深紅紅螺菌固氮酶調控機理驗證實驗設計及實踐

深紅紅螺菌固氮酶調控機理驗證實驗設計及實踐彭濤;關國華;姜偉;李穎;李季倫【摘要】從科學研究中汲取教學素材，根據實際情況優(yōu)化條件，設計出一項適合微生物生理學教學的新實驗，驗證了光照和銨對深紅紅螺菌固氮酶合成和活性的調控.實驗讓學生認識了紅螺菌代謝靈活性、營養(yǎng)及環(huán)境條件對其生長的影響，加深了解固氮酶的底物多樣性、固氮酶的氧敏感性和固氮酶的調控機理;實驗不僅有效激發(fā)了學生學習的興趣，培養(yǎng)了嚴謹、認真的科研作風，還提高了分析問題、解決問題的能力.實踐證明,科研成果轉化為教學實驗是提高教學水平、培養(yǎng)創(chuàng)新型人才的重要舉措.％Anexperimentalinstructionsuitableformicrobialphysiologyexperimentsfromscientificresearchisintroduced.Rhodospirillumrubrumisculturedandnitrogenaseactivityisassayedbygaschromatograph.Studentsnotonlymastersomeexperimentalskillsonanaerobicorlightcultivation,butalsostudygaschromatographtechniqueandnitrogenaseactivityassaybytheexperiment.Theexperimentishelpfulforstudentstounderstandtheprincipleofmicrobialmetabolicflexibility,themechanismofoxygensensitivityofnitrogenaseandthetheoryofregulationofnitrogensesynthesisandactivity.Thestudents'interestsinmicrobialphysiologyareincreased,andtheirindependentinnovationabilitiesareimproved.Practiceshowsthatresearchisanimportantwayforteaching.【期刊名稱】《實驗技術與管理》【年(卷)，期】2012(029)003【總頁數(shù)】4頁(P52-55)【關鍵詞】微生物生理學實驗;深紅紅螺菌涸氮酶調控;代謝靈活性【作者】彭濤;關國華;姜偉;李穎;李季倫【作者單位】中國農業(yè)大學生物學院，北京100193;中國農業(yè)大學生物學院，北京100193;中國農業(yè)大學生物學院，北京100193;中國農業(yè)大學生物學院，北京100193;中國農業(yè)大學生物學院，北京100193【正文語種】中文【中圖分類】Q93-3微生物生理學發(fā)展迅猛，理論課教材不斷增加新知識，使學生能更加全面透徹地了解微生物的生命活動規(guī)律［1］。實驗課能幫助學生深入理解理論知識，能幫助學生掌握微生物生理學研究的基本實驗技能，引導學生樹立正確的科學觀和嚴謹?shù)目茖W作風，培養(yǎng)學生獨立進行微生物生理學實驗的能力以及創(chuàng)新能力。實驗課內容的調整和改革對實驗教學水平的提高具有重要意義［2-3］。本研究室承擔過多項與深紅紅螺菌(Rhodospirillumrubrum)固氮相關的國家級研究課題，熟悉研究背景，并建立了相關的技術平臺［4-7］。為使學生深入認識固氮酶的氧敏感性、固氮酶催化底物的多樣性、固氮酶轉錄和翻譯后的調控機制，了解深紅紅螺菌代謝靈活性、營養(yǎng)及環(huán)境條件對其生長的影響，掌握微生物的光照培養(yǎng)法、厭氧瓶的使用方法、固氮酶的測定方法以及氣相色譜儀的使用方法，將紅螺菌研究技術中的部分內容轉化為本科教學實驗。實驗方案的設計經多次預試優(yōu)化后，在2010年秋季微生物生理學實驗課上，對生物學院理科基地42名四年級本科生進行了首次教學實踐。實驗進行順利，結果穩(wěn)定可靠，達到了預期的效果。深紅紅螺菌是紅螺菌屬的模式種，呈革蘭氏陰性、細胞呈弧形或螺旋形、有鞭毛、可運動、生活在陽光充足的靜水等處。在厭氧和光照條件下，深紅紅螺菌以多種有機碳化合物為碳源和供氫體，通過光合磷酸化產生能量，是光能異養(yǎng)型；也可在黑暗與有氧條件下，以有機物為碳源，通過氧化磷酸化產生ATP（三磷三腺苷），是化能異養(yǎng)型，具有代謝靈活性［8-9］。深紅紅螺菌可用于光合固氮、光合產氫的理論研究，以及有機廢水的凈化、光合細菌飼料蛋白、天然色素、新能源氫氣的開發(fā)研究［10］。生物固氮是在固氮酶催化下將N2的三鍵斷裂生成NH3的過程。固氮酶是對氧敏感的復合蛋白，一般由鉬鐵蛋白和鐵蛋白組成。鉬鐵蛋白又稱二氮酶或組分I,為a2&2四聚體，分別由nifD和nifK編碼，固氮酶活性中心位于鉬鐵蛋白中，催化N2還原成NH3；鐵蛋白又稱二氮酶還原酶或組分H,為Y2二聚體，由nifH編碼，是鉬鐵蛋白的直接電子供體。生物固氮的化學方程式可表示為面對生物固氮所需的巨大能耗，固氮菌進化出一套精密的固氮調控系統(tǒng)，能靈敏地應環(huán)境變化和菌體需求調節(jié)固氮酶的轉錄和活性。深紅紅螺菌固氮酶對環(huán)境的感應包括對銨、氧氣和能量水平的敏感（需要光照條件下表達固氮酶）。NifA蛋白是固氮酶基因nifHDK轉錄的激活蛋白。NifA的激活需要尿苷?；腜H蛋白。只有在限銨條件下，PH蛋白可以被尿苷酰化，固氮酶才能被轉錄，環(huán)境中極低濃度的銨就會抑制固氮酶的合成。銨不僅調控紅螺菌固氮酶的合成，還調控固氮酶的活性。在無銨和光照條件下，深紅紅螺菌的固氮酶有活性，而極低濃度的銨或黑暗環(huán)境會使固氮酶迅速失活。銨對固氮酶活性的這種調節(jié)方式被稱為銨關閉（ammoniaswitchoff），源于對鐵蛋白的核糖基化修飾，屬于翻譯后修飾。固氮酶除能催化N2還原成NH3外，還具有催化H+還原成H2的氫化酶活性。在缺少N2的環(huán)境中，固氮酶可將H+全部還原成H2釋放，即使在有N2的環(huán)境里，理論上固氮酶也只是用75%的電子去還原N2，而另外25%的電子用來產生H2。固氮酶還能催化多種雙鍵或三鍵底物的還原，其中把C2H2還原成C2H4（乙炔還原法）是分析固氮酶活性的一個快速有效的方法［11］。實驗菌株：深紅紅螺菌為野生型，本實驗室保存。SMN培養(yǎng)基（種子培養(yǎng)基）：每1000mL培養(yǎng)基含4.0gDL-蘋果酸、1.0g氯化銨、3.0g酵母粉、3.0g酪蛋白水解物、10mL硫酸鎂儲液、10mL氯化鈣儲液、10mLHEFN儲液。用NaOH調節(jié)到pH為6.8,121°C滅菌30min，再加入5mL單獨滅菌的磷酸緩沖液。MG培養(yǎng)基（脫阻遏培養(yǎng)基）：基本與SMN培養(yǎng)基相同，只是用1.33g谷氨酸鈉替代1.0g氯化銨、3.0g酵母粉和3.0g酪蛋白水解物。MN培養(yǎng)基（富銨培養(yǎng)基）：基本與MG培養(yǎng)基相同，只是用1.0g氯化銨替代1.33g谷氨酸鈉。HEFN儲液（100x）/1000mL：0.4gFe-citrate,2.0gEDTA-Na2,0.28gH3BO3,0.1gNa2MoO4。氯化鈣儲液（100x）/1000mL：10gCaCl2-2H2Oo硫酸鎂儲液（100x）/1000mL：25gMgSO4-7H2Oo磷酸緩沖液（200x）/300mL:54gK2HPO4,36gKH2PO4。SQ-204型氣相色譜儀，空氣浴搖床，水浴搖床，50mL厭氧瓶，10mL血清瓶，高純氬氣（99.99%），氣體減壓閥。將SMN平板上活化好的單菌落接種到5mL的SMN液體培養(yǎng)基中，30°C、100r/min振蕩培養(yǎng)24h；以4%的接種量接種到40mL的SMN培養(yǎng)基中，以相同的條件培養(yǎng)24h；同樣方法再轉接1次，第3次按4%接種量接種，種子的培養(yǎng)時間不超過15h。將種子接種到裝有50mLMG液體培養(yǎng)基的厭氧瓶中，在30~33C下光照培養(yǎng)。光照強度為2000-2500lx，由12個超反射燈泡提供。為避免培養(yǎng)過程中產生氣體使厭氧瓶破裂，灌培養(yǎng)基時在厭氧瓶頂部預留有1mL的空隙。把20mL注射器插進厭氧瓶橡膠塞，直到厭氧瓶上層空隙，以收集氣體。在持續(xù)光照條件下培養(yǎng)40h。記錄注射器中的氣體體積。分別測定培養(yǎng)液的A600(600nm波長下的吸光度)和固氮酶酶活。然后，將光照培養(yǎng)改為黑暗培養(yǎng)，其他與上述相同，以比較黑暗對固氮酶合成的影響。最后將MG培養(yǎng)基改為MN培養(yǎng)基，其他與上述相同，以比較銨鹽對固氮酶合成的影響。在水里將10mL血清瓶充滿水，蓋上反口膠塞，注意不要產生氣泡；拿出水面后，插入2根針頭，一根通高純氬氣，另一根排水；水排盡后，同時拔去2根針頭，如此制取無氧充氬的血清瓶。用注射器向10mL無氧充氬的血清瓶里加入1mL細胞培養(yǎng)液、0.9mL乙炔，30°C、120r/min水浴振蕩、光照反應20min(光照由2個50W白熾燈提供)。加入0.2mL的30%三氯乙酸終止反應。產物C2H4含量測定采用SQ-204型氣相色譜，F(xiàn)ID檢測器，GDX-502填充柱柱長1m。上樣量100pL,載氣為氮氣，柱溫70C,檢測器溫度120C。固氮酶酶活的計算：測定內容：(1)只是采用鋁箔紙包裹血清瓶的避光處理，其他與上述相同，比較黑暗對固氮酶酶活的影響。(2)在無氧充氬的血清瓶內先加入0.1mL的0.1mol/L的NH4CI,其他與上述相同，以比較銨鹽對固氮酶酶活的影響。(3)血清瓶不充氬氣，其他與上述相同，比較氧氣對固氮酶酶活的影響。深紅紅螺菌的活化用SMN培養(yǎng)基，黑暗、振蕩培養(yǎng)，菌體生長良好，無色素產生;產固氮酶的培養(yǎng)采用MG培養(yǎng)基，光照、厭氧培養(yǎng)，菌體產深紅色的色素。通過對這兩種培養(yǎng)方式的觀察，學生可分析出菌種活化的培養(yǎng)是在黑暗與有氧條件下化能異養(yǎng)生長；而產固氮酶的培養(yǎng)是在光照與厭氧條件下光能異養(yǎng)生長，從而體會紅螺菌代謝的靈活性。將活化好的菌種接到MG培養(yǎng)基，光照，厭氧培養(yǎng)40h后，注射器內收集到18~35mL氣體（21個實驗組），菌體呈紅色；A600為2.1~2.8（21個實驗組），檢測到固氮酶的酶活為165,2~312.5nmolC2H4-圖1中（a）:MG培養(yǎng)基培養(yǎng)10.5h,厭氧瓶中培養(yǎng)液的顏色呈淺粉色，有些注射器已收集到少量氣體；圖1中（b）MG培養(yǎng)基培養(yǎng)36h，厭氧瓶中培養(yǎng)液的顏色呈紅色，注射器收集到大量氣體。黑暗對固氮酶合成的影響實驗表明，培養(yǎng)40h，培養(yǎng)液的顏色仍無色透明，A600為0，未觀察到生長現(xiàn)象，注射器內收集的氣體為0。銨鹽對固氮酶合成的影響實驗表明，培養(yǎng)40h，菌體生長良好，顏色呈紅色，注射器內收集到的氣體體積為0。黑暗對固氮酶酶活的影響、銨鹽對固氮酶酶活的影響以及空氣對固氮酶酶活的影響實驗均未檢測到固氮酶的酶活。驗證了黑暗或銨鹽對深紅紅螺菌固氮酶酶活的抑制（銨關閉），體會了固氮酶對氧氣的敏感性。上述現(xiàn)象表明，采用MG培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)深紅紅螺菌，光照是菌體生長的必要條件。比較MG培養(yǎng)基和MN培養(yǎng)基的組成，可得出銨抑制固氮酶的合成，而谷氨酸鈉不抑制固氮酶的表達。分析MG培養(yǎng)基的成分，谷氨酸鈉是唯一氮源，而厭氧瓶里基本沒有氮氣，因此推出固氮酶的合成不需要底物氮氣的誘導。通過這些分析，加深了學生對固氮酶合成的調控機制的理解。圖1中的注射器中收集的氣體，學生發(fā)現(xiàn)它無色、無味，在空氣中燃燒后生成水，初步判斷是氫氣。它是怎樣產生的？純度如何？細心的學生還發(fā)現(xiàn)注射器內氣體的產生和固氮酶的合成相關聯(lián)，因此推測氣體的產生是固氮酶催化引起的。這一推測是否有充分的理論依據？怎樣驗證？通過哪些方法可提高清潔能源氫氣的產量呢？有的學生以此為微生物生理學課程報告的研究內容，查閱了大量的文獻，進行了詳細的分析。還有2位學生課后要求參與本研究室紅螺菌固氮和放氫的科研。本研究室在熟練掌握深紅紅螺菌固氮和放氫實驗技術的基礎上，根據微生物生理學教學的要求、教學時間的安排、實驗室的條件，設計并進行了預實驗。為不影響學生正常上課，3次活化種子的接種安排在上午10：00（課間操時間），第3次活化的種子經12h培養(yǎng)，晚上21:30左右接種到MG培養(yǎng)基或MN培養(yǎng)基中，培養(yǎng)40h，正好到下午的上課時間，利用4學時的實驗課完成固氮酶的反應和酶活測定。產固氮酶細胞的培養(yǎng)可用發(fā)酵罐、厭氧瓶或厭氧管。為了讓每個學生都能掌握厭氧瓶培養(yǎng)微生物的實驗技術，在光照空間有限、又要保證實驗效果的前提下，我們選用750mL的厭氧瓶?？蒲兄谐錃鍩o氧血清瓶一般是用換氣系統(tǒng)抽、沖氬氣數(shù)次制備的，但學生實驗室無換氣系統(tǒng)，為此可先在血清瓶中裝滿水，以水趕走空氣，再充入氬氣趕出水，也達到同樣效果。為使學生深入理解固氮酶合成的調控，設計了銨鹽對固氮酶合成的影響和黑暗對固氮酶合成的影響實驗。為加深對紅螺菌固氮酶酶活調控的認識，在固氮酶酶活測定中分別設計了黑暗、銨鹽和氧氣對固氮酶活性影響的實驗。在本科微生物生理學實驗中，代謝調控的內容一般選擇大腸桿菌B-半乳糖苷酶的誘導合成及其調控［12-13］。我們吸取科研素材，初步設計和實踐了深紅紅螺菌固氮酶調控機理的驗證實驗，為代謝調控實驗又增添了新的內容。實驗還涉及到新型能源氫氣的產生，因而把應用前景與理論知識有機地結合，激發(fā)了學生探索科學問題的興趣。由于固氮酶對氧氣敏感，實驗中產固氮酶的培養(yǎng)、測固氮酶活的反應都必須在無氧的條件下進行，因此注射器要先除掉空氣，血清瓶的膠塞要塞緊等。這些細節(jié)的操作有利于學生嚴謹、認真的實驗態(tài)度的養(yǎng)成。深紅紅螺菌是光合細菌，集不產氧光合作用和固氮作用于一身，有氧時又可化能異養(yǎng)生長。固氮過程中產生清潔的能源——氫氣；光照培養(yǎng)時，細胞內積累大量有保健作用的類胡蘿卜素。本實驗將理論、實驗和應用相結合，學生不僅學習到了微生物生理學的多項實驗技術，加深了對多個微生物生理學理論的理解，培養(yǎng)了嚴謹、認真的實驗態(tài)度，還提高了學習和操作興趣，是一次科研項目轉化教學內容的有益嘗試。致謝：作者衷心感謝朱瑞艷博士對本實驗設計所提供的幫助?！鞠嚓P文獻】[1]MoatAG,FosterJW,SpecterMP.微生物生理學[M].4版.李穎，文瑩，關國華,等譯.李季倫，宋大康，校.北京：高等教育出版社，2009:336-339.[2]徐暉.改革實驗教學提高微生物學實驗教學的質量[J].實驗室研究與探索，2009,28(10):136-137.[3]鄧百萬，陳文強，彭浩，等.基于能力培養(yǎng)的微生物實驗教學手段和方法的改革研究[J].實驗技術與管理，2011,28(2):7-10.[4]WangDi,ZhangYaoping,WelchEmily,etal.EliminationofRubiscoalterstheregulationofnitrogenaseactivityandincreaseshydrogenproductioninRhodospirillumrubrum[J].InternationalJournalofHydrogenEnergy,2010(35):7377-7385.[5]ZhuRuiyan,LiJilun.HydrogenmetabolicpathwaysofRhodospirillumrubrumunderartificialillumination[J].ChineseSciBull,2010,55(1):32-3