PCR技術上崗培訓演示文稿

PCR技術上崗培訓演示文稿目前一頁\總數(shù)二十八頁\編于十五點優(yōu)選PCR技術上崗培訓ppt目前二頁\總數(shù)二十八頁\編于十五點疾病的診斷分子診斷影象學診斷細胞/組織診斷

臨

床

診

斷免疫診斷生化診斷目前三頁\總數(shù)二十八頁\編于十五點幾乎所有的疾病都是基因病科學研究已證明，基因可以揭示疾病的本質，人類幾乎所有疾病都直接或間接與基因有關，在某種意義上都是基因病，目前四頁\總數(shù)二十八頁\編于十五點目前五頁\總數(shù)二十八頁\編于十五點目前六頁\總數(shù)二十八頁\編于十五點目前七頁\總數(shù)二十八頁\編于十五點PCR技術1985年美國人莫里斯（KaryMullis）發(fā)明了一種模擬DNA體內復制過程，在體外復制特定DNA片段的方法，并將其命名為聚合酶鏈式反應（PolymeraseChainReaction，PCR）。PCR可以在短時間內倍增極微量DNA（理論上說,僅有一個足夠了）至百萬或十億倍，通過PCR可以簡便、快速地從微量生物材料中獲得大量特定的核酸，并具有很高的靈敏度和特異性，可用于微量核酸樣品的檢測。目前八頁\總數(shù)二十八頁\編于十五點PCR技術PCR技術被科學界譽為生物技術領域最偉大的發(fā)明之一，美國人莫里斯在發(fā)明該技術不久就因此于1993年獲得諾貝爾化學獎。PCR及其相關技術于80年代末在國外開始應用：歐共體（現(xiàn)歐盟）、日本、美國相繼把PCR這一基因診斷核心技術列入獻血員篩查，美國食物與藥品管理局已批準了60多種基因診斷試劑用于臨床，美國國家疾病控制中心已把PCR技術列入疾病診斷的常規(guī)技術。目前九頁\總數(shù)二十八頁\編于十五點目前十頁\總數(shù)二十八頁\編于十五點

1.DNA變性（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA

2.退火（25℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結合，形成局部雙鏈。

3.延伸（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右最佳的活性）的作用下，以dNTP為原料，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補的DNA鏈。

每一循環(huán)經(jīng)過變性、退火和延伸，DNA含量既增加一倍。標準的PCR過程分為三步目前十一頁\總數(shù)二十八頁\編于十五點熒光PCR檢測技術是在傳統(tǒng)PCR技術基礎上，加入熒光標記的基因探針，通過探針與擴增產(chǎn)物的結合釋放出熒光信號，再通過專門的儀器（熒光PCR儀）對熒光信號的實時檢測，經(jīng)過電腦分析以后，可以準確計算出目的基因的初始數(shù)量，實現(xiàn)定量檢測。與傳統(tǒng)PCR檢測相比，熒光PCR檢測技術不僅實現(xiàn)了PCR檢測從定性到定量的飛躍，而且它具有特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點。因此，熒光PCR檢測技術自二十世紀九十年代中期出現(xiàn)以來，已成為最具代表性的PCR檢測技術，為PCR檢測技術臨床應用打開了方便之門，現(xiàn)已得到廣泛應用。

熒光PCR檢測技術簡介

目前十二頁\總數(shù)二十八頁\編于十五點短柄圓環(huán)探針熒光PCR原理分子信標是一種熒光標記的寡核苷酸鏈，一般含有25～35個核苷酸。在結構上，分子信標大體上可以分為三部分：（1）、環(huán)狀區(qū)：一般由15～30個核苷酸組成，可以與靶分子特異結合；（2）、莖干區(qū)：一般由5～8個堿基對組成，在分子信標與靶分子結合過程中可發(fā)生可逆性解離。（3）、熒光基團和淬滅基團：熒光基團一般連接在5ˊ端；淬滅基團一般連接在3ˊ端，常用4-（4-二甲基氨基偶氮苯基）苯甲酸（DABCYL）作為淬滅基團。根據(jù)Foerster理論，中心熒光能量轉移效率與兩者距離的6次方成反比。所以只有熒光基團與淬滅基團之間達到一定的距離時才會產(chǎn)生熒光。目前十三頁\總數(shù)二十八頁\編于十五點熒光標記熒光發(fā)光是通過激發(fā)光激發(fā)熒光基團到達高能量狀態(tài),而后產(chǎn)生發(fā)射光。常用的有綠色熒光蛋白(GFP)、紅色熒光蛋白DsRed、CY3、CY5、FAM及其它熒光報告基團目前十四頁\總數(shù)二十八頁\編于十五點探針熒光標記及熒光基團：如紅色熒光Cy3和綠色熒光Cy5標記探針淬滅基團常：用4-（4-二甲基氨基偶氮苯基）苯甲酸（DABCYL）目前十五頁\總數(shù)二十八頁\編于十五點影響分子信標的主要因素分子信標中，熒光基團和淬滅基團之間的距離是影響分子信標的最主要因素。根據(jù)Foerster理論，熒光基團與淬滅基團之間的距離直接影響熒光的強度。另外，溫度也是影響分子信標的一個重要因素。在較低溫度下，分子信標才可以保持發(fā)卡結構。在較高溫度下，分子信標將無法保持其發(fā)卡結構，甚至使其伸展為隨機線狀，造成熒光基團和淬滅基團分離，從而發(fā)出熒光，出現(xiàn)假陽性結果。有文獻表明，其熔鏈溫度取決于莖干區(qū)的長度、G-C含量和緩沖液的離子強度目前十六頁\總數(shù)二十八頁\編于十五點PCR反應特點特異性強靈敏度高

PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克(pg=10-12)量級的起始待測模板擴增到微克(ug=-6)水平。能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞；在病毒的檢測中，PCR的靈敏度可達3個RFU(空斑形成單位)；在細菌學中最小檢出率為3個細菌。簡便、快速

PCR反應用耐高溫的TaqDNA聚合酶，一次性地將反應液加好后，即在DNA擴增液和水浴鍋上進行變性-退火-延伸反應，一般在2～4小時完成擴增反應。擴增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性污染、易推廣。對標本的純度要求低

不需要分離病毒或細菌及培養(yǎng)細胞，DNA粗制品及RNA均可作為擴增模板?？芍苯佑门R床標本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細胞、活組織等DNA擴增檢測。

目前十七頁\總數(shù)二十八頁\編于十五點實時熒光PCR結果判讀目前十八頁\總數(shù)二十八頁\編于十五點熒光PCR試劑盒檢測結果目前十九頁\總數(shù)二十八頁\編于十五點目前二十頁\總數(shù)二十八頁\編于十五點目前二十一頁\總數(shù)二十八頁\編于十五點熒光域值（threshold）的設定PCR反應管的前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，熒光域值是PCR3-15個循環(huán)熒光信號標準差的10倍，即：threshold=10×sdcycle6-15.熒光域值設定在PCR擴增的指數(shù)期。目前二十二頁\總數(shù)二十八頁\編于十五點Ct值

在熒光定量PCR技術中，有一個很重要的概念—Ct值。C代表cycle，t代表threshold，Ct值的含義為每個反應管內熒光信號達到設定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關系，Ct值越小，起始拷貝數(shù)越多，反之亦然。利用已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標代表Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，就可從標準曲線上算出該樣品的起始拷貝數(shù)。目前二十三頁\總數(shù)二十八頁\編于十五點PCR診斷試劑生產(chǎn)管理要點1、應具有陽性血清（或陽性質粒）處理、分裝的隔離實驗室2、PCR試劑的生產(chǎn)區(qū)與檢定區(qū)應嚴格分開3、專用原材料

PCR引物的設計要合理、合適，引物的合成要有固定的地方和設備，純度能到達一定標準目前二十四頁\總數(shù)二十八頁\編于十五點熒光定量PCR試劑的質量檢查操作程序每次買來一批新試劑時，先觀察外包裝有無破損及有效期等，試劑運輸過程中有無冷凍保存，如有異常，及時與廠家聯(lián)系。內包裝：試劑是否漏液，真空包裝是否破損，試劑是否齊全以及是否有使用說明書等。試劑的靈敏度：取衛(wèi)生部臨檢中心購買的已知拷貝數(shù)的血清1份，并稀釋至10拷貝數(shù)，用新試劑檢測，計算出靈敏度。試劑的重復性：取從衛(wèi)生部臨床檢驗中心購買的已知拷貝數(shù)的血清1份，用新試劑稀釋平行檢測10次，計算出SD，CV%。CV%應在<30%。試劑的特異性：取臨床標本10份（包括：低拷貝、高拷貝、陰性、高黃疸的標本各2份），用新試劑檢測，用于考察試劑的特異性。目前二十五頁\總數(shù)二十八頁\編于十五點熒光定量PCR室內質控程序每天門診抽取病人血標本時，須先仔細認真核對化驗單和病人姓名是否符合。編完化驗單號后，在對血標本進行編號時要仔細核對化驗單的病人姓名與標本管上的姓名，不得有誤。每次試驗中，須同時測定1份陰性對照與一份質控品。首次制作質控圖時（新批號開始時），采用“即刻法”質控方法，具體步驟如下：將連續(xù)的質控測定值從小到大排列，即X1，X2，……XN計算均值(X)和標準差(S)按下述公式計算SI上限和SI下限SI上限=(X最大值-X均值)/2SI下限=(X均值-X最小值)/2目前二十六頁\總數(shù)二十八頁\編于十五點PCR定量為何要設內參照？

影響PCR定量的主要原因有1、反應效率的差異：可能為反應體系和PCR擴增儀的工作狀態(tài)所致。由于PCR產(chǎn)物增加按指數(shù)方式進行，所以擴增效率即使相差極小，也會極大改變產(chǎn)物的濃度。解決辦法就是設內對照，使參照基因在同一反應管內進行PCR擴增，起到校正作用，這樣，任何影響擴增效率