微生物檢測技術

作物生產(chǎn)技術專業(yè)/教學資源庫微生物檢測技術

新疆農(nóng)業(yè)職業(yè)技術學院韓陽花

一切肉眼看不見或看不清的微小生物，個體微小，結(jié)構(gòu)簡單，通常要用光學顯微鏡和電子顯微鏡才能看清楚的生物，統(tǒng)稱為微生物。微生物的定義。細菌A微生物的分類霉菌B酵母菌C病毒

D細菌菌落總數(shù)大腸菌群數(shù)致病菌食品的微生物學指標PART1細菌菌落總數(shù)菌落總數(shù)的概念

菌落總數(shù)就是指在一定條件下（如需氧情況、營養(yǎng)條件、pH、培養(yǎng)溫度和時間等）每克（每毫升）檢樣所生長出來的細菌菌落總數(shù)。菌落總數(shù)

按國家標準方法規(guī)定，即在需氧情況下，37℃培養(yǎng)48h，能在普通營養(yǎng)瓊脂平板上生長的細菌菌落總數(shù)，所以厭氧或微需氧菌、有特殊營養(yǎng)要求的以及非嗜中溫的細菌，由于現(xiàn)有條件不能滿足其生理需求，故難以繁殖生長。因此菌落總數(shù)并不表示實際中的所有細菌總數(shù)，菌落總數(shù)并不能區(qū)分其中細菌的種類，所以有時被稱為雜菌數(shù)，需氧菌數(shù)等。菌落總數(shù)測定是用來判定食品被細菌污染的程度及衛(wèi)生質(zhì)量

反映食品在生產(chǎn)過程中是否符合衛(wèi)生要求，以便對被檢樣品做出適當?shù)男l(wèi)生學評價。菌落總數(shù)的多少在一定程度上標志著食品衛(wèi)生質(zhì)量的優(yōu)劣。觀察細菌在食品中繁殖的動態(tài)。

以便對被檢樣品進行衛(wèi)生學評價時提供依據(jù)。菌落總數(shù)測定的衛(wèi)生學意義細菌總數(shù)的檢驗程序操作方法樣品的處理和稀釋

以無菌操作取檢樣25g（或25ml)，放于225mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的滅菌玻璃瓶內(nèi)（瓶內(nèi)預置適當數(shù)量的玻璃珠)或滅菌乳缽內(nèi)，經(jīng)充分振要或研磨制成1：10的均勻稀釋液。固體檢樣在加入稀釋液后，最好置滅菌均質(zhì)器中以8000~10000r/min的速度處理1min，制成1：10的均勻稀釋液。用1ml滅菌吸管吸取1：10稀釋液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml滅菌生理鹽水或其他稀釋液的試管內(nèi)，振搖試管混合均勻，制成1：100的稀釋液。另取1ml滅菌吸管，按上項操作順序，制10倍遞增稀釋液，如此每遞增稀釋一次即換用1支1ml滅菌吸管。樣品的處理和稀釋無菌操作樣品的處理和稀釋

操作中必須有“無菌操作”的概念，所用玻璃器皿必須是完全滅菌的，不得殘留有細菌或抑菌物質(zhì)。所用剪刀、鑷子等器具也必須進行消毒處理。樣品如果有包裝，應用75%乙醇在包裝開口處擦拭后取樣。操作應當在超凈工作臺或經(jīng)過消毒處理的無菌室進行。瓊脂平板在工作臺暴露15分鐘，每個平板不得超過15個菌落。采樣的代表性

如系固體樣品，取樣時不應集中一點，宜多采幾個部位。固體樣品必須經(jīng)過均質(zhì)或研磨，液體樣品須經(jīng)過振搖，以獲得均勻稀釋液。樣品稀釋誤差

為減少樣品稀釋誤差，在連續(xù)遞次稀釋時，每一稀釋液應充分振搖，使其均勻，同時每一稀釋度應更換一支吸管。在進行連續(xù)稀釋時，應將吸管內(nèi)液體沿管壁流入，勿使吸管尖端伸入稀釋液內(nèi)，以免吸管外部粘附的檢液溶于其內(nèi)。樣品的處理和稀釋稀釋液

樣品稀釋液主要是滅菌生理鹽水，有的采用磷酸鹽緩沖液（或0.1％蛋白胨水），后者對食品已受損傷的細菌細胞有一定的保護作用。如對含鹽量較高的食品（如醬油）進行稀釋，可以采用滅菌蒸餾水。操作方法傾注培養(yǎng)

根據(jù)標準要求或?qū)ξ廴厩闆r的估計，選擇2~3個適宜稀釋度，分別在制10倍遞增稀釋的同時，以吸取該稀釋度的吸管移取1ml稀釋液于滅菌平皿中，每個稀釋度做兩個平皿。將涼至46℃營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基注入平皿約15ml，并轉(zhuǎn)動平皿，混合均勻。同時將營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾入加有1ml稀釋液（不含樣品）的滅菌平皿內(nèi)作空白對照。待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平板，置36±1℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)48±2h，取出計算平板內(nèi)菌落數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù)，即得每克（每毫升）樣品所含菌落總數(shù)。注意事項傾注培養(yǎng)

傾注用培養(yǎng)基應在46℃水浴內(nèi)保溫，溫度過高會影響細菌生長，過低瓊脂易于凝因而不能與菌液充分混勻。如無水浴，應以皮膚感受較熱而不燙為宜。傾注培養(yǎng)基的量規(guī)定不一，從12~20ml不等，一般以15ml較為適宜，平板過厚可影響觀察，太薄又易于干裂。傾注時，培基底部如有沉淀物，應將底部棄去，以免與菌落混淆而影響計數(shù)觀察。注意事項傾注培養(yǎng)

為使菌落能在平板上均勻分布，檢液加入平皿后，應盡快傾注培養(yǎng)基并旋轉(zhuǎn)混勻，可正反兩個方向旋轉(zhuǎn)，檢樣從開始稀釋到傾注最后一個平皿所用時間不宜超過20min，以防止細菌有所死亡或繁殖。培養(yǎng)溫度一般為37℃,培養(yǎng)時間一般為48h。培養(yǎng)箱應保持一定的濕度，瓊脂平板培養(yǎng)48h后，培養(yǎng)基失重不應超過15％。培養(yǎng)結(jié)果操作方法計數(shù)和報告

培養(yǎng)到時間后，計數(shù)每個平板上的菌落數(shù)?？捎萌庋塾^察，必要時用放大鏡檢查，以防遺漏。在記下各平板的菌落總數(shù)后，求出同稀釋度的各平板平均菌落數(shù)，計算處原始樣品中每克（或每ml）中的菌落數(shù)，進行報告。到達規(guī)定培養(yǎng)時間，應立即計數(shù)。如果不能立即計數(shù)，應將平板放置于0－4℃，但不得超過24h。

計數(shù)時應選取菌落數(shù)在30~300之間的平板，若有二個稀釋度均在30~300之間時，按國家標準方法要求應以二者比值決定，比值小于或等于2取平均數(shù)，比值大于2則其較小數(shù)字。01

若所有稀釋度均不在計數(shù)區(qū)間。如均大于300，則取最高稀釋度的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之。02

若所有稀釋度均不在計數(shù)區(qū)間，如均小于30，則以最低稀釋度的平均菌落數(shù)乘稀釋倍數(shù)報告之。03

如菌落數(shù)有的大于300，有的又小于30，但均不在30~300之間，則應以最接近300或30的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之。04菌落計數(shù)方法

如所有稀釋度均無菌落生長，則應按小于1乘以最低稀釋倍數(shù)報告之。04

不同稀釋度的菌落數(shù)應與稀釋倍數(shù)成反比，即稀釋倍數(shù)愈高菌落數(shù)愈少，稀釋倍數(shù)愈低菌落數(shù)愈多。如出現(xiàn)逆反現(xiàn)象，則應視為檢驗中的差錯，不應作為檢樣計數(shù)報告的依據(jù)。05

當平板上有鏈狀菌落生長時，如呈鏈狀生長的菌落之間無任何明顯界限，則應作為一個菌落計，如存在有幾條不同來源的鏈，則每條鏈均應按一個菌落計算，不要把鏈上生長的每一個菌落分開計數(shù)。如有片狀菌落生長，該平板一般不宜采用，如片狀菌落不到平板一半，而另一半又分布均勻，則可以半個平板的菌落數(shù)乘2代表全平板的菌落數(shù)。06

當計數(shù)平板內(nèi)的菌落數(shù)過多，但分布很均勻，可取平板的一半或1/4計數(shù)。再乘以相應稀釋倍數(shù)作為該平板的菌落數(shù)。07菌落計數(shù)方法菌落數(shù)的報告計數(shù)和報告

國家標準方法規(guī)定菌落數(shù)在1~100時，按實有數(shù)字報告，如大于100時，則報告前面兩位有效數(shù)字，第三位數(shù)按四舍五入計算。固體檢樣以克（g)為單位報告，液體檢樣以毫升（ml）為單位報告，表面涂擦則以平方厘米（cm2）報告。

報告方式試樣例次稀釋液及菌落數(shù)兩稀釋液之比菌落總數(shù)報告方式10-110-210-31平均菌落數(shù)多不可計15420

2多不可計29546

3多不可計27160

4多不可計多不可計313

527115

6000

7多不可計30512

試樣例次稀釋液及菌落數(shù)兩稀釋液之比菌落總數(shù)報告方式10-110-210-31平均菌落數(shù)多不可計15420

164001.6×1042多不可計295461.6377503.8×1043多不可計271602.2271002.7×1044多不可計多不可計313

3130003.1×105527115

2702.7×1026000

＜1×10＜107多不可計30512

305003.1×104試樣例次稀釋液及菌落數(shù)兩稀釋液之比菌落總數(shù)報告方式10-110-210-31平均菌落數(shù)多不可計15420

164001.6×1042多不可計295461.6377503.8×1043多不可計271602.2271002.7×1044多不可計多不可計313

3130003.1×105527115

2702.7×1026000

＜1×10＜107多不可計30512

305003.1×104PART2大腸菌群概念大腸菌群

大腸菌群系指一群能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。大腸菌群主要包括腸桿菌科的大腸埃希氏菌屬、枸櫞酸菌屬、腸桿菌屬克雷伯氏菌屬的一部分細菌以及沙門氏菌屬第Ⅲ亞屬(能發(fā)酵乳糖)的細菌。大腸菌群MPN——為最可能數(shù)，是應用統(tǒng)計學原理和方法，根據(jù)試驗的陽性管數(shù)計算出樣品中大腸菌群的含量，報告出每100mL(g)大腸菌群的最可能數(shù)。

測定意義大腸菌群

由于大腸菌群作為糞便污染指標菌而被列入食品衛(wèi)生微生物學常規(guī)檢驗項目，如果食品中大腸菌群超過規(guī)定的限量，則表示該食品有被糞便污染的可能，而糞便如果是來自腸道致病菌者或者腹瀉患者，該食品即有可能污染腸道致病菌。所以，凡是大腸菌群數(shù)超過規(guī)定限量的食品，即可確定其衛(wèi)生學上是不合格的，該食品食用是不安全的。

大腸菌群的檢驗程序樣品的處理和稀釋大腸菌群的測定

以無菌操作取檢樣25g（或25ml)，放于225mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的滅菌玻璃瓶內(nèi)（瓶內(nèi)預置適當數(shù)量的玻璃珠)或滅菌乳缽內(nèi)，經(jīng)充分振要或研磨制成1：10的均勻稀釋液。固體檢樣在加入稀釋液后，最好置滅菌均質(zhì)器中以8000~10000r/min的速度處理1min，制成1：10的均勻稀釋液。用1ml滅菌吸管吸取1：10稀釋液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml滅菌生理鹽水或其他稀釋液的試管內(nèi)，振搖試管混合均勻，制成1：100的稀釋液。另取1ml滅菌吸管，按上項操作順序，制10倍遞增稀釋液，如此每遞增稀釋一次即換用1支1ml滅菌吸管。乳糖發(fā)酵試驗大腸菌群的測定

將待檢樣品接種于乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)，接種量在1mL以上者，用雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管，1mL及1mL以下者，用單料乳糖膽鹽發(fā)酵管。每一稀釋度接種3管，置36±1℃溫箱內(nèi)，培養(yǎng)24±2h，如所有乳糖膽鹽發(fā)酵管都不產(chǎn)氣，則可報告為大腸菌群陰性，如有產(chǎn)氣者，則按下列程序進行。初發(fā)酵試驗的結(jié)果初發(fā)酵試驗的結(jié)果分離培養(yǎng)大腸菌群的測定

將產(chǎn)氣的發(fā)酵管分別轉(zhuǎn)種在伊紅美藍瓊脂平板上，置36±1℃溫箱內(nèi)，培養(yǎng)18～24h，然后取出，觀察菌落形態(tài)，并做革蘭氏染色和證實試驗。分區(qū)劃線法劃下一個區(qū)前先滅菌接種環(huán)。A劃線時接種環(huán)同平板呈300～400角。B每次劃線應該壓到上一個區(qū)的2～3根線。C用接種環(huán)的“面”而不是“弧”在平板上滑動。D