微生物檢測(cè)技術(shù)

作物生產(chǎn)技術(shù)專(zhuān)業(yè)/教學(xué)資源庫(kù)微生物檢測(cè)技術(shù)

新疆農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院韓陽(yáng)花

一切肉眼看不見(jiàn)或看不清的微小生物，個(gè)體微小，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，通常要用光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡才能看清楚的生物，統(tǒng)稱(chēng)為微生物。微生物的定義。細(xì)菌A微生物的分類(lèi)霉菌B酵母菌C病毒

D細(xì)菌菌落總數(shù)大腸菌群數(shù)致病菌食品的微生物學(xué)指標(biāo)PART1細(xì)菌菌落總數(shù)菌落總數(shù)的概念

菌落總數(shù)就是指在一定條件下（如需氧情況、營(yíng)養(yǎng)條件、pH、培養(yǎng)溫度和時(shí)間等）每克（每毫升）檢樣所生長(zhǎng)出來(lái)的細(xì)菌菌落總數(shù)。菌落總數(shù)

按國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法規(guī)定，即在需氧情況下，37℃培養(yǎng)48h，能在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上生長(zhǎng)的細(xì)菌菌落總數(shù)，所以厭氧或微需氧菌、有特殊營(yíng)養(yǎng)要求的以及非嗜中溫的細(xì)菌，由于現(xiàn)有條件不能滿(mǎn)足其生理需求，故難以繁殖生長(zhǎng)。因此菌落總數(shù)并不表示實(shí)際中的所有細(xì)菌總數(shù)，菌落總數(shù)并不能區(qū)分其中細(xì)菌的種類(lèi)，所以有時(shí)被稱(chēng)為雜菌數(shù)，需氧菌數(shù)等。菌落總數(shù)測(cè)定是用來(lái)判定食品被細(xì)菌污染的程度及衛(wèi)生質(zhì)量

反映食品在生產(chǎn)過(guò)程中是否符合衛(wèi)生要求，以便對(duì)被檢樣品做出適當(dāng)?shù)男l(wèi)生學(xué)評(píng)價(jià)。菌落總數(shù)的多少在一定程度上標(biāo)志著食品衛(wèi)生質(zhì)量的優(yōu)劣。觀(guān)察細(xì)菌在食品中繁殖的動(dòng)態(tài)。

以便對(duì)被檢樣品進(jìn)行衛(wèi)生學(xué)評(píng)價(jià)時(shí)提供依據(jù)。菌落總數(shù)測(cè)定的衛(wèi)生學(xué)意義細(xì)菌總數(shù)的檢驗(yàn)程序操作方法樣品的處理和稀釋

以無(wú)菌操作取檢樣25g（或25ml)，放于225mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的滅菌玻璃瓶?jī)?nèi)（瓶?jī)?nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠)或滅菌乳缽內(nèi)，經(jīng)充分振要或研磨制成1：10的均勻稀釋液。固體檢樣在加入稀釋液后，最好置滅菌均質(zhì)器中以8000~10000r/min的速度處理1min，制成1：10的均勻稀釋液。用1ml滅菌吸管吸取1：10稀釋液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml滅菌生理鹽水或其他稀釋液的試管內(nèi)，振搖試管混合均勻，制成1：100的稀釋液。另取1ml滅菌吸管，按上項(xiàng)操作順序，制10倍遞增稀釋液，如此每遞增稀釋一次即換用1支1ml滅菌吸管。樣品的處理和稀釋無(wú)菌操作樣品的處理和稀釋

操作中必須有“無(wú)菌操作”的概念，所用玻璃器皿必須是完全滅菌的，不得殘留有細(xì)菌或抑菌物質(zhì)。所用剪刀、鑷子等器具也必須進(jìn)行消毒處理。樣品如果有包裝，應(yīng)用75%乙醇在包裝開(kāi)口處擦拭后取樣。操作應(yīng)當(dāng)在超凈工作臺(tái)或經(jīng)過(guò)消毒處理的無(wú)菌室進(jìn)行。瓊脂平板在工作臺(tái)暴露15分鐘，每個(gè)平板不得超過(guò)15個(gè)菌落。采樣的代表性

如系固體樣品，取樣時(shí)不應(yīng)集中一點(diǎn)，宜多采幾個(gè)部位。固體樣品必須經(jīng)過(guò)均質(zhì)或研磨，液體樣品須經(jīng)過(guò)振搖，以獲得均勻稀釋液。樣品稀釋誤差

為減少樣品稀釋誤差，在連續(xù)遞次稀釋時(shí)，每一稀釋液應(yīng)充分振搖，使其均勻，同時(shí)每一稀釋度應(yīng)更換一支吸管。在進(jìn)行連續(xù)稀釋時(shí)，應(yīng)將吸管內(nèi)液體沿管壁流入，勿使吸管尖端伸入稀釋液內(nèi)，以免吸管外部粘附的檢液溶于其內(nèi)。樣品的處理和稀釋稀釋液

樣品稀釋液主要是滅菌生理鹽水，有的采用磷酸鹽緩沖液（或0.1％蛋白胨水），后者對(duì)食品已受損傷的細(xì)菌細(xì)胞有一定的保護(hù)作用。如對(duì)含鹽量較高的食品（如醬油）進(jìn)行稀釋?zhuān)梢圆捎脺缇麴s水。操作方法傾注培養(yǎng)

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)ξ廴厩闆r的估計(jì)，選擇2~3個(gè)適宜稀釋度，分別在制10倍遞增稀釋的同時(shí)，以吸取該稀釋度的吸管移取1ml稀釋液于滅菌平皿中，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平皿。將涼至46℃營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基注入平皿約15ml，并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿，混合均勻。同時(shí)將營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾入加有1ml稀釋液（不含樣品）的滅菌平皿內(nèi)作空白對(duì)照。待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平板，置36±1℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)48±2h，取出計(jì)算平板內(nèi)菌落數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù)，即得每克（每毫升）樣品所含菌落總數(shù)。注意事項(xiàng)傾注培養(yǎng)

傾注用培養(yǎng)基應(yīng)在46℃水浴內(nèi)保溫，溫度過(guò)高會(huì)影響細(xì)菌生長(zhǎng)，過(guò)低瓊脂易于凝因而不能與菌液充分混勻。如無(wú)水浴，應(yīng)以皮膚感受較熱而不燙為宜。傾注培養(yǎng)基的量規(guī)定不一，從12~20ml不等，一般以15ml較為適宜，平板過(guò)厚可影響觀(guān)察，太薄又易于干裂。傾注時(shí)，培基底部如有沉淀物，應(yīng)將底部棄去，以免與菌落混淆而影響計(jì)數(shù)觀(guān)察。注意事項(xiàng)傾注培養(yǎng)

為使菌落能在平板上均勻分布，檢液加入平皿后，應(yīng)盡快傾注培養(yǎng)基并旋轉(zhuǎn)混勻，可正反兩個(gè)方向旋轉(zhuǎn)，檢樣從開(kāi)始稀釋到傾注最后一個(gè)平皿所用時(shí)間不宜超過(guò)20min，以防止細(xì)菌有所死亡或繁殖。培養(yǎng)溫度一般為37℃,培養(yǎng)時(shí)間一般為48h。培養(yǎng)箱應(yīng)保持一定的濕度，瓊脂平板培養(yǎng)48h后，培養(yǎng)基失重不應(yīng)超過(guò)15％。培養(yǎng)結(jié)果操作方法計(jì)數(shù)和報(bào)告

培養(yǎng)到時(shí)間后，計(jì)數(shù)每個(gè)平板上的菌落數(shù)?？捎萌庋塾^(guān)察，必要時(shí)用放大鏡檢查，以防遺漏。在記下各平板的菌落總數(shù)后，求出同稀釋度的各平板平均菌落數(shù)，計(jì)算處原始樣品中每克（或每ml）中的菌落數(shù)，進(jìn)行報(bào)告。到達(dá)規(guī)定培養(yǎng)時(shí)間，應(yīng)立即計(jì)數(shù)。如果不能立即計(jì)數(shù)，應(yīng)將平板放置于0－4℃，但不得超過(guò)24h。

計(jì)數(shù)時(shí)應(yīng)選取菌落數(shù)在30~300之間的平板，若有二個(gè)稀釋度均在30~300之間時(shí)，按國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法要求應(yīng)以二者比值決定，比值小于或等于2取平均數(shù)，比值大于2則其較小數(shù)字。01

若所有稀釋度均不在計(jì)數(shù)區(qū)間。如均大于300，則取最高稀釋度的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之。02

若所有稀釋度均不在計(jì)數(shù)區(qū)間，如均小于30，則以最低稀釋度的平均菌落數(shù)乘稀釋倍數(shù)報(bào)告之。03

如菌落數(shù)有的大于300，有的又小于30，但均不在30~300之間，則應(yīng)以最接近300或30的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之。04菌落計(jì)數(shù)方法

如所有稀釋度均無(wú)菌落生長(zhǎng)，則應(yīng)按小于1乘以最低稀釋倍數(shù)報(bào)告之。04

不同稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)與稀釋倍數(shù)成反比，即稀釋倍數(shù)愈高菌落數(shù)愈少，稀釋倍數(shù)愈低菌落數(shù)愈多。如出現(xiàn)逆反現(xiàn)象，則應(yīng)視為檢驗(yàn)中的差錯(cuò)，不應(yīng)作為檢樣計(jì)數(shù)報(bào)告的依據(jù)。05

當(dāng)平板上有鏈狀菌落生長(zhǎng)時(shí)，如呈鏈狀生長(zhǎng)的菌落之間無(wú)任何明顯界限，則應(yīng)作為一個(gè)菌落計(jì)，如存在有幾條不同來(lái)源的鏈，則每條鏈均應(yīng)按一個(gè)菌落計(jì)算，不要把鏈上生長(zhǎng)的每一個(gè)菌落分開(kāi)計(jì)數(shù)。如有片狀菌落生長(zhǎng)，該平板一般不宜采用，如片狀菌落不到平板一半，而另一半又分布均勻，則可以半個(gè)平板的菌落數(shù)乘2代表全平板的菌落數(shù)。06

當(dāng)計(jì)數(shù)平板內(nèi)的菌落數(shù)過(guò)多，但分布很均勻，可取平板的一半或1/4計(jì)數(shù)。再乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)作為該平板的菌落數(shù)。07菌落計(jì)數(shù)方法菌落數(shù)的報(bào)告計(jì)數(shù)和報(bào)告

國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法規(guī)定菌落數(shù)在1~100時(shí)，按實(shí)有數(shù)字報(bào)告，如大于100時(shí)，則報(bào)告前面兩位有效數(shù)字，第三位數(shù)按四舍五入計(jì)算。固體檢樣以克（g)為單位報(bào)告，液體檢樣以毫升（ml）為單位報(bào)告，表面涂擦則以平方厘米（cm2）報(bào)告。

報(bào)告方式試樣例次稀釋液及菌落數(shù)兩稀釋液之比菌落總數(shù)報(bào)告方式10-110-210-31平均菌落數(shù)多不可計(jì)15420

2多不可計(jì)29546

3多不可計(jì)27160

4多不可計(jì)多不可計(jì)313

527115

6000

7多不可計(jì)30512

試樣例次稀釋液及菌落數(shù)兩稀釋液之比菌落總數(shù)報(bào)告方式10-110-210-31平均菌落數(shù)多不可計(jì)15420

164001.6×1042多不可計(jì)295461.6377503.8×1043多不可計(jì)271602.2271002.7×1044多不可計(jì)多不可計(jì)313

3130003.1×105527115

2702.7×1026000

＜1×10＜107多不可計(jì)30512

305003.1×104試樣例次稀釋液及菌落數(shù)兩稀釋液之比菌落總數(shù)報(bào)告方式10-110-210-31平均菌落數(shù)多不可計(jì)15420

164001.6×1042多不可計(jì)295461.6377503.8×1043多不可計(jì)271602.2271002.7×1044多不可計(jì)多不可計(jì)313

3130003.1×105527115

2702.7×1026000

＜1×10＜107多不可計(jì)30512

305003.1×104PART2大腸菌群概念大腸菌群

大腸菌群系指一群能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無(wú)芽胞桿菌。大腸菌群主要包括腸桿菌科的大腸埃希氏菌屬、枸櫞酸菌屬、腸桿菌屬克雷伯氏菌屬的一部分細(xì)菌以及沙門(mén)氏菌屬第Ⅲ亞屬(能發(fā)酵乳糖)的細(xì)菌。大腸菌群MPN——為最可能數(shù)，是應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)原理和方法，根據(jù)試驗(yàn)的陽(yáng)性管數(shù)計(jì)算出樣品中大腸菌群的含量，報(bào)告出每100mL(g)大腸菌群的最可能數(shù)。

測(cè)定意義大腸菌群

由于大腸菌群作為糞便污染指標(biāo)菌而被列入食品衛(wèi)生微生物學(xué)常規(guī)檢驗(yàn)項(xiàng)目，如果食品中大腸菌群超過(guò)規(guī)定的限量，則表示該食品有被糞便污染的可能，而糞便如果是來(lái)自腸道致病菌者或者腹瀉患者，該食品即有可能污染腸道致病菌。所以，凡是大腸菌群數(shù)超過(guò)規(guī)定限量的食品，即可確定其衛(wèi)生學(xué)上是不合格的，該食品食用是不安全的。

大腸菌群的檢驗(yàn)程序樣品的處理和稀釋大腸菌群的測(cè)定

以無(wú)菌操作取檢樣25g（或25ml)，放于225mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的滅菌玻璃瓶?jī)?nèi)（瓶?jī)?nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠)或滅菌乳缽內(nèi)，經(jīng)充分振要或研磨制成1：10的均勻稀釋液。固體檢樣在加入稀釋液后，最好置滅菌均質(zhì)器中以8000~10000r/min的速度處理1min，制成1：10的均勻稀釋液。用1ml滅菌吸管吸取1：10稀釋液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml滅菌生理鹽水或其他稀釋液的試管內(nèi)，振搖試管混合均勻，制成1：100的稀釋液。另取1ml滅菌吸管，按上項(xiàng)操作順序，制10倍遞增稀釋液，如此每遞增稀釋一次即換用1支1ml滅菌吸管。乳糖發(fā)酵試驗(yàn)大腸菌群的測(cè)定

將待檢樣品接種于乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)，接種量在1mL以上者，用雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管，1mL及1mL以下者，用單料乳糖膽鹽發(fā)酵管。每一稀釋度接種3管，置36±1℃溫箱內(nèi)，培養(yǎng)24±2h，如所有乳糖膽鹽發(fā)酵管都不產(chǎn)氣，則可報(bào)告為大腸菌群陰性，如有產(chǎn)氣者，則按下列程序進(jìn)行。初發(fā)酵試驗(yàn)的結(jié)果初發(fā)酵試驗(yàn)的結(jié)果分離培養(yǎng)大腸菌群的測(cè)定

將產(chǎn)氣的發(fā)酵管分別轉(zhuǎn)種在伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，置36±1℃溫箱內(nèi)，培養(yǎng)18～24h，然后取出，觀(guān)察菌落形態(tài)，并做革蘭氏染色和證實(shí)試驗(yàn)。分區(qū)劃線(xiàn)法劃下一個(gè)區(qū)前先滅菌接種環(huán)。A劃線(xiàn)時(shí)接種環(huán)同平板呈300～400角。B每次劃線(xiàn)應(yīng)該壓到上一個(gè)區(qū)的2～3根線(xiàn)。C用接種環(huán)的“面”而不是“弧”在平板上滑動(dòng)。D