DB65T 3621-2014白斑狗魚嗜水氣單胞菌敗血癥病原診斷規(guī)范

白斑狗魚嗜水氣單胞菌敗血癥病原診斷規(guī)范2014-05-08發(fā)布2014-06-08實(shí)施新疆維吾爾自治區(qū)質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局I前言 I1范圍 2規(guī)范性引用文件 3術(shù)語和定義 14試劑和材料 15設(shè)備和器械 26白斑狗魚嗜水氣單胞菌敗血癥初診 27嗜水氣單胞菌的分離與培養(yǎng) 28嗜水氣單胞菌的鑒定 3916SrRNA基因DNA的序列測定和同源性分析試驗(yàn) 410結(jié)果判定 511綜合判定 6附錄A(規(guī)范性附錄)培養(yǎng)基和試劑配制方法 7附錄B(資料性附錄)16SrRNA基因DNA參考序列(GenBank登錄號(hào)：M59148.1) 本標(biāo)準(zhǔn)由新疆維吾爾自治區(qū)水產(chǎn)局歸口。12 16SrRNA基因DNA序列擴(kuò)增引物，P1:5'-GAGGAGGAAAGGTTGATGCC-3',P2:5'3中附錄A3規(guī)定的方法配制)。28℃培養(yǎng)24h～48h。7.2.3挑取7.2.2中黃色無黑心的菌落劃線接種于普通瓊脂培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)24h～48h;再挑取單菌落嗜水氣單胞菌在普通瓊脂培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)8.1.2細(xì)菌形態(tài)(革蘭氏染色法)合并均勻涂布。自然干燥，火焰固定。加草酸銨結(jié)晶紫染液染1min～2min,流水沖洗。加革蘭氏碘用1min～2min,流水沖洗。加95%酒精脫色30s,流水沖洗。加沙黃復(fù)紅染液染50s～60s,流水沖洗。干459.4.1按每0.1g瓊脂糖凝膠加0.1mL苯酚，將酚加入9.3.3含有目的條帶膠塊的離心管中。9.4.2經(jīng)漩渦混勻器振蕩1min～2min,將離心管在-70℃放置1h,使凝膠完全凍結(jié)。9.4.337℃水浴將凍結(jié)的凝膠融化后，在漩渦混勻器上振蕩1min～2min,12000r/min離心5min。9.4.4取上層水相轉(zhuǎn)入另一離心管中，加入等體積的苯酚：氯仿：異戊醇(25:24:1),混勻，12000r/min離心5min。9.4.5取上清液加入等體積的氯仿：異戊醇(24:1),混勻，12000r/min離心5min。9.4.6向收集的水溶液中加入1/10體積的3mol/L的乙酸鈉和2倍體積的無水乙醇，置-20℃過夜或9.5.測序及序列比對(duì)生化鑒定項(xiàng)目結(jié)果生化鑒定項(xiàng)目結(jié)果+++纖維二糖吲哚試驗(yàn)+阿拉伯糖++甲基紅(M.R)試驗(yàn)+水楊苷+十++明膠液化+++鳥氨酸脫羧試驗(yàn)++67A.1普通瓊脂培養(yǎng)基蒸餾水82.5g2.5g1000mL9將0.121gTris堿(分子量121.1),0.0372g乙二胺四乙酸二鈉(分子量372.24)加入80mL雙蒸水中，加濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至8.0,加雙蒸水定容至100mL,室溫保存。A.121%的瓊脂糖凝膠(含0.5μg/mLEB或相應(yīng)濃度的EB替代品)A.13苯酚：氯仿：異戊醇(25:24:1)將25體積的苯酚、24體積的氯仿和1體積的異戊醇混合即可，室溫貯存于不透光的A.14氯仿：異戊醇(24:1)