羊抗鼠醫(yī)科狂犬病病毒糖蛋白在釀酒酵母中的表達

NOV20,2009,36(11): ?2009byInstituteofMicrobiology,趙慧 1* 高洋 1 1 張寶 1*學摘要:利用釀酒酵母表達系統(tǒng)表達狂犬病糖蛋白G,可獲得大量無致病的抗原,為研究新型狂犬病提供條件。構建Tat-G融合,通過EcoRI和XbaI酶切位點克隆至pYes2表達載體中,醋酸鋰法轉化釀酒酵母,URA3篩選鑒定陽性克隆,20h后,提取蛋白,SDS和Westernblot分析鑒定融合蛋白。SDS結果顯示糖蛋白在釀酒酵母2種形式的蛋白,yGIyGII,66kD56kD,Westernblot56kD處有特異性條帶。結合前人的研究成果,初步判斷狂犬病糖蛋白的跨膜TD區(qū)和膜RV-G蛋白分子的正確折疊和免疫活性等有至關重要的影響,yGII蛋:狂犬病糖蛋白,Tat肽,釀酒酵ExpressionofRabies GlycoproteinGeneinSaccharomycescerevisiaeZHAOHui1,2 ZHENGWen-Ling1* GAOYang1 PENGYi-Fei1 ZHANGBao1 MAWen-Li1*(1.InstituteofGeneEngineer,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou,Guangdong (2.CollegeofNatureResourcesandEnvironment, AgriculturalUniversity,Guangzhou,Guangdong :Toobtainnon-pathogenicrabiesglycoprotein(RV-G),weexpressedRV-GinSaccaromycesCerevisiae(S.cerevisiae).Inourstudy,tat-GfusiongenewasclonedintotheexpressionvectorpYes2.0,whichallowsexpressionofaforeigngeneintheyeastcellsunderthecontrolofGAl1promoter.Transforma-tionwasperformedbyusinglithium-treatedyeastcellsandseveralUra+-tranformantswereisolated.Ac-cordingtotherelativemobilityinSDS,weknowprobablytwoforms(designatedasyGIandyGⅡ)ofRV-GoguesproducedinS.cerevisiae,theirmolecularweightswereestimatedas66kDand56kD,respectively.Ontheotherhand,therewasaspecificbandabout56kDshowninwesternblotresult.Com-biningprecursors’achievements,wewilldrawaconclusionthattrans-membrane (TD)andcyto- haveanegativeregulationonRV-GantigenimmunogenicityinS.cerevisiae.:Rabiesglycoprotein,Tatpeptide,Saccharomyces*通訊作者： :86- ::86- 2009,Vol.36,狂犬病是由狂犬病(Rabies,V)引起的共患傳染病,危害極其嚴重,發(fā)病后的致死率大于90%2008年1月世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計,全球范圍內(nèi)死于狂犬病的人數(shù)達55000余人,其中又以15的預防及治療方法主要采用注射狂犬病和狂犬病免疫球蛋白,應用最為普遍的是ro細胞,但該成本較高,不適合全球范圍內(nèi)推廣,尤其在一些國家仍沿用有較強副作用的組織[1]?？袢w屬于彈狀科(Rhabdoviridae)狂犬屬(Lyssa),核酸是單股負鏈RNA。 組長約12kb,從3′到5′端依次為編碼白N、磷蛋白P、基質(zhì)蛋白M、糖蛋白G和轉錄酶大蛋白L的5個,其中糖蛋白G(Rabiesglycoprotein,RV-G)在囊膜上構成刺突,與致病性相關,是狂犬病的主要抗原,可刺激機體誘生相應抗體和細胞免疫。目前,國內(nèi)外研究RV-G的表達多采用大腸桿菌和動植物細胞表達系統(tǒng),一是因為大腸桿菌表達系統(tǒng)表達量較高,占總蛋白的30%~40%左右,便于對RV-G的結構功能進行研究;其二,動植物細胞表達系統(tǒng)所表達的抗原具有一定的免疫原性,有一定的應用研究價值[24]。相比之下,應用釀酒酵母表達系統(tǒng)研究RV-G抗原比較少,釀酒酵母又稱面包酵母或出芽酵母,它作為真核蛋白表達系統(tǒng),具有以下特點[5]:釀酒酵母安全無毒,無致病性;有較清楚的遺傳背景容易進行遺傳操作;培養(yǎng)條件簡單,容易進行高密度發(fā)酵;有良好的蛋白分泌能力;有類似高等生物的蛋白質(zhì)翻譯后的修飾功能,避免高成本的蛋白復性后再純化的過程。用釀酒酵母表達的乙型肝炎、人胰島素和人粒細。本實驗采用了釀酒酵母表達系統(tǒng),通過深入研究發(fā)現(xiàn),RV-G不同于以往的表面抗原蛋白等,有一定的獨特性,該蛋白的不同功能區(qū)對RV-G的表達、免疫活性等有重要影響,基于本實驗的研究結果,如果能對RV-G進行適當改造,有望大大提高RV-G在釀酒酵母中的可溶性表達,那么釀酒酵母表達系統(tǒng)用于狂犬病的研究將具有更廣闊的前景。Tat蛋白是HIV-1的反式轉錄因子(Trans-avtivator),37~72TAT

PTD(Proteintransduction,PTD),其中序列為11個氨基酸即-YGRKKTTQRRR-。大量實驗證明該Tat肽段可攜帶與之融合表達的蛋白高效進入體外培養(yǎng)的細胞,或通過λ噬菌體展示于噬菌體表面,攜帶DNA,接種于小鼠,快速到達機體內(nèi)各組織,或聯(lián)合使用納米材料,包裹DNA和蛋白,增強納米載藥輸送系統(tǒng)的能力等[6]。本實驗擬將人工合成TatPTD序列單鏈,退火后形成雙鏈,通過BamHI與RV-G相連,構建為融合基因,其目的是增強后續(xù)動物實驗中RV-G蛋白的免實驗方法與狂犬病CVS-24標準毒株糖蛋白(質(zhì)粒pVax-G)由軍事醫(yī)學軍事獸醫(yī)研究員惠贈;釀酒酵母INVScI、酵母表達載體pYes2及大腸桿菌DH5α由本研究室保存;各種限制性內(nèi)切酶、T4連接酶、高保真DNA聚合酶及各類Marker購自大連寶生物工程公司;小鼠抗狂犬病病毒單克隆抗體(1C5)購自Abcam;羊抗鼠IgG購自狂犬病糖蛋白表達載體的構建及篩選:表達載體為pYes2,該載體以EcoRI和XbaI酶切,回收載體片段。采用PCR方法從質(zhì)粒pVax-G中擴增狂犬病糖蛋 上游引物 下劃線部分為BamHI酶切位點),下游引物為5-CTTACAGTCCGGTCTCACCCCCACTT-3,反應體積50μL,反應30個循環(huán):94C30s,55C1572C90s,該片段以BamH酶切回收純化備用。合成Tat單鏈,正義鏈G-3′,反義鏈3′-TACCGTCCTTCTTTGCATCTGTCGCTGCTTCTCCAAGACTACCTAG-5′(下劃線部分為BamHI酶切位點),退火成雙鏈,退火條件:94C5min,80C5min,75C5min,70C5min,65C10min,55C10min,0C10min,37C10min,25C10min。將該雙鏈與上述PCR純化片段16C連接過夜。采用PCR方法從連接產(chǎn)物中擴增獲得Tat- 融合,上游引物為5-GGTTATGGCAGGAAG-3(下劃線部分為EcoRI酶切位點),下游引物為5-GCTCTAGAGCTTACAGTCCGGTCTCACCC-3′(下劃線部分為XbaI酶切位點),30個循環(huán):94C30s,58C15s,72C90s,該PCR片段經(jīng)EcoRI和XbaI酶切回收后與pYes2載體連接構建為pYes2-tat-G質(zhì)粒載體。轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài),以氨芐抗性篩選pYes2-tat-G質(zhì)粒載體對釀酒酵母的轉化及鑒定:以常規(guī)的醋酸鋰法轉化。將所構建的pYes2-tat-G載體轉化于酵母INVSc1,以尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型(SC-U)培養(yǎng)基篩選,以常規(guī)的酵母質(zhì)粒提取方法提取陽性克隆的質(zhì)粒,PCR鑒定。Tat-G融合在釀酒酵母中的誘導表達及SDS電泳:將酵母陽性克隆轉接至15mL液體SC-U培養(yǎng)基(含2%葡萄糖)中,30C過夜培養(yǎng),測OD600=3,取6.67mL培養(yǎng)物于10mL離心管中,4C3000r/min離心5min,去上清,加1mL~2mLSC誘導培養(yǎng)基(含2%半乳糖)重懸菌體,并轉移至50mL誘導培養(yǎng)基中30C20h,OD600=5.36,取3mL離心去上清,加酸洗玻璃珠(Sigma)及蛋白提取液(50mmol/L磷酸鈉pH7.4,1μmol/LEDTA,5%甘油,0.1%PMSF)169μL,使菌體最終OD600=100,振蕩30s,冰上放置30s,重復10次,離心,取上清即完成蛋白提取。Westernblot分析:以10%分離膠進行SDS電泳,狂犬病的小鼠單克隆抗體(1C5)1:2500和辣根過氧化酶抗小鼠IgG1:5000進行Westernblot鑒定。結目的的PCR擴增、鑒定及克狂犬病糖蛋白G全長1575bp,去除信號肽序列57bp后大小為1518bp,Tat長51bp,與G連接后的融合Tat-G全長1569bp,結果見圖1。Tat-G融合經(jīng)EcoRI和XbaI酶切回收純化。pYes2載體經(jīng)EcoRI和XbaI酶切后,載體片段大小約為5800bp。pYes2-tat-G質(zhì)粒載體的pYes2與Tat-G融合連接轉化大腸桿菌以擴增Tat-G融合的引物進行PCR鑒定,

泳結果中出現(xiàn)1619bp的特異性條帶即為目的基因,對應的菌落即為陽性克隆,陽性克隆提取質(zhì)粒,以EcoRI和XbaI雙酶切進一步鑒定,排除假陽性可能,實驗結果見圖2。該克隆質(zhì)粒結果與pVax-G質(zhì)粒中目的序列一致。pYes2-tat-G質(zhì)粒轉化釀酒酵母,SC-培養(yǎng)基篩選出陽性克隆,提取該陽性酵母克隆質(zhì)粒,PCR擴增鑒定,結果見圖3,上述陽性克隆的質(zhì)粒轉化大腸桿菌,進一步PCR確證,實驗結果見圖4。圖 Tat-G融合的PCR結Fig. PCRproductsofTat-Gfusion注:1~4:tat-G融合的PCR產(chǎn)物;M:DL2000DNAmarker.Note:1~4:PCRproductsofTat-Gfusiongene;M:DL2000DNA圖2大腸桿菌轉化子的PCR鑒定及重組載體的酶切驗證Fig.2PCRresultofE.colitransformantandrestrictionenzymedigestionof binantsmid注:1~6:菌落PCR鑒定,其中2和5泳道對應的菌落為陽性克隆子;7:陽性克隆子的質(zhì)粒提取后的EcoRI和XbaI酶切鑒定圖譜;M:DL2000DNAmarker.Note:1~6:PCRresultofE.colitransformant,lane2andlane5arepositiveclones;7: binantsmiddigestedwithEcoRIandXbaI;M:DNAmarker.圖 重組酵母質(zhì)粒鑒Fig.3PCRresultofsmidfrom binantyeastclones注:1~7:酵母質(zhì)粒提取后的PCR鑒定,其中1、3、5對應的為陽性克隆,2、4、6為克隆.Note:1~7:PCRresultofsmidfrom binantyeastclones:1,3and5arepositiveclones;2,4and6arenegativeclones. 2009,Vol.36,圖 大腸桿菌菌落PCR鑒Fig. ysisofE.coli注:1、3、5為陽性克隆Note:TheresultofPCRshown1,3,5arepositive重組釀酒酵母經(jīng)半乳糖(2%)誘導20h后,提取蛋白質(zhì)進行SDS,設誘導前的釀酒酵母蛋白提取物為對照,實驗結果見圖5。圖 tat-G融合表達SDS電泳Fig.5SDSysisofexpressedtat-Gfusionpro-注:1:重組釀酒酵母誘導20h的蛋白圖譜;2:重組釀酒酵母誘導前的蛋白圖譜;M:蛋白分子量標準.Note:1: binanttransformantinducedwithgalactosefor20h; binanttransformantbeforeinductionwithgalactose;M:Proteinmarker.采用狂犬病糖蛋白小鼠單克隆抗體(1C5,Abcam)和羊抗鼠IgG-HRP進行Western印跡,鑒定分析融合蛋白Tat-G,其中1C5小鼠單克隆抗體可與狂犬病CVS毒株的糖蛋白G發(fā)生特異性反應。反應結果見圖6。討狂犬病糖蛋白是誘導機體產(chǎn)生中和性抗體的主要蛋白。該由1575bp組成,依據(jù)其功能分為:第1~57位核苷酸為信號肽編碼區(qū)Signal

6tat-GWesternblotFig.6Westernblotysisoftheexpressionproduct注:1~2:重組酵母誘導后蛋白的Westernblot結果,在約56kD處有特異性條帶;3:誘導前蛋白的Westernblot結果,在56kDNote:1~2:Specificbandsof binanttransformantinducedwithgalactoseareshownatabout56kD;3:Theresultsof binanttransformantbeforeinductioninWesternblot.sequence,SS),第58~1374位核苷酸為膜外編碼區(qū)(Ecto ),第1375~1440位核苷酸為跨膜編碼區(qū)(rans-membrane ,TD),第1441~1575位核苷酸為膜內(nèi)編碼區(qū)(Cytosmic ),其中關于TD區(qū)在蛋白折疊中的作用存在爭議。RathA等[7]就此問題重點研究了SS區(qū)和TD區(qū)對-GDNA疫苗免疫效果的影響。他們設計了4種表達結構,分別為rGVR(SS,TD)rGVRt(SS,+TD)rGVRs(+SS,TD)和rGVRst(+SS,+TD),同時外源上設計有人組織纖維蛋白溶酶原激活劑信號肽序列(+TASS),啟動子為CMV這4種DNA分別注射小鼠后發(fā)現(xiàn),rGVRtDNA能誘導的免疫反應最強,小鼠體內(nèi)產(chǎn)生的抗體滴度最高;其次為rGVRs,最小為rGVRst,這說明在動物細胞表達系統(tǒng)中,TD區(qū)在蛋白質(zhì)正確折疊中發(fā)揮重要的正向調(diào)節(jié)作用;相比而言由于rGVRst結構中存在過多的疏水結構(TASS、內(nèi)源性SS和TD),導致-G表達量大大降低,進而導致誘導產(chǎn)生的抗體滴度水平低下。基于上述原因,在本實驗設計中,我們采用了去除SS的rGVRt而保留TD區(qū),以降低內(nèi)源性因素對RV-G表達量的影響。 成狂犬病糖蛋白為505個氨基酸,理論蛋白質(zhì)分子量約67kD,但因不同的表達系統(tǒng)對外源蛋白有不同的糖基化過程,因而所表達的實際蛋白大小也有所不同,大致介于56kD~66kD,均小于理論值。并且大腸桿菌表達系統(tǒng)所表達的RV-G無糖基化,無法引起動物免疫反應[8],而酵母以及動植物細胞表達系統(tǒng)存在糖基化過程,所產(chǎn)生的抗原均可引起體內(nèi)免疫反應[8],同時又因糖基化程度不一,誘本實驗采用了釀酒酵母(Saccharomycescere-visiae)表達系統(tǒng)來研究RV-G的表達情況。從實驗結果圖5可見,在55kD~66kD區(qū)間,誘導前后的蛋白表達有兩條明顯差異帶,一條略大,約66kD,另一條略小,約56kD。Westernblot顯示在56kD處有特異性條帶出現(xiàn),該結果可能驗證了SakamotoS等的研究。SakamotoS等人[9]的研究發(fā)現(xiàn),RV-G在釀酒酵母中表達可能會產(chǎn)生兩種形式的抗原:一種是yGI蛋白,約66kD,為成熟蛋白的完整大小,占酵母總蛋白的1%,另一種yGⅡ,約56kD,占RV-G蛋白總量的1%,兩種蛋白經(jīng)C端水解后,yGI蛋白降低為56kD大小蛋白,yGⅡ相當,由此推測yG可能缺失TD區(qū)和膜內(nèi)編碼區(qū)(Cytosmic)。兩種抗原在免疫活性方面也存在區(qū)別:yGI,只能與多克隆抗體發(fā)生免疫反應,無法識別單克隆抗體,更無法誘導體內(nèi)免疫反應;yGⅡ不僅可被單克隆抗體識別,還可以誘導體內(nèi)的由此可見,本實驗研究中Westernblot結果可信,在56kD處的條帶極有可能為yGⅡ蛋白的特異性反應。但由于該抗原量低免疫活性弱因而我們在實驗過程中適當延長了X光片的時間,以致在56kD以外的區(qū)間出現(xiàn)了一些非特異條帶。另外,本實驗結果從另一角度證明了TD區(qū)和膜內(nèi)編碼區(qū)可能對釀酒酵母中RV-G的免疫活性和蛋白的折疊有負向調(diào)節(jié)作用,這與RathA等人[7]的研究結果相反。分析原因可能是因為在不同的表達系統(tǒng)中,G蛋白中

各自的功能區(qū)在該蛋白的糖基化、折疊等過程中發(fā)揮不同的作用,如在釀酒酵母中,TD區(qū)和膜內(nèi)編碼區(qū)可能就會影響yGI蛋白中抗原位點的,從而影響了它與單克隆抗體的結合。因此我們認為RV-G的表達結構不能一概而論,需要根據(jù)表達系統(tǒng)選擇相應的功能區(qū)結構,該實驗結果為進一步研究RV-G在釀酒酵母中的表達提供了研究基礎。ManningSE,RupprechtCE,FishbeinD,etal.Humanra-biespreventionUnitedStates,2008.MMWR mRep,2008,57(RR-3):128.YokomizoAY,JorgeSAC,AstrayRM,etal.RabiesglycoproteinexpressionindrosophilaS2cells.Functionalbinantproteininstableco-transfectedcellline.BiotechnologyJournal,2007,2(1):LiJ,FaberM,PapaneriA,etal.Asingleimmunizationwitha binantcanineadenoexpressingthera-biesGproteinconfersprotectiveimmunityagainstrabiesinmice.Virology,2006,356(1-2):147154.SaxenaS,SonwaneAA,DahiyaSS,etal.Inductionofimmuneresponsesandprotectio