.0μm。有折光性，不易著色，能抵抗不良環(huán)境，在干燥、高溫或低溫冷凍條件下，能保持相當長時間的活力，遇到適宜條件時即會發(fā)芽成為營養(yǎng)菌體。第19頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月（四）毒素蘇云金桿菌在其生長發(fā)育過程中能產(chǎn)生多種對昆蟲有致病力的毒素，一類為內(nèi)毒素，另一類為外毒素。第20頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月內(nèi)毒素

又稱δ—內(nèi)毒素、晶體毒素、伴孢晶體、蘇云金桿菌蛋白（Bttoicprotein）或殺蟲晶體蛋白（InsecticidalCrystalproteins即ICPs）。這是在芽孢形成的同時，在其營養(yǎng)菌體的另一端合成一種或幾種殺蟲晶體蛋白（ICPs）組成的伴孢晶體。伴孢晶體的形態(tài)有菱形、球形、立方形、不規(guī)則形和鑲嵌形等多種形態(tài)，以菱形較為常見。不同亞種的菌株，晶體形態(tài)不盡相同，菱形晶體的大小為1－2×0.5um。電子顯微鏡觀察菱形晶體是一個八面包封的雙錐體，表面有粗糙的平衡的條紋，條紋間的距離為26nm，亞單位呈桿狀或啞鈴狀，大小為5.0×15.5nm，具有含硅的骨架。不溶于水及丙酮、三氯甲烷、乙醚、苯等有機溶劑，對酸穩(wěn)定，但能溶于堿性溶液，家蠶的堿性胃液可將之溶解。三氯醋酸、氯化汞等常用蛋白質(zhì)沉淀劑，可使晶體和溶解了的晶體蛋白質(zhì)失活。晶體毒素在廣泛的pH值范圍內(nèi)穩(wěn)定，卒倒亞種晶體毒素在pH11－12氫氧化鈉→pH4－4.5醋酸緩沖液中穩(wěn)定，在pH3.3以下失去活性，對熱有一定的穩(wěn)定性，在6.5℃可保持1hr，80℃處理20min也不致破壞。伴孢晶體由18種氨基酸組成。第21頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月

據(jù)報道，可把晶體蛋白分:對鱗翅目有活性的CryⅠ類對鱗翅目和雙翅目有活性的CryⅡ類對鞘翅目有活性的CryⅢ類對雙翅目有活性的CryⅣ類對鱗翅目和鞘翅目有活性的CryⅤ類對雙翅目昆蟲有毒性且對無脊椎動物和脊椎動物具有明顯溶細胞作用的Cyt類等六大類若干亞類，

其編碼基因也相應(yīng)分為6類若干單元。不同亞種的伴孢晶體，對家蠶的毒性不同，如蘇云金桿菌亞種中，卒倒亞種和殺蟲亞種的伴孢晶體，經(jīng)口添食五齡家蠶的ED50分別為每克體重26，0.02。第22頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月外毒素

外毒素是菌體在其生長過程中分泌于細胞外的代謝產(chǎn)物，已發(fā)現(xiàn)的主要有以下幾種：（1）α-外毒素是一種可溶性酶類，即磷脂酶C。這種毒素能夠影響到許多細胞，首先影響到磷脂膜，造成細胞的破裂或壞死，使昆蟲腸道中的細菌易于進入體腔，從而破壞了宿主昆蟲的正常防御機制。磷脂酶作用的最適pH是6.6～7.4，與葉蜂消化道內(nèi)的pH基本一致，因而對葉蜂有明顯的致病作用。提純后接種于家蠶不會引起中毒。第23頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月（2）β-外毒素亦稱蘇云金素，又稱熱穩(wěn)定外毒素，經(jīng)120℃處理10min仍不會破壞。對直翅目、等翅目、鱗翅目、半翅目、膜翅目和雙翅目等6種昆蟲、數(shù)種螨類和絨蟲具有毒殺作用。（3）γ-外毒素是一種未經(jīng)鑒定的酶類，能使卵黃瓊脂澄清，其毒力尚未證實，但對蠶無毒。（4）不穩(wěn)定外毒素對葉蜂科幼蟲有毒性。毒性物質(zhì)很不穩(wěn)定，對空氣、陽光、氧（較高的）、溫度（60℃以上經(jīng)10～15min）敏感而易遭到破壞，所以叫不穩(wěn)定外毒素。毒素含有17種氨基酸；由一或數(shù)個低分子量肽鏈所組成。第24頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月（5）水溶性毒素用一定劑量處理家蠶，在3hr內(nèi)家蠶中毒，停止進食，對外界刺激無反應(yīng)，表現(xiàn)麻痹虛弱，其癥狀與食下δ—內(nèi)毒素中毒相似，但血清學(xué)研究證明它與δ—內(nèi)毒素沒有關(guān)系。（6）鼠因子外毒素不耐熱，具有蛋白質(zhì)性質(zhì)，對小鼠和幾種鱗翅目昆蟲有較強的毒性，致死劑量的毒素可以使小鼠延緩生長或延長發(fā)育期。第25頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月病癥

本病是桑蠶食下蘇云金桿菌及其變種所產(chǎn)生的毒素而引起的，以大蠶期發(fā)病較多。因蠶兒食下晶體毒素量的多少，而分為急性中毒和慢性中毒兩種。急性中毒：蠶食下大量毒素后，經(jīng)數(shù)十分鐘乃至數(shù)小時內(nèi)中毒死亡。往往前期癥狀不易被察覺而表現(xiàn)為突然停止食桑，前半身抬起（抬胸），胸部略膨脹（胸腫），呈苦悶狀，有痙攣性顫動并伴有吐液，全身麻痹，腹腳失去抓著力而側(cè)倒卒斃，卒倒病即由此而來。初死時體色尚無變化，手觸尸體有硬塊，后部空虛，有輕度尸僵現(xiàn)象，頭部縮入呈勾嘴狀，多數(shù)第1－2腹節(jié)略伸長。從癥狀出現(xiàn)到死亡時間，亦以食下毒素多少為轉(zhuǎn)移，快者30分鐘，慢者3-4小時，死后一天左右，從第1、2腹節(jié)開始變黑腐爛，很快擴展人軀，終于腐敗液化。第26頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月

慢性中毒：蠶食下亞致死劑量毒素時，呈慢性中毒。初期表現(xiàn)為食欲減退，從少食桑葉到食桑停止，體軀生長極度遲緩，體色較暗，頭胸稍腫，并有縮皺，漸而全身萎縮。小腸以下空虛，排不正形糞，有時排出紅褐色污液。瀕死時，體色暗黃，間有吐液，肌肉松弛，麻痹，背管搏動緩慢，匍伏于桑葉面上，手觸蠶體柔軟，倒臥而死。本病蠶的尸體初呈現(xiàn)水漬狀病斑，漸次變褐而腐爛，流出黑褐色污液。如果蠶食下臨界亞致死劑量毒素時，也會表現(xiàn)中毒癥狀：突然停止食桑，有輕微的痙攣性顫動，上半身空虛，行動呆滯，但經(jīng)過一段時間病理反應(yīng)后，可恢復(fù)食桑，體色也會漸次恢復(fù)正常，但此后體軀瘦長，發(fā)育明顯比正常蠶慢，入眠及上簇均比正常蠶推遲1—3天，但最終蠶體發(fā)育和繭質(zhì)與正常蠶無大差異第27頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月第28頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月病變及致病過程δ-內(nèi)毒素作為伴孢晶體亞單位存在時是無毒的，經(jīng)溶解或蛋白酶水解時才變成有毒的多肽。伴孢晶體被桑蠶食下后，在中腸被強堿性的胃液溶解，釋放出13000～145000Da的晶體蛋白，再被蛋白酶水解而激活，被激活的毒素分子量為50000-70000Da。蛋白酶水解激活的過程包括去掉原毒素的C-末端部分。用3H-亮氨酸標記的δ-內(nèi)毒素添食于桑蠶，僅5min即可在血液中檢測到放射性的毒素碎片，說明伴孢晶體在蠶消化道中溶解、分解和吸收都是十分迅速的。第29頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月δ-內(nèi)毒素引起蠶體生理病理變化主要是：δ-內(nèi)毒素進入中腸被溶解和激活后，首先結(jié)合到靶細胞上的膜受體，然后毒素分子進入膜內(nèi)，在膜上產(chǎn)生小孔，小孔半徑為0.6-0.1nm，形成滲透通道，最終導(dǎo)致膜的膠樣滲透溶解，細胞因膠樣滲透平衡的破壞而死亡。有研究認為，鱗翅目幼蟲細胞膜上的受體是高度專一的糖蛋白。第30頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月蘇云金桿菌的生產(chǎn)

蘇云金桿菌的生產(chǎn)方式有兩種，即液體法和固體法，目前大部分是采用液態(tài)深層發(fā)酵，工藝成本高，投資強度較大。采用固體發(fā)酵，不僅可以降低生產(chǎn)成本，提高產(chǎn)品的毒殺效果，而且方法容易掌握，產(chǎn)品易儲存、好運輸。第31頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月一、液體深層發(fā)酵蘇云金桿菌類生產(chǎn)工藝及培養(yǎng)基配方雖可有異，但生產(chǎn)過程基本上是相似的。武漢微生物農(nóng)藥廠生產(chǎn)青蟲菌(蠟螟變種)的工藝方法大致如下。砂土管菌種——→茄瓶斜面——→無菌空氣種子罐培養(yǎng)基——→發(fā)酵罐——→發(fā)酵液——→填充罐輕質(zhì)碳酸鈣——→過濾濾液棄去——→調(diào)漿罐濾餅——→

菌漿加展著劑噴霧干燥菌粉質(zhì)量檢查成品第32頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月種子罐培養(yǎng)是為擴大生產(chǎn)繁殖足夠數(shù)量的健壯而純潔的種子

發(fā)酵罐培養(yǎng)是細菌大量繁殖并形成芽孢和晶體的階段

第33頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月二、半固體發(fā)酵蘇云金桿菌類半固體發(fā)酵目前常用的方法有三級擴大培養(yǎng)和一步擴大培養(yǎng)等。(一)三級擴大培養(yǎng)生產(chǎn)工藝流程砂土管菌種——→斜面菌種——→液體種子——→擴大培養(yǎng)——→半固體淺盤培養(yǎng)——→干燥粉碎包裝。

第34頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月(二)一步擴大培養(yǎng)采用半固體淺盤發(fā)酵，但以工業(yè)生產(chǎn)的菌粉作為種子，省略了斜面菌種和種子擴大培養(yǎng)兩個步驟。將滅菌過的半固體培養(yǎng)基倒在消毒過的塑料薄膜上，用質(zhì)量高的工業(yè)菌粉(每克含活芽孢100億)按配料干重的1％量搶溫接種(培養(yǎng)基溫度可在80℃)，拌勻后用塑料薄膜包起熱悶10分鐘，以達減少雜菌和催芽目的。然后打開塑料膜攤放在淺盤上培養(yǎng)。其他步驟與三級擴大培養(yǎng)法同。

第35頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月三、細菌性中毒病發(fā)病規(guī)律

卒倒桿菌及毒素通過污染桑葉，經(jīng)口食下傳染。而高溫多濕的條件，有利于病原細菌的傳播與蔓延。第36頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月（一）傳染來源卒倒桿菌是兼性寄生菌，除可寄生于活體外，還可在死體及腐殖質(zhì)上大量繁殖，而且可以廣泛存在于土壤及水等場所中。主要傳染來源有桑園害蟲如桑尺蠖、桑盜毒蛾（桑毛蟲）、桑螟、桑蟥及其他野外昆蟲均可感染卒倒桿菌，其排泄物及尸體均能污染桑葉而傳染蠶；蠶沙處理不當或水源不潔，患本病的蠶尸體及排泄物散落在蠶室、蠶具或用作地面育的表土上，都可引起感染；與蠶區(qū)相間的棉田或稻田施用細菌農(nóng)藥（如青蟲菌、殺螟桿菌等）而處理不當，或把施用過細菌農(nóng)藥的稻草挪作養(yǎng)蠶用時，將是直接引起本病的主要原因。第37頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）蠶座內(nèi)傳染病蠶排泄物及尸體流出的污液是蠶座傳染的主要來源。蠶食下卒倒桿菌的菌體及毒素引起急性中