DB65T 4148-2018牛環(huán)形泰勒蟲病診斷技術(shù)規(guī)程

牛環(huán)形泰勒蟲病診斷技術(shù)規(guī)程DiagnosticmethodofregulationforBI本標(biāo)準(zhǔn)按GB/T1.1-2009《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分1本標(biāo)準(zhǔn)適用于養(yǎng)牛場(chǎng)(戶)、動(dòng)物診療機(jī)構(gòu)和動(dòng)物防疫防控機(jī)構(gòu)對(duì)牛環(huán)形泰勒蟲病的防控。配子體寄生于紅細(xì)胞，其形態(tài)為環(huán)形、戒指狀(70%~80%)、橢圓形、逗點(diǎn)狀、桿狀、十字形等；胞的胞漿內(nèi)或散在于細(xì)胞外，呈圓形、腎形或者橢圓形(詳見(jiàn)附錄C.3)。2達(dá)60%,其急性病例死亡率較高。穿刺可見(jiàn)柯赫氏藍(lán)體(石榴體),此期可延續(xù)2d～5d?！?45GGF.亞洲璃眼蜱腹面觀N.嗜駝璃眼蜱腹面觀C.小亞璃眼蜱肛板G.亞洲璃眼蜱肛板K.殘緣璃眼蜱肛板D.小亞璃眼蜱氣門板P.嗜駝璃眼蜱氣門板……結(jié)構(gòu)小亞璃眼蜱亞洲璃眼蜱H.asiaticumasiaticum殘緣璃眼蜱嗜駝璃眼蜱呈長(zhǎng)卵圓形，長(zhǎng)與寬約呈卵圓形，長(zhǎng)與寬約呈矩形，長(zhǎng)與寬約呈矩形，長(zhǎng)與寬約假頭內(nèi)凹較深連接處寬假頭基矩形基節(jié)I外距明顯長(zhǎng)于內(nèi)距外距與內(nèi)距約等長(zhǎng)，末端略向外呈彎外距較內(nèi)距約等長(zhǎng)，末端略向外彎外距比內(nèi)距長(zhǎng)，端部略向外彎肛側(cè)板中部較寬，前端尖窄，后緣較圓鈍，副小肛側(cè)板尖長(zhǎng)，內(nèi)緣凸角較寬，呈三角形尖突；副肛側(cè)板適中；肛下板較小，位于肛側(cè)板下方肛側(cè)板較寬短，內(nèi)緣凸角粗短；副肛側(cè)板末端寬斜；肛下板較短小，位于肛側(cè)板下方肛側(cè)板較短，內(nèi)緣凸角窄長(zhǎng)；肛下板大，比副肛側(cè)板寬似匙形，背突較寬而曲頸瓶形，背突窄而長(zhǎng)，末端達(dá)盾板邊緣端略上翹端達(dá)盾板邊緣頸溝前端深陷，而后漸淺，達(dá)盾板后側(cè)緣頸溝深而長(zhǎng)，相當(dāng)明顯，末端達(dá)盾板后側(cè)緣前端深陷，延伸至盾板后側(cè)緣寬而深，而后顯著變淺足明顯的淡色環(huán)帶細(xì)長(zhǎng)，以第3、4對(duì)略近無(wú)淡色關(guān)節(jié)附近具淡色環(huán)帶67(規(guī)范性附錄)牛體重估測(cè)法及媒介蜱的采集法C.1體重估測(cè)公式公式參見(jiàn)于：公式：[胸圍2(cm)x體斜長(zhǎng)(cm)J/10800=體重(kg)C.2布旗法(人工小時(shí)布旗法):用1m2大小的白絨布旗，在有媒介蜱地帶進(jìn)行定時(shí)拖蜱。操作時(shí)，手持旗桿伸向一側(cè)，使旗子平鋪于草叢上，以等速緩步向前行，每步行10m停下觀察一次，將附于旗上的蜱撿入采集瓶?jī)?nèi)。每面旗子整個(gè)過(guò)程共進(jìn)行1h。C.3媒介蜱種群組成(優(yōu)勢(shì)種群)(Dr)=(Ni/N)×100%(N為家畜體表寄生蜱總個(gè)體數(shù)，Ni為某種蜱的個(gè)體數(shù));C.4獸皮法：用屠宰動(dòng)物的新鮮皮(牛、羊等動(dòng)物皮，粘膜面朝上，被毛面朝下)代替布旗，在有媒介蜱地帶進(jìn)行定時(shí)拖蜱。拖皮行走每隔50m～100m檢查一次獸皮，收集其上黏貼的蜱蟲。8從疑似牛類動(dòng)物耳尖或尾根部無(wú)菌采血約10ml,分別加入到含有抗凝劑EDTA溶液的抗凝管(用于血液涂片和核酸提取)和不含抗凝劑的采血管內(nèi)(用于分離血清),-20℃保存待檢。在干燥后的血膜表面滴加一滴松柏油，將血膜放在100倍的顯微鏡下進(jìn)行觀察，9蓋，染色30min。在干燥后的涂抹片表面滴加一滴松柏油，將血膜放在100倍的顯微鏡下進(jìn)行觀察，當(dāng)鏡下發(fā)現(xiàn)與注：調(diào)節(jié)pH=9.6,ddH?O定容至100mL后，放于4℃冰箱保存5mL(調(diào)節(jié)pH后再加)注：調(diào)節(jié)pH=7.4,須高壓后加入Tween~20時(shí)須剪掉部分槍頭，ddH?O定容到1000mL。注：調(diào)節(jié)pH=7.4.定容至500mL。表F.4底物緩沖液(100mL)檸檬酸(0.1mol/L)注：調(diào)節(jié)pH=5.0,定容至100mL。H?SO4(濃2mol/L)培養(yǎng)1h。再經(jīng)酶標(biāo)儀檢測(cè)后，計(jì)算陰陽(yáng)性對(duì)照孔檢測(cè)值的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。將被檢(規(guī)范性附錄)cELISA操作方法G.1cELISA操作方法標(biāo)準(zhǔn)樣品稀釋方法見(jiàn)表G.1表G.1標(biāo)準(zhǔn)樣品的稀釋方法5號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品150μL的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入150μL標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液4號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品150μL的5號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入150μL標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液3號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品150μL的4號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入150μL標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品150μL的3號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入150μL標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液1號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品150μL的2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入150μL標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液G.1.2加樣：設(shè)空白孔(空白對(duì)照除不加樣品和酶標(biāo)試劑外，其余操作步驟均相同)、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔。將試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確加樣0.05mL于酶標(biāo)包被板上。將樣品稀釋液和待測(cè)樣品先后加入0.04mL和0.01mL于酶標(biāo)板上待檢樣品孔底(待檢樣品終稀釋度為5倍，避免與孔壁接觸),輕輕晃動(dòng)混G.1.3溫育：用封板膜封板后，37℃溫育30min;配液：蒸餾水30倍(48T的20倍)將30倍(48T的20倍)濃縮洗滌液進(jìn)行稀釋。G.1.4洗滌：揭掉酶標(biāo)板的封板膜，棄去液體，用手輕輕甩干，加洗滌液，室溫下靜置30s,棄去液體，重復(fù)上述步驟5次，最后一次拍干。G.1.5加酶：除空白孔外，其余每孔加0.05mL的酶標(biāo)試劑。G.1.7顯色和終止：先后加入顯色劑A和顯色劑B各0.05mL,輕輕震蕩混勻。37℃避光顯色10min;終止：每孔加終止液0.05mL,終止反應(yīng)。G.1.8讀板、測(cè)定：以空白孔調(diào)零。在加入終止液15分鐘內(nèi)依序于450nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔的吸光度(ODG.1.9計(jì)算：標(biāo)準(zhǔn)物濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的直線回歸方程式，將樣品OD值代入程式，計(jì)算出樣品的濃度，相乘稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。cELISA測(cè)試結(jié)果參見(jiàn)圖G.1、G.225μL反應(yīng)體系50μL反應(yīng)體系10×PCRbuffer(不含Mg2+)~362424上游引物F112下游引物R112~加ddH?O至~對(duì)照(健康組織DNA)和空白對(duì)照(無(wú)菌雙蒸水)。用1×TAE電泳緩沖液配制1.2%的瓊脂糖(含100μl/L熒光染料),在電泳槽中加入電泳緩沖檢查到目的條帶(電泳斑)作為診斷依據(jù)，詳見(jiàn)圖H.1。加樣量/Ml25μL反應(yīng)體系50μL反應(yīng)體系10×PCRbuffer(不含Mg2+)~5551上游引物F112下游引物R112加ddH?O至~空白對(duì)照(無(wú)菌雙蒸水)。沖液調(diào)PH至(6.5~6.8)后加水至1000mL。column中，6000g離心1min,小心棄去濾液；放置1min,6000g離心1min洗脫DNA。c)轉(zhuǎn)移上清至新的1.5mL離心管中，加入0.6倍4℃預(yù)冷于~20℃下靜置5min,12000r/min離心5min;烷-戊醇(24:1),混勻，12000NaCl(1.2molL)溶解沉淀，65℃溫育10min,加入350μL三氯甲f)取上清液，加入0.6倍4℃預(yù)冷的異丙醇，顛倒混勻后，于4℃放置30min,4℃下12000g)加入1mL經(jīng)4℃預(yù)冷的75%乙醇，傾斜離心管，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)數(shù)次，4℃下12000r/min離心5min,小心棄去上清；然后用4℃預(yù)冷的75%乙醇按相同的方法重復(fù)洗1次；將10mL1mol/LPK=8.0的Tris~HCL與2ml0.5mol/LPH=8.0的EDTA溶液加水定容至1L,(資料性附錄)說(shuō)明書1份A4紙一張(雙頁(yè))酶標(biāo)包被板12孔