siRNA干擾人核糖核酸酶抑制因子在HeLa細(xì)胞中的表達(dá)鑒定

siRNA攪亂人核糖核酸酶控制因子在HeLa細(xì)胞中的表達(dá)判斷IdentificationoftheeffectofsiRNAplasmidtargetedcombinationhRIexpressedinHeLacellLIKun1DINGNing1LILin21.DepartmentofClinicalLaboratoryMedicine，MedicalCollegeofDalianUniversity，LiaoningProvince，Dalian*，China；2.DepartmentofClinicalLaboratory，MaternalandChildCareServiceCentreofDalian，LiaoningProvince，Dalian*，China[Abstract]ObjectiveToidentifythesilencingeffectonhumanHeLacellsofasiRNAplasmidpKD-dsRItargetingthegeneofhumanribonucleaseinhibitor（hRI），whichiscapableofexpressioninmammaliancells.MethodsThevectorofpKD-dsRIwasco-transfectedintoHeLacellswiththereporterplasmidofpLNCX-EGFP-C1-hritransfectiongroup），usingthecellstransfectedwiththereporterplasmidofpLNCX-EGFP-C1-hri（controlgroup1），emptyplasmidofpKDtogetherwithpLNCX-EGFP-C1-hri（controlgroup2），andthoseuntransfected（notransfectiongroup）ascontrols.ThesilencingeffectwasdeterminedbyRT-PCR，andtheexpressionlevelofegfp-hriproteinwasdeterminedbyWesternblottingrespectively.ResultsThetranscriptionleveloftheegfp-hrifusiongeneincellsco-transfectedwithpKD-dsRIandreporterplasmiddecreasedby91%and85%，whiletheexpressionleveloftheegfp-hrifusiongenedecreasedby83%and81%，ascomparedwithcontrolgroup1andcontrolgroup2respectively（eachP0.05）.ConclusionTheplasmidofsiRNAtargetinghRIissuccessfullyconstructedandtheproteinofhRIcanbeinhibitedincytomatrixofHeLacellscorrectly.[Keywords]Humanribonucleaseinhibitor；siRNA；Identification惡性腫瘤素來(lái)是嚴(yán)重威迫人類健康的重要疾病之一。目前其臨床治療仍以傳統(tǒng)的手術(shù)、放、化療為主，擁有很多缺點(diǎn)，如術(shù)后易復(fù)發(fā)、患者難過(guò)大、生計(jì)質(zhì)量差、生計(jì)期短等。搜尋和發(fā)現(xiàn)治療腫瘤的新方法和新路子仍是現(xiàn)在醫(yī)學(xué)研究的熱門和難點(diǎn)。目前研究以為，實(shí)體瘤的生長(zhǎng)依賴于新血管生成，可以經(jīng)過(guò)控制腫瘤血管生成達(dá)到抗腫瘤作用，因此最近幾年來(lái)正成為腫瘤治療研究的熱門領(lǐng)域。核糖核酸酶控制因子（ribonucleaseInhibitor，RI）是廣泛存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞漿內(nèi)的酸性糖蛋白，能經(jīng)過(guò)與血管形成因子（Angiogenin，Ang）親密結(jié)合而控制其活性，進(jìn)而控制實(shí)體瘤血管的形成，進(jìn)而控制腫瘤的生長(zhǎng)。因而RI可能為擁有抗腫瘤血管活性的腫瘤控制基因，有望應(yīng)用于腫瘤的基因治療中。為了進(jìn)一步商議RI的抗腫瘤體系，筆者成立了針對(duì)人核糖核酸酶控制因子（hRI）基因的siRNA載體pKD-dsRI。為了考據(jù)該載體的攪亂收效，本實(shí)驗(yàn)用重組綠色熒光蛋白交融hRI的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLNCX-EGFP-C1-hri充當(dāng)報(bào)告基因，將siRNA載體pKD-dsRI與報(bào)告載體共轉(zhuǎn)染到人宮頸癌細(xì)胞HeLa中，考據(jù)siRNA表達(dá)載體的攪亂收效。資料與方法1.1資料人宮頸癌細(xì)胞HeLa由大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室（以下簡(jiǎn)稱“本室”）保存；含H1啟動(dòng)子的針對(duì)hRI的siRNA表達(dá)載體pKD-dsRI由本室成立（圖1）。圖1siRNA表達(dá)載體pKD-dsRI1.2試劑DL2000DNAMarker、質(zhì)粒提取試劑盒、DEPCH2O購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；梭華-SofastR基因轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自廈門太陽(yáng)馬生物工程有限公司；RPMI1640培育基、胰蛋白酶、Trizol購(gòu)于Gibco公司；胎牛血清購(gòu)自杭州四時(shí)青血清生物制品有限公司；PVDF（聚偏二氟乙烯）膜購(gòu)Biosciences；RT-PCRkit、ECL化學(xué)發(fā)光顯色試劑盒購(gòu)自Sigma公司；兔抗人核糖核酸酶控制因子抗體由本室制備；RIPA蛋白裂解液購(gòu)自KEYGEN生物；其余實(shí)驗(yàn)中所用的酚、氯仿、異丙醇等試劑均為解析純。1.3細(xì)胞培育與轉(zhuǎn)染人宮頸癌細(xì)胞HeLa細(xì)胞在含10%胎牛血清、雙抗（青霉素100μ/mL，鏈霉素100μg/mL）的RPMI1640培育基于5%的CO2、37℃、90%濕度條件下培育。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)久細(xì)胞按0.5×105～2.0×105/mL鋪板于24孔板中，至細(xì)胞達(dá)到80%匯片晌用梭華-SofastR轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染。分為四組：空白比較組（未轉(zhuǎn)染組）、pLNCX-EGFP-C1-hri轉(zhuǎn)染組（比較組1）、pKD+pLNCX-EGFP-C1-hri共轉(zhuǎn)染組（比較組2）、pKD-dsRI+pLNCX-EGFP-C1-hri共轉(zhuǎn)染組（攪亂組），每組3復(fù)孔。每組質(zhì)粒共用0.8μg、脂質(zhì)體2μL，共轉(zhuǎn)染組用pLNCX-EGFP-C1-hri0.2μg、pKD-dsRI0.6μg或pKD0.6μg。轉(zhuǎn)染后48～72h收獲細(xì)胞。1.4轉(zhuǎn)染細(xì)胞中RI基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)轉(zhuǎn)染24h后，收獲細(xì)胞。采納Trizol試劑提取各組細(xì)胞的總RNA。使用RT-PCR試劑盒依據(jù)兩步法進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。以總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。ri基因上游引物：5“-gacatccagtgtgaggagctgagcg-3“，下游引物：5"-ccagcctcattgatgtcgttgttgc-3"，擴(kuò)增產(chǎn)物約為527bp；用于檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果的pLNCX-EGFP-C1-hri質(zhì)粒引物是上游引物：5"-tgatgtcgttgttgctaaccgtgag-3"，下游引物：5"-actctcggcatggacgagctgtac-3"，上游引物位于載體pLNCX-EGFP-C1-hri的egfp基因閱讀框的No.697bp，下游引物位于載體pLNCX-EGFP-C1-hri的MCS的下游地址，擴(kuò)增產(chǎn)物為583bp；內(nèi)參β-actin的上游引物：5"-gctgtccctgtacgcctctg-3"，下游引物：5"-tgccgatggtgatgacctgg-3"，擴(kuò)增產(chǎn)物約為300bp。反應(yīng)條件為：94℃2min，94℃30s，55℃30s，72℃4min，循環(huán)25次，72℃4min。PCR產(chǎn)物由Bio-Rad凝膠成像儀攝入凝膠圖像，用ImageLabTM軟件對(duì)各個(gè)條帶測(cè)定其面積及灰度值。用目的蛋白條帶灰度值與β-actin條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度。攪亂率=相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度空載體組-相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度攪亂組/相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度空載體組。1.5Western-blotting法檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中RI蛋白表達(dá)水平1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采納SPSS11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)解析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采納單要素方差解析，組間兩兩比較采納LSD-t查驗(yàn)，以P0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果2.1RT-PCR檢測(cè)hri基因在轉(zhuǎn)錄后水平上的表達(dá)RT-PCR半定量解析顯示，未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的RT-PCR產(chǎn)物在527bp和300bp處可見(jiàn)RI基因和內(nèi)參β-actin基因條帶，RI基因相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度為（0.89±0.05）；比較組1和比較組2的RT-PCR產(chǎn)物在583bp和300bp處均可見(jiàn)egfi-hri基因和內(nèi)參基因條帶，egfi-hri基因相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度分別為（1.69±0.32）和（1.03±0.09）；攪亂組中egfi-hri基因相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度為（0.15±0.04），與比較組1和比較組2對(duì)照，分別降落了91%和85%，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。議論作為體內(nèi)重要的調(diào)治分子，hRI擁有多方面的功能[4-7]，這是由其特別氨基酸序列及結(jié)構(gòu)決定的，其一級(jí)結(jié)構(gòu)含有大批的亮氨酸和還原型半胱氨酸，空間結(jié)構(gòu)呈馬蹄形，由富含亮氨酸殘基重復(fù)區(qū)（leucin-richreapeat，LRR）的α/β螺旋折疊結(jié)構(gòu)多次重復(fù)組成[8-11]。目前研究發(fā)現(xiàn)在血小板糖蛋白Ib的α-亞基、人血清富含亮氨酸的α2-糖蛋白、酵母腺氨酸環(huán)化酶、果蠅的chaoptin和果蠅Toll蛋白等多種蛋白中廣泛存在LRR結(jié)構(gòu)域，且相關(guān)實(shí)考據(jù)明LRR結(jié)構(gòu)域與膜和蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)的互相作用相關(guān)。另一方面國(guó)內(nèi)外研究以為，RI在正常細(xì)胞內(nèi)，作為RNase控制劑（Ki=4.0×10-14mol/L），可以保護(hù)mRNA和rRNA，使蛋白質(zhì)合成旺盛；作為血管生長(zhǎng)因子控制劑Ki=7.1×10-16mol/L），RI可以控制腫瘤血管的形成[13-15，16-17]。其他，發(fā)現(xiàn)RI還擁有抗機(jī)體氧化損害的功能[18-19]。綜上所述，筆者以為RI具抗腫瘤作用，可能為腫瘤控制因子。為證明這一推論，筆者成立了針對(duì)dsRI介導(dǎo)hri基因的默然。該載體是在

hri的siRNA瞬時(shí)載體pKD-H1啟動(dòng)子（RNApolⅢ）的作用下，產(chǎn)生發(fā)夾樣RNA（shorthairpinRNA