蛋白質(zhì)定位方法

關(guān)于蛋白質(zhì)定位方法第1頁，課件共12頁，創(chuàng)作于2023年2月導(dǎo)言

真核細胞具有復(fù)雜的亞細胞結(jié)構(gòu)，已發(fā)現(xiàn)數(shù)十種細胞器，每種細胞器都有一組特定的蛋白。真核細胞除葉綠體，線粒體能少量合成蛋白外，絕大部分蛋白是在胞漿或粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成，最終運送到不同地點，形成成熟蛋白并行使功能。轉(zhuǎn)譯產(chǎn)物中很大一部分是以前體蛋白形式存在，往往有蛋白分子定位信號，可引導(dǎo)蛋白在胞內(nèi)定位。蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)的定位問題，是細胞生物學(xué)研究的中心問題，也是分子生物學(xué)研究的熱門話題。目前，這方面的工作己取得很人進展。細胞器不同，相應(yīng)的靶向蛋白的定位過程也不同。第2頁，課件共12頁，創(chuàng)作于2023年2月GFP及其在生命科學(xué)研究中的應(yīng)用

簡介GFP

海洋生物發(fā)光是個非常普遍的現(xiàn)象。從原生生物到脊椎動物均有生物發(fā)光，如海螢，磷蝦，腔腸動物等。從不同動物體內(nèi)提取的熒光蛋白的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)不盡相同，不同動物熒光發(fā)生機制有很大差別。多管水母體內(nèi)存在兩種發(fā)光蛋白綠色熒光蛋白:GFP和aequorin。當(dāng)aequorin與3個Ca2+結(jié)合后，即發(fā)生氧化反應(yīng)并發(fā)射藍光，最大發(fā)射波長469nm。GFP被紫外光或藍光激發(fā)后發(fā)出綠色熒光(Morise,H.，Shimomura,1974)。第3頁，課件共12頁，創(chuàng)作于2023年2月GFP在水母體內(nèi)的發(fā)光機制如下：第4頁，課件共12頁，創(chuàng)作于2023年2月

GFP熒光的產(chǎn)生主要歸功于分子內(nèi)第65,66,67位絲氨酸、酪氨酸、甘氨酸形成生色團的功效。翻譯出的蛋白折疊環(huán)化后，在O2存在下分子內(nèi)第67位甘氨酸的?；鶎Φ?5位絲氨酸的羧基的親核攻擊形成第5位碳原子咪唑基，第66位酪氨酸的a-β鍵脫氫反應(yīng)之后，導(dǎo)致芳香團與咪唑基結(jié)合。這樣GFP分子中形成對羥基苯甲酸咪唑環(huán)酮生色團，該過程可自動催化合成(HeimR,DouglasCP.,1994)

第5頁，課件共12頁，創(chuàng)作于2023年2月GFP晶體結(jié)構(gòu)(如圖)顯示：

蛋白中央是一個圓柱形水桶樣結(jié)構(gòu)，長420nm,寬240nm，由11個圍繞中心a螺旋的反平行β折疊組成，熒光基團的形成是從這個螺旋開始，桶的頂部由3個短的垂直片段覆蓋，底部由1個短的垂直片段覆蓋，生色團位于大空腔內(nèi)(CubittAB,1999)。第6頁，課件共12頁，創(chuàng)作于2023年2月

GFP在生命科學(xué)研究中的應(yīng)用

GFP雖能自發(fā)熒光，但野生型GFP熒光較弱。為了改善GFP熒光特性，對GFP進行了突變和重組實驗。Pang等獲得的GFP突變型比野生型亮度增強20倍;Tian等發(fā)現(xiàn)野生型GFP是低水平表達，而改良后的GFP表達量增加100倍。Cormack等獲得的三位點替代突變體的熒光強度比野生型高100倍，而且在自然光下就能觀察到綠色熒光，使得gfp作為報告基因更為靈敏和迅速。Confocal能有效消除同一焦平面上非檢測點的雜散熒光和非焦平面熒光的干擾，使分辨率提高，獲得清晰圖象，而且它具有逐層掃描功能，可對組織細胞進行無損傷的系列光學(xué)切片。Confocal的應(yīng)用更有利于GFP在生物學(xué)研究中的應(yīng)用。第7頁，課件共12頁，創(chuàng)作于2023年2月原理

應(yīng)用DNA亞克隆技術(shù)，將目的基因與GFP基因構(gòu)成融合基因，通過愈傷組織轉(zhuǎn)化法、基因槍、顯微注射、電激轉(zhuǎn)化等方法轉(zhuǎn)化合適的細胞，利用目的基因的基因表達調(diào)控機制，如啟動子和信號序列來控制融合基因的表達，在熒光顯微觀察系統(tǒng)下監(jiān)測融合蛋白在細胞內(nèi)的存在狀態(tài)。目的基因融合基因gfp轉(zhuǎn)化表達熒光顯微觀察第8頁，課件共12頁，創(chuàng)作于2023年2月

蛋白質(zhì)研究

將GFP作為熒光探針，與要研究的蛋白質(zhì)融合在一起，進行活細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的分布與變化研究。此方法在過去幾年中對細胞生物學(xué)的觀察有著顯著影響。水稻的CaM類蛋白OsCaM61，含有N一端CaM區(qū)域，C端有異戊二烯化位點。將OsCaM61與GFP融合起來，研究其亞細胞定位，發(fā)現(xiàn)GFP-OsCaM61融合蛋白是膜結(jié)合的，而OsCaM61-GFP卻主要在核質(zhì)。用mevinolin處理細胞，阻止類異戊二烯合成，引起GFP-OsCaM61運輸?shù)胶速|(zhì)。前者C端的異戊二烯化位點是活躍的而后者的位點被掩蓋。此蛋白的異戊二烯化狀態(tài)對于細胞定位起決定性作用。亞細胞定位依賴于蛋白的異戊二烯化狀態(tài)，表明在不同的生理條件下，這種類CaM可能通過結(jié)合到定位于不同細胞成分的靶子上，起到不同的功能作用(AiwaDongeta1.,2002)第9頁，課件共12頁，創(chuàng)作于2023年2月

A、B:僅轉(zhuǎn)入GFPC、D:轉(zhuǎn)入PF40-GFP融合蛋白第10頁，課件共12頁，創(chuàng)作于2023年2月

用GFP還可以用于基因沉默、啟動子活性、細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細胞局部區(qū)域的pH、內(nèi)生菌和植物相互作用研究等。GFP在動物學(xué)研究方面的應(yīng)用也非常廣泛(比如用于研究腫瘤發(fā)生機制、轉(zhuǎn)移機制、基因治療等)。

gfp用作報告基因有眾多優(yōu)點：1靈敏度高，易檢測并且是活體檢測，對細胞組織不具破壞性。而當(dāng)選用gus作報告基因時，在組織學(xué)檢測時，一定程度上具有破壞性。因為要對材料進行固定，保溫和脫色，并且植物中存在GUS本底，影響檢測的準(zhǔn)確性；2在活體內(nèi)表達不受生物類型、基因型、細胞和組織類型的限制；3不需任何底物和外源輔因子參與；4便于早期篩選轉(zhuǎn)基因材料。

GFP在生物學(xué)研究中應(yīng)用廣泛，有很大優(yōu)越性，但也存在一定的問題。GFP的